Autonomamente bioluminescenti cellule di mammifero per la continua e monitoraggio in tempo reale di citotossicità
28 ottobre 2013
Cellule di mammifero che esprimono la cassetta genica bioluminescenza batterica ( Lux) Produrre luce autonomamente. I conseguenti dinamiche bioluminescenti su di esposizione chimica è stata dimostrata in modo da riflettere gli effetti del trattamento sulla crescita cellulare e il metabolismo, rendendo queste cellule un poco costoso, continua, in tempo reale strumento di screening di tossicità che può essere facilmente adattato per l'automazione ad alta velocità.
L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare cellule umane autoluminescenti per un monitoraggio continuo e in tempo reale della citotossicità. Questo risultato si ottiene innanzitutto ottenendo un numero sufficiente di cellule autoluminescenti in crescita attiva. Nel secondo passaggio, numeri uguali di cellule vengono seminati in singoli pozzetti di una piastra multipozzetto.
Successivamente, le cellule vengono trattate con un composto di interesse a una serie di concentrazioni. Nell'ultima fase, il segnale bioluminescente viene misurato utilizzando uno strumento compatibile. Infine, la dinamica dell'emissione bioluminescente può essere utilizzata per dimostrare l'effetto del composto in esame sull'attività metabolica delle cellule.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come quelli che utilizzano la luciferasi isolata da insetti o da specie marine, è che non è richiesta la distruzione del campione né l'aggiunta di substrati per produrre un segnale rilevabile. A dimostrare la procedura sarà James Webb, uno studente universitario di un laboratorio. Dopo aver coltivato le cellule bioluminescenti di interesse fino a raggiungere una confluenza dell'80% nel mezzo di coltura appropriato, lavare la coltura cellulare in PBS con movimenti delicati di rotazione; quindi aggiungere la tripsina e incubare le cellule a 37 gradi Celsius finché non si staccano dalla fiasca. Successivamente, raccogliere le cellule risospese in PBS, trasferirle in un tubo da centrifuga pulito e determinare il numero di cellule dopo il conteggio; centrifugare quindi la sospensione cellulare per cinque minuti a 300 G a temperatura ambiente e risospendere.
Sospendere il pellet in un mezzo preriscaldato fresco, quindi seminare un uguale numero di cellule in pozzetti singoli di una piastra multi-pozzetto opaca, aggiungendo un volume uguale di mezzo senza cellule in un insieme di pozzetti triplicati come controllo negativo. Lasciare poi tre pozzetti di cellule non trattati come controlli, aggiungendo il composto sperimentale di interesse direttamente alle cellule alle appropriate concentrazioni sperimentali in triplicato. Immediatamente dopo il trattamento sperimentale, posizionare la piastra nella camera di imaging dello strumento appropriato per l'acquisizione delle immagini e la misurazione della bioluminescenza.
Quindi impostare il tempo di integrazione appropriato per ogni lettura e misurare la bioluminescenza ogni 15 minuti per un periodo di 24 ore. Infine, utilizzare un software compatibile adeguato per identificare una regione di interesse in ciascun pozzetto. Per quantificare l'intensità bioluminescente di ogni campione sperimentale, visualizzare l'emissione luminosa in fotoni al secondo per illustrare il flusso totale oppure in fotoni al secondo per centimetro quadrato per Ceridian, per dimostrare la radianza media di ciascun campione.
In questo studio, la dinamica di cellule HEC 2 9 3 autoluminescenti è stata monitorata continuamente per un periodo di 24 ore in risposta all'esposizione a un antibiotico. Gli effetti tossici di questo antibiotico, appartenente alla famiglia delle Blio Micine, note per uccidere le cellule viventi legandosi a due e scindendo il DNA, sono stati dimostrati mediante una riduzione della produzione di bioluminescenza rispetto alle cellule non trattate, fenomeno direttamente visualizzabile attraverso immagini in pseudocolore. Come mostrato qui, la natura bioluminescente delle cellule HEC 2 9 3 consente lo screening parallelo ripetuto di campioni in diverse condizioni di trattamento, permettendo il confronto di diverse concentrazioni sperimentali in qualsiasi punto temporale per un'analisi dose-risposta semplice.
Ad esempio, in questo grafico, la bioluminescenza prodotta dalle cellule dopo 15, 18 o 20 ore di trattamento è stata riportata in funzione delle concentrazioni del composto sperimentale aggiunto, dimostrando che l'aumento del trattamento antibiotico determina una riduzione della produzione bioluminescente da parte delle cellule in maniera dose-dipendente. La tecnica presentata in questo video è adatta per monitorare effetti tossici acuti, ma può essere adattata per valutare tossicità ad azione lenta o a lungo termine, effettuando ripetute acquisizioni delle immagini delle cellule a intervalli di tempo crescenti, mantenendo nel frattempo la coltura in condizioni standard di incubazione tra una lettura e l'altra.
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Panoramica
Questo studio illustra l'uso di cellule umane bioluminescenti per il monitoraggio continuo e in tempo reale della citotossicità. Misurando il segnale bioluminescente, i ricercatori possono valutare l'attività metabolica delle cellule in risposta a diversi composti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Bioluminescenza
- Screening della tossicità
Sfondo
- Le cellule di mammifero possono esprimere geni della bioluminescenza batterica.
