Name: Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 43 s
Description: Scopri la visualizzazione dei sottodomini del reticolo endoplasmatico in cellule in coltura mediante imaging confocale e microscopia elettronica. Questo metodo rivela la mobilità delle proteine fluorescenti e l'architettura subcellulare.

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Gli autori sono grati alla Fondazione Filarete per il suo aiuto e il sostegno nella pubblicazione di questo articolo. Vorremmo anche ringraziare Centro Europeo di Nanomedicina per l&#39;uso del microscopio elettronico a trasmissione Tecnai G2.

1. Plasmide, coltura cellulare, e Transfezione con ER proteine ​​fluorescenti <ol><li> Il plasmide utilizzato in questo studio consiste di una versione migliorata del GFP fusa al suo C-terminale della regione di coda della isoforma di ER ratto citocromo b (5) (abbreviato qui come b (5)) tramite una sequenza linker. La regione coda contiene l&#39;intera sequenza (Pro94-Asp134) che rimane membrana associato dopo la scissione di tripsina nativo b (5), compreso il TMD 17 residui (dominio transmembrana), fiancheggiata da sequenze polari a monte ea valle (UPS e DPS) . Il linker consiste nella epitopo myc seguito da [(Gly) 4 Ser] 3, e l&#39;intero cDNA viene inserito nei siti Hind3-Xba1 del vettore di espressione di mammifero pCDNA3. I dettagli della costruzione di questo plasmide sono stati descritti in una precedente pubblicazione in cui è indicato come GFP-ER 16. </li><li> Grow COS-7 cellule di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% fetasiero bovino l, 2 mM L-glutammina, 1% di penicillina / streptomicina in un incubatore a 37 ° C e 10% di CO 2. </li><li> Trasfezione. Piastra 3 x 10 5 cellule su un vetrino di vetro rotondo in una piastra da 6 pozzetti e, il giorno seguente, trasfezione con il sistema JetPEI come descritto dal produttore. Si noti che il rapporto ottimale JetPEI / DNA è stato testato per stabilire la massima efficienza di trasfezione seconda del plasmide e linea cellulare utilizzata: nel nostro caso, un JetPEI: DNA rapporto di 2:1 conduce al 70-80% efficienza di trasfezione. </li></ol> 2. Diretta a fluorescenza Microscopia confocale a scansione <ol><li> Live-cell imaging. Mettere il vetrino in cui le cellule transfettate sono state seminate in una camera di coltura cellulare in acciaio per 24 millimetri coprioggetto riempiti con DMEM w / o rosso fenolo, supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1% pen / strep, 25 HEPES mM , 50 pg / ml cicloeximide e 1:100 OxyFluor per prevenire i campioni da photobleaching. Un microscop SP5 confocalee dotato di CO 2 incubatore a temperatura controllata (37 ° C e 5% CO 2) è utilizzato per esperimenti di imaging cellulare dal vivo, con d GFP-ER essere visualizzata utilizzando un laser 488 nm ed un filtro 525/50 emissione passa banda. </li><li> Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP). Prelievo di una regione di interesse (ROI), corrispondente ad una struttura OSER, e decolorazione con 20 iterazioni e una combinazione di 488 nm (100% di un laser 30 mW Argon, corrispondente a 5,5-6 μW al campione) e 405 nm (60% di 30 mW diodo laser 405, corrispondente a 11,6 μW al campione) laser che, nella nostra esperienza, porta a fotoscolorimento efficiente e rapido. </li><li> Registrare il recupero della fluorescenza nei ROI sbiancate prendendo un singolo fotogramma ogni 10 secondi per 10 minuti (tempo di pixel = 1.61 msec / px). </li><li> Perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP). Disegnare un ROI corrispondente ad una struttura OSER, e candeggina come descritto sopra. Lo sbiancamento si ripete ogni 30 sec,e le immagini post-sbiancanti vengono registrati ogni 10 secondi per 30 minuti (tempo di pixel = 1.61 msec / px). </li><li> FRAP e FLIP analisi. Tutte le immagini sono analizzate utilizzando il software ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> ). Negli esperimenti FRAP, il recupero di fluorescenza della ROI sbiancato è misurata nel tempo e normalizzati alla fluorescenza totale di cellule sbiancato, che è sempre verificata sia costante nel tempo. </li><li> Per gli esperimenti FLIP, disegnare un ROI al di fuori della OSER sbiancato e che coprono tutta la cella. Misurare l&#39;intensità di fluorescenza nel tempo e normalizzare i livelli di fluorescenza di una ROI tratti su una cella greggi per correggere in caso di riduzione della fluorescenza causata dalla rappresentazione stessa. </li><li> In tutti gli esperimenti, sottratto il segnale di fondo (determinato in una zona diversa da cellule) dalle intensità di fluorescenza delle ROI. Infine, tracciare i risultati utilizzando Grsoftware aphPad Prism. </li></ol> 3. Ultrastrutturali analisi mediante microscopia elettronica a trasmissione Data la tossicità di molti dei reagenti, tutte le procedure devono essere effettuate indossando un laboratorio appropriato. cappotto e guanti sotto una cappa aspirante. <ol><li> Dopo aver rimosso il vetrino dalla piastra di Petri, fissare le restanti cellule cresciute sul fondo del piatto come un monostrato utilizzando filtrata 2% glutaraldeide in 0,1 M tampone cacodilato, pH 7,4, per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Raschiare le cellule utilizzando un raschietto Teflon e trasferirli in provette da 1,5 ml Eppendorf. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 9000 g per 10 min. Rimuovere il surnatante, aggiungere fissativo fresco, e lasciare per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare il pellet con il tampone, poi post-fissare con una soluzione di 1% tetrossido di osmio in tampone cacodilato per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare con acqua MilliQ, e bagno macchia blocco con1% acetato di uranile in acqua distillata per tra 20-60 min. </li><li> Disidratare i campioni ascendente serie di etanolo (70%, 80%, 90%, 100% e 100% per 10 min ciascuno), e lavare rapidamente due volte in ossido di propilene (15 min ciascuna). </li><li> Infiltrati i campioni in una miscela di ossido di propilene + Epon (1:1) (da 2 ore a tutta la notte). </li><li> Incorpora in resina epossidica Epon indurito a 60 ° C per almeno 24 ore. </li><li> Sezione blocchi resina tagliati manualmente utilizzando un ultramicrotomo LEICA UC6 dotato di una lama di diamante 45 ° per ottenere sezioni dello spessore di 60-70 nm. Raccogliere le sezioni su 300 griglie di rame maglia. </li><li> Macchiare le sezioni sulla griglia di partenza con una soluzione satura di acetato di uranile (20 min) e citrato di piombo (7 min), lavare accuratamente le griglie immergendole in acqua filtrata bi-distillata e lasciare asciugare a temperatura ambiente. </li><li> Le griglie colorate vengono osservate con un microscopio elettronico a trasmissione Tecnai G2, e le immagini sono state acquisite utilizzando una bottcamera CCD om-montato in diversi ingrandimenti finali (in genere vanno da 6,000-39,000 X). </li></ol>

<ol><li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li>
<li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+architecture%3A+structures+in+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li>
<li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li>
<li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li>
<li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+membranes%3A+a+legend+beyond+the+Flatland%2A+of+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li>
<li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+ER%3A+experimental+approaches+and+current+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li>
<li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li>
<li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li>
<li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li>
<li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li>
<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+faces+of+protein+misfolding%3A+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li>
<li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I protocolli e approcci di imaging descritti in questo documento sono stati utilizzati per studiare la distribuzione e la mobilità delle proteine ​​fluorescenti TA trasfettate residenti nel ER di cellule viventi. Abbiamo anche analizzato l&#39;effetto dell&#39;espressione eccessiva di queste proteine ​​sull&#39;architettura di questo compartimento subcellulare mediante analisi ultrastrutturali. La combinazione di live-cell imaging confocale e microscopia elettronica rappresenta è un potente ...