- Queste cellule producono luce in modo autonomo, riflettendo il loro stato metabolico.
- Il monitoraggio in tempo reale offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali.
- L'automazione ad alto rendimento è realizzabile con questo approccio.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per il monitoraggio in tempo reale della citotossicità.
- Utilizzare l'emissione di bioluminescenza come indicatore dello stato di salute cellulare.
- Facilitare lo screening ad alto rendimento di composti.
Metodi Utilizzati
- Ottenere cellule umane bioluminescenti in fase di crescita attiva.
- Sezionare un numero uguale di cellule in piastre multipozzetto.
- Trattare le cellule con composti a concentrazioni variabili.
- Misurare i segnali bioluminescenti utilizzando strumenti compatibili.
Risultati principali
- La dinamica bioluminescente si correla con gli effetti del trattamento.
- La crescita cellulare e il metabolismo possono essere monitorati in tempo reale.
- Questo metodo è economico e adattabile all'automazione.
- I risultati dimostrano il potenziale per applicazioni ad alto rendimento.
Conclusioni
- Le cellule umane bioluminescenti sono efficaci per lo screening della tossicità.
- Il metodo consente un monitoraggio continuo delle risposte cellulari.
- Offre uno strumento promettente per i ricercatori in tossicologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Le cellule mammifere autonomamente bioluminescenti consentono un monitoraggio continuo e non distruttivo della citotossicità, affrontando l'elevato costo e il carico temporale degli assay distruttivi tradizionali. Questo approccio supporta letture metaboliche in tempo reale che migliorano l'affidabilità predittiva nella validazione precoce del target e nell'identificazione dei composti promettenti, collegando l'esposizione al composto alle dinamiche della salute cellulare. La compatibilità del metodo con l'infrastruttura di imaging esistente e il suo potenziale di automazione ne migliorano la scalabilità per flussi di lavoro di ricerca e sviluppo aziendali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso la correlazione in tempo reale tra l'emissione di bioluminescenza e il metabolismo cellulare e la crescita.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio fornendo un segnale biosentinella che riflette effetti avversi sulla vitalità cellulare senza distruggere il campione.
- Valore predittivo: Facilita l'analisi dose-risposta e la riduzione dei rischi meccanicistici consentendo misurazioni ripetute a diverse concentrazioni e punti temporali.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo linee cellulari autonome produttrici di luce.
- Riproducibilità: Garantisce risultati quantitativi costanti mediante semina normalizzata e condizioni ambientali controllate.
- Scalabilità: Consente l'elaborazione parallela di campioni in piastre multipozzetto utilizzando apparecchiature di imaging standard, supportando la valutazione ad alto rendimento di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Mantiene un monitoraggio rilevante per la malattia dalla fase di scoperta a quella preclinica, tracciando l'adattamento metabolico all'esposizione a sostanze tossiche.
- Decisioni Basate sul Rischio: Supporta i criteri di avanzamento collegando la dinamica della bioluminescenza a soglie di salute cellulare osservate nelle curve dose-risposta.
- Allineamento dei Biomarcatori: Utilizza l'emissione luminosa come biomarcatore funzionale dello stato metabolico, permettendo una correlazione con gli esiti fenotipici nei modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta che va dalla biologia iniziale all'identificazione del composto guida, in cui il monitoraggio in tempo reale della citotossicità orienta la prioritizzazione dei composti prima dell'investimento preclinico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando le variazioni del segnale bioluminescente a perturbazioni metaboliche indotte da composti.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante misurazioni riproducibili del segnale nel tempo, consentendo confronti affidabili tra diverse condizioni di trattamento.
- Analisi: Fornisce letture quantitative del flusso e della radianza che permettono ai gruppi di lavoro di valutare la cinetica della citotossicità e la potenza.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica mantenendo vive le cellule per un monitoraggio longitudinale, riflettendo risposte metaboliche simili a quelle in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di biosensori riutilizzabile, adattabile a diversi bersagli e classi di composti in vari progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante un monitoraggio metabolico continuo e senza etichette.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità eliminando i passaggi di aggiunta di reagenti e di distruzione dei campioni.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale permettendo il riutilizzo dei campioni e riducendo i costi dei materiali di consumo negli screening di citotossicità.
- Impatto sul portafoglio: Informa la priorizzazione corretta per il rischio fornendo precocemente dati sulle criticità metaboliche che supportano decisioni di proseguimento o interruzione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare di mammiferi e nella trasfezione stabile per mantenere linee cellulari esprimenti lux.
- È vincolato all'accesso a strumentazione per immagini a bassa luminosità in grado di rilevare la bioluminescenza mediante conteggio di fotoni.
- Necessita della standardizzazione della densità di semina, delle condizioni di incubazione e degli intervalli di misurazione tra diversi gruppi di lavoro.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende a linee cellulari primarie o non umane con efficienza di trasfezione variabile.
- È limitato dalla dipendenza metabolica del segnale, che potrebbe non rilevare meccanismi citotossici non metabolici.