La scoperta della proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti spettrali, e lo sviluppo parallelo di microscopia a fluorescenza, hanno aperto completamente nuove strade per lo studio del comportamento delle proteine ​​nelle cellule. Tecniche come recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) e perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP), che sono possibili per la capacità intrinseca di fluorofori per estinguere la loro fluorescenza sotto illuminazione intensa, si basano su confocale live-cell imaging e l&#39;uso di trasfettati proteine ​​di fusione fluorescenti 1-3. Essi sono ampiamente utilizzati per valutare non solo la localizzazione delle proteine, ma anche la loro mobilità e del trasporto vescicolare, che può rivelare indizi importanti riguardanti la loro funzione 4. La caratteristica unica di cellule eucariotiche è la presenza di compartimenti intracellulari con specifici composizioni lipidiche e proteiche. Anche se organelli sono fisicamente isolatEd, hanno bisogno di comunicare tra loro e condividere componenti molecolari al fine di mantenere l&#39;omeostasi cellulare. La via secretoria garantisce che le proteine ​​e lipidi sintetizzati in ER raggiungere la destinazione finale corretto in cui esercitano la loro funzione. Organelli intracellulari possono anche essere collegati da siti di contatto dinamici che permettono molecole (lipidi) da scambiare direttamente tra compartimenti. Inoltre, molte proteine ​​devono assemblati in grandi complessi eteromerici o associati a determinate specie di lipidi (zattere lipidiche / microdomini) per diventare funzionalmente attivo o ad essere trasportati alla loro destinazione finale. Tutti questi aspetti biologici influenzare fortemente le proprietà cinetiche di proteine, e possono quindi essere opportunamente studiato mediante tecniche di seguito descritte. Il nostro gruppo ha ampiamente utilizzato FRAP e FLIP combinato con microscopia elettronica per studiare l&#39;architettura del ER e la sua diversa subdomini. La ER è la prima stazione della via secretoria e svolge un ruolo chiave nel proteine ​​e lipidi ordinamento 5. Si tratta di un organello altamente dinamica la cui sottodomini distinti riflettere le sue diverse funzioni (ad esempio proteine ​​e lipidi biosintesi e il traffico, proteine ​​pieghevoli, Ca 2 + stoccaggio e il rilascio, e il metabolismo xenobiotici). Tuttavia, anche se sono morfologicamente, spazialmente e funzionalmente distinte, questi domini sono continue tra loro, e la loro numerosità possono essere cambiate in cellule in condizioni fisiologiche e patologiche. Il più conosciuto e domini di solito spazialmente separate della ER sono la membrana nucleare, e la ER liscio e ruvido, tuttavia, noi ed altri abbiamo dimostrato che non ci sono strutture ER con un&#39;architettura più elaborata e l&#39;organizzazione tridimensionale in vari tipi di cellule e tessuti in condizioni fisiologiche che può anche essere indotta mediante stimoli stressanti quali ipossia, farmacoamministrazione, o l&#39;over-espressione di ER-residente proteine ​​transmembrana 2,6 (e riferimenti). Abbiamo recentemente dimostrato la presenza di tali strutture in modelli cellulari di malattie umane 1,7. Provenienti dalla cisterne pila di ER liscio, sono stati dati il nome collettivo di reticolo endoplasmatico liscio organizzata (OSER) nel 2003 6, anche se sono noti anche come karmellae, lamelle, e cristalloide ER sulla base della loro architettura che, come loro dimensione, può variare. Dopo che le cellule sono trasfettate con GFP fusa alla regione citosolica di coda ancorata (TA) proteine ​​ER-residente (d EGFP-ER), la tendenza debolmente dimerizing di GFP in trans altera drasticamente l&#39;organizzazione e la struttura del ER. FRAP e FLIP esperimenti hanno mostrato che d EGFP-ER è libero di diffondere all&#39;interno OSERs, e il fatto che si muove dal ER reticolare alla OSER e viceversa &lt;/ Em&gt; indica che gli aggregati sono continui con il reticolare circostante ER. Analisi ultrastrutturale ha permesso di correlare i dati di fluorescenza con una descrizione dettagliata di architettura OSER e di organizzazione a livello di nanoscala: OSERs sono sempre costituito da pile di cisterne abbinato di ER liscia, ma possono avere diverse forme di organizzazione spaziale, come regolarmente organizzato sinusoidale matrici o spirali, o esagonali &quot;cristalloidi&quot; matrici tubolari. Questi riarrangiamenti portano a morfologie cubi 8 che, così come sono stati trovati in cellule in condizioni fisiologiche 9 e seguenti sollecitazioni quali ipossia 10, il trattamento farmacologico 11, e cancro 9, possono avere un potenziale significativo come marcatori ultrastrutturali. Dopo questa prima dimostrazione utilizzando proteine ​​di fusione GFP, abbiamo usato esperimenti di imaging per analizzare la proliferazione di domini ER in risposta a trattamenti farmacologici 12, assess la tendenza delle proteine ​​fluorescenti a oligomerise in celle 13, e per studiare il ruolo di un mutante proteina TA ALS-linked nella formazione di aggregati intracellulari di origine ER che possono essere rilevanti per la sua 1,8 patogenicità. È stato suggerito che la formazione di aggregati intracellulari (che si verifica in molte malattie neurodegenerative 14) può essere un meccanismo protettivo progettato per prevenire le interazioni tra proteine ​​mutanti tossiche e le componenti cellulari circostanti 15. Quello che segue è una descrizione di una combinazione di metodi di microscopia ottica ed elettronica per lo studio costrutti cui C-terminale domini idrofobici sono inseriti nella membrana del ER, e l&#39;analisi del loro comportamento dinamico e gli effetti della loro iper-espressione di dominio ER architettura in cellule in coltura (vedere la Figura 1 per un diagramma di flusso del protocollo sperimentale).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modificato (DMEM) senza rosso fenolo</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di L-Glutammina 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>PP10110</td><td></td></tr><tr><td>OxyFluor OxyRase</td><td> Inc.</td><td>OF-0005</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide Grado I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato di sodio Triidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio 4% soluzione</td><td>Microscopia elettronica Scienza</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di propilene</td> leggermente radioattivo <td>Sigma-Aldrich</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>Kit di terreno di inclusione EPON</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359-1EA-F</td><td></td></tr> <tr><td>Microscopia elettronica</td> al<td>citrato di piombo </td> Scienza <td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale spettrale </td><td>Leica Microsystems TCS</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Sistema di incubazione a gabbia per microscopio </td><td>OkoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome </td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Coltello diamantato </td><td>Diatome</td><td>Ultra 45 gradi</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione </td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software GraphPad</td><td>Software, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera cellulare di coltura in acciaio per vetrino coprioggetti da 24 mm</td><td>Strumenti</td><td>Bioscience CSC-25</td><td></td></tr><tr><td>Griglie per microscopia elettronica Microscopia</td><td>elettronica Science</td><td>G300Cu</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

I lipidi e proteine ​​in cellule eucariotiche sono continuamente scambiati tra compartimenti cellulari, anche se questi mantengono la loro composizione distintivo e funzioni nonostante il traffico intenso interorganelle molecolare. Le tecniche descritte in questo documento sono potenti mezzi di studiare proteine ​​e lipidi mobilità e il traffico in vivo e nel loro ambiente fisiologico. Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) e perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP) sono ampiamente utilizzati tecniche di live-cell imaging per studiare traffico intracellulare attraverso la via eso-endocitosi, la continuità tra organelli o sottocompartimenti, la formazione di complessi proteici, proteine ​​e localizzazione in microdomini lipidici, ognuno dei quali può essere osservato in condizioni fisiologiche e patologiche. I limiti di questi approcci sono principalmente dovute all&#39;uso di proteine ​​di fusione fluorescenti, e loro potenziali svantaggi includono artefatta over-esprimonoione nelle cellule e la possibilità di differenze nella piegatura e localizzazione delle proteine ​​marcate e native. Infine, come il limite di risoluzione della microscopia ottica (200 nm) non consente di indagine della struttura fine del ER o le sottocompartimenti specifici che possono provenire cellule sotto stress (cioè ipossia, la somministrazione del farmaco, l&#39;espressione eccessiva di transmembrana proteine ​​ER residenti) o in condizioni patologiche, uniamo live-cell imaging di cellule trasfettate coltivate con ultrastrutturali analisi sulla base di microscopia elettronica a trasmissione.

La Figura 2 mostra un esempio di studio FRAP mobilità proteina. La mobilità dei d proteina EGFP-ER è dimostrata dal rapido recupero di fluorescenza dopo photobleaching in OSERs sbiancato. Per l&#39;analisi quantitativa, il primo tempo e la frazione cellulare risultano dai dati misurati sperimentalmente inserendo la seguente equazione monoesponenziale: F (t) = F postale + (F rec-F post) (1-e-t / τ) <p class="jove_content"...

Descriviamo gli approcci di imaging usiamo per indagare la distribuzione e la mobilità delle proteine ​​fluorescenti trasfettate residenti nel reticolo endoplasmatico (ER) mediante la microscopia confocale di cellule viventi. Abbiamo anche ultrastrutturalmente di analizzare l&#39;effetto della loro espressione sulla architettura di questo comparto subcellulare.

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare come le proteine fluorescenti trasfettate si distribuiscono e si muovono nel reticolo endoplasmatico e valutare l'effetto dell'espressione sulla struttura ultra-architetturale. A tale scopo, cellule in coltura vengono trasfettate in modo transitorio con proteine residenti nel reticolo endoplasmatico, ancorate alla coda e marcate con GFP. Successivamente alla trasfezione, viene effettuata un'analisi confocale su cellule vive per valutare il recupero della fluorescenza dopo fotobleaching o FRAP e la perdita di fluorescenza.Nell'analisi mediante fotobleaching o flip, l'analisi ultrastrutturale viene eseguita utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione. I dati ottenuti dimostrano che l'espressione del costrutto B five marcato con GFP altera in modo significativo l'organizzazione e la struttura del reticolo endoplasmatico, inducendo la formazione di aggregati. Il metodo qui descritto può fornire informazioni sui processi fondamentali della biologia cellulare, come la mobilità e il traffico di proteine e lipidi.È inoltre possibile utilizzarlo per studiare le risposte a trattamenti farmacologici al fine di valutare la proteina fluorescente, la modernizzazione degli oligonucleotidi, oppure per analizzare il ruolo di proteine mutanti patogene nella formazione di aggregati intracellulari di origine che potrebbero essere rilevanti per la loro patogenicità, come nell'atrofia laterale sclerosi. Il plasmide utilizzato in questo studio consiste in una versione potenziata di GFP fusa al suo estremo C-terminale alla regione della coda della isoforma er del citocromo B cinque del ratto, mediante una sequenza di collegamento. La regione della coda del B cinque contiene l'intera sequenza che rimane associata alla membrana dopo la scissione da parte della tripsina.Questo include il dominio transmembrana di 17 residui, delimitato da sequenze polari a monte e a valle. Il linker è costituito dall'epitopo M seguito da GLY quattro S3. L'intero cDNA viene inserito nei siti Hindi tre XO uno del vettore di espressione mammifero PC DNA tre. In preparazione alla trasfezione, coltivare le cellule cost sette in DMEM supplementato a 37 gradi Celsius e 5% CO2 il giorno precedente alla trasfezione; piastrare tre volte 10 alla quinta cellule su coprioggetti rotondi da 24 millimetri in una piastra a sei pozzetti il giorno successivo.Trasfettare le cellule con il sistema jet PEI come descritto dal produttore qui, utilizzando un rapporto jet PEI:DNA di due a uno. Questo generalmente porta a un'efficienza di trasfezione del 70-80%. Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per 24 ore prima dell'acquisizione delle immagini. Successivamente, utilizzare pinzette per trasferire un cover slip con le cellule trasfettate nella camera di acquisizione.Riportare la piastra per colture cellulari nell'incubatore per conservare le cellule rimanenti. Per l'analisi ultrastrutturale mediante microscopia elettronica. Per l'immagineggiamento di cellule vive, aggiungere due millilitri di mezzo di imaging a una camera da coltura cellulare in acciaio.Xi Fluor è incluso nel mezzo di imaging per prevenire lo sbiancamento fotoindotto dei campioni. Gli esperimenti devono essere eseguiti in presenza di smide, un inibitore della traduzione, per evitare qualsiasi aumento del segnale di fluorescenza A e, di conseguenza, della fluorescenza totale dovuta alla biosintesi proteica. Posizionare la camera di imaging sul piatto di un microscopio confocale, dotato di un incubatore controllato per la temperatura e per la CO2 e di laser appropriati con impostazioni adeguate del fotomoltiplicatore per eseguire il recupero della fluorescenza.Dopo la fotobleaching o la frack, mettere a fuoco le cellule e impostare i parametri di acquisizione per evitare la saturazione dei pixel. Assicurarsi inoltre che la potenza del laser sia impostata al livello più basso possibile per evitare la fotobleaching causata dall'acquisizione delle immagini. Una volta impostati i parametri di imaging, spostarsi in un nuovo campo visivo con due o più cellule.Una cellula in ogni campo di acquisizione deve rimanere non sbiancata, in modo da poter essere utilizzata per normalizzare il segnale fluorescente della cellula o delle cellule sbiancate. Per lo sbiancamento, disegnare una regione di interesse o ROI corrispondente a un reticolo endoplasmatico liscio organizzato o OSER.Impostare il programma di acquisizione per la foto-sbiancamento utilizzando un numero adeguato di iterazioni per uno sbiancamento efficiente e rapido. Se necessario, è possibile utilizzare una combinazione di laser a 488 nanometri e a 405 nanometri. Impostare il software per acquisire un singolo fotogramma ogni 10 secondi per 10 minuti per tutta la durata dell'esperimento. Ciò include i periodi pre-sbiancamento, di sbiancamento e di recupero.Una volta che tutto è pronto, avviare la schiaritura e l'acquisizione. Al termine dell'acquisizione, passare a un nuovo campo visivo e ripetere questo processo. Acquisire quattro o cinque campi visivi per ogni coprislip.Posizionare accanto per misurare la perdita di fluorescenza nel foto-bleaching o flip. Impostare il programma per eseguire una sequenza di bleaching e acquisizione post-bleaching per 10 secondi ogni 30 secondi per 10 minuti, quindi spostarsi in un nuovo campo visivo. Disegnare un'area di interesse (ROI) corrispondente a una struttura OSER e avviare il bleaching e l'acquisizione come in precedenza per l'analisi.Importare le immagini frap e flip nel software Image J. Valutare innanzitutto il recupero della fluorescenza nell'area di interesse (ROI) bleaccata nel tempo per gli esperimenti frack, quindi determinare la fluorescenza di fondo selezionando un'area al di fuori delle cellule e misurandone l'intensità media nel tempo. Successivamente, sottrarre il segnale di fondo dalle intensità fluorescenti delle ROI.Normalizzare i dati rispetto alla fluorescenza totale della cellula sbiancata, che dovrebbe rimanere costante nel tempo. Quindi adattare l'equazione mono-esponenziale mostrata qui, in cui F post è il segnale fluorescente dopo lo sbiancamento fotoindotto, F rec è il valore massimo di recupero della fluorescenza raggiunto dopo lo sbiancamento, T è il tempo finale di registrazione e tau è il tempo intermedio di registrazione.Per l'analisi degli esperimenti di flip, tracciare una ROI all'esterno dell'OSER bleaccato, coprendo l'intera cellula, e misurare l'intensità di fluorescenza nel tempo. Per gli esperimenti di frack, sottrarre il fondo utilizzando un'area esterna alle cellule. Normalizzare i dati ai livelli di fluorescenza di una ROI tracciata su una cellula non bleaccata per correggere qualsiasi diminuzione della fluorescenza causata dall'acquisizione delle immagini stessa.Infine, rappresentare i risultati utilizzando GraphPad Prism o un software simile. Molti dei reagenti utilizzati per preparare i campioni per la microscopia elettronica sono tossici. Pertanto, i seguenti passaggi devono essere eseguiti indossando camice da laboratorio e guanti, lavorando sotto cappa aspirante.Dopo aver rimosso il vetrino dalla piastra di Petri per la microscopia ottica, fissare le cellule rimanenti cresciute sul fondo della piastra come un monostrato per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzando una spatola in teflon, staccare le cellule e trasferirle in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri, quindi pellettizzare le cellule mediante centrifugazione a 9.000 ×g per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante, aggiungere del fissativo fresco e lasciare in incubazione tutta la notte a quattro gradi Celsius.Lavare i pellet aspirando delicatamente il fissativo con una pipetta Pasteur e aggiungendo il buffer Cate. Per evitare di disturbare il pellet, far scendere il buffer lungo la parete laterale del tubo durante l'aggiunta. Aspirare la soluzione di lavaggio e procedere alla post-fissazione aggiungendo le cellule in una soluzione di tetroxido di osmio al 1% in buffer Cate per un'ora a temperatura ambiente.Successivamente, risciacquare con acqua Milli Q e aggiungere direttamente nel tubo da microcentrifuga l'acetato di uranile al 1% in acqua distillata. Sbloccare la colorazione per 20 minuti fino a un'ora, disidratare i campioni in una serie crescente di etanolo al 70%, 80%, 90%, 100% e nuovamente al 100% per 10 minuti ciascuno. Quindi lavare i pellet due volte con ossido di propilene per 15 minuti ogni volta.Infiltrare i campioni sostituendo l'ossido di propilene con una miscela uno a uno di ossido di propilene e epon, incubare per almeno due ore e fino a tutta la notte. Successivamente, per incorporare i campioni, posizionare i frammenti del pellet cellulare in stampi per inclusione precedentemente riempiti con resina epossidica epon, quindi polimerizzare a 60 gradi Celsius per almeno 24 ore. Il giorno seguente, montare il blocco di resina su un ultramicrotomo dotato di un coltello al diamante da 45 gradi.Utilizzando un coltello per taglio, ritagliare manualmente i blocchetti di resina per rimuovere le parti in cui il campione inclusi non è presente. Successivamente, mediante ultramicrotomo, ottenere sezioni di 60-70 nanometri. Raccogliere le sezioni su griglie di rame da 300 mesh per la colorazione.Posizionare le griglie su gocce da 30 microlitri di una soluzione satura di uranile acetato e incubare per 20 minuti. Quindi risciacquare tre volte con acqua milli Q e incubare nuovamente le griglie su piccole gocce di citrato di piombo per sette minuti. Dopo l'incubazione, lavare accuratamente le griglie immergendole in acqua milli Q e lasciarle asciugare a temperatura ambiente.Osservare le griglie colorate utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione ed acquisire immagini mediante una telecamera CCD montata inferiormente a un ingrandimento finale compreso tra 6.000 e 39.000 x per studiare la diffusione laterale del D-E-G-F-P ER nel reticolo endoplasmatico liscio organizzato. Sono state analizzate mediante FRAP sette cellule transientemente trasfettate provenienti da tre coprioggetti, come descritto in questo video; come mostrato in questa sequenza a intervalli di tempo, sono state sbiancate due strutture OSER e il recupero della fluorescenza è stato registrato nel tempo. È stato rilevato un chiaro recupero della fluorescenza già un minuto dopo lo sbiancamento, con un ulteriore aumento del segnale quattro minuti dopo, al fine di determinare il tempo di dimezzamento del recupero e quantificare la frazione mobile del D-E-G-F-P-E-R.Le immagini acquisite sono state analizzate come descritto in questo video, come si può vedere qui. L'intensità fluorescente dell'area sbiancata è aumentata nel tempo, dimostrando che la proteina fluorescente è altamente mobile all'interno degli aggregati. Per studiare la continuità tra diversi sottodomini del reticolo endoplasmatico, sono stati eseguiti esperimenti di inversione (flip) come mostrato in questa sequenza a intervalli di tempo.Il bleaching continuo di un OSER indicato qui dalla freccia gialla provoca una diminuzione progressiva della fluorescenza nel resto del reticolo endoplasmatico e in altre strutture OSER all'interno della stessa cellula. La freccia rossa indica una porzione di una cellula non sottoposta a bleaching in cui il segnale fluorescente rimane costante nel tempo. L'analisi quantitativa di questi dati ha rivelato un vuotamento progressivo e rapido del reticolo endoplasmatico, dimostrando che gli aggregati sono fisicamente connessi con il resto del reticolo endoplasmatico. Per esaminare l'architettura fine di questi aggregati, cellule che esprimono alti livelli di D-E-G-F-P ER sono state osservate mediante microscopio elettronico a trasmissione.Questo micrografico mostra una vista a basso ingrandimento del citoplasma cellulare contenente un aggregato di membrane. L'aggregato è costituito da una stack cyi e da membrane sinusoidali ondulate. Come si può vedere qui.È possibile osservare i mitocondri raggruppati intorno alle strutture OSER, mentre i ribosomi, indicati dalle frecce, decorano soltanto le membrane della cisterna più esterna. Si noti che lo spazio denso all'elettrone spesso 11 nanometri tra le membrane è continuo con il citoplasma. Un OS ER può essere formato da un reticolo endoplasmatico lamellare, costituito da pile di cisterne appiattite del reticolo endoplasmatico, che possono apparire continue o frammentate nelle sezioni sottili; occasionalmente possono essere osservate vescicole in gemmazione dalla cisterna più esterna della pila, come mostrato qui.Nel complesso, questi dati dimostrano che gli aggregati fluorescenti osservati in cellule in coltura trasfettate con D-E-G-F-P ER rappresentano aree di reticolo endoplasmatico liscio e appiattito che si organizzano spazialmente in geometrie tridimensionali ben definite. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di acquisire tutte le immagini senza pixel saturi, poiché la saturazione potrebbe alterare il recupero fluorescente e, di conseguenza, l'analisi della mobilità proteica. È sempre necessario normalizzare il segnale fluorescente nella zona sbiancata (bleach), ovvero nella regione di interesse, rispetto alla fluorescenza totale della stessa cellula, al fine di tenere conto delle variazioni di intensità fluorescente dovute allo sbiancamento durante l'acquisizione delle immagini o a piccole variazioni del piano di fuoco.

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