Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione In vitro

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di trasfettare i neuroblasti postnatali dei roditori primari al fine di esaminare l'effetto delle proteine bersaglio sulla loro migrazione. Ciò si ottiene sezionando prima il neuroblasto dal flusso migratorio rostrale dei pops dei roditori. Il secondo passo consiste nel dissociarli e trasfettarli mediante affezione del nucleo con il DNA o con S-H-R-N-A.

Successivamente, i neuroblasti vengono riaggregati in gocce pendenti e quindi coltivati in sospensione per un tempo appropriato. Il passo finale consiste nell'incorporare i cluster di neuroblasti riaggregati in una matrice tridimensionale e lasciarli migrare. In definitiva, l'immunofluorescenza o la microscopia di imaging time-lapse viene utilizzata per analizzare la migrazione dei neuroblasti.

Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo della neurogenesi, come il controllo della migrazione dei neuroblasti derivata dalle cellule staminali nel cervello postnatale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente facile e veloce rispetto all'uso di vettori virali, che può essere impegnativo e richiedere molto tempo. Dopo aver sacrificato una cucciolata di ratto da P sei a P sette, praticare un'incisione posteriore nella pelle lungo la sutura sagittale media dal naso al cervelletto con una lama di bisturi su ciascun ratto.

Quindi, stacca la pelle. Ripeti la stessa incisione lungo il cranio. Quindi rimuovere delicatamente i lembi cranici con una pinza e rimuovere con cura il cervello insieme ai bulbi olfattivi con una spatola.

Dopodiché, taglia il terzo più coccoloso del cervello e scartalo. Successivamente, tagliare il tessuto cerebrale in fette coronali spesse 1,4 millimetri utilizzando un tritatessuti. Trasferire le fette in un piatto contenente un mezzo di dissezione freddo.

Quindi visualizzare le fette al microscopio di dissezione. Separali con cura usando un ago. Il flusso migratorio rostrale appare come un'area triangolare traslucida al centro delle sezioni OB e come una piccola area circolare.

In più fette di cervello, taglia l'RMS da ogni fetta con un bisino microchirurgico, facendo attenzione a evitare di includere il tessuto circostante. Successivamente, raccogliere i frammenti RMS con una pipetta di plastica per pasta e metterli in un piattino contenente terreno di dissezione freddo su ghiaccio. Quindi ruotare delicatamente il piatto per raccogliere i frammenti RMS al centro del piatto.

Raccogli i frammenti con una pipetta di plastica e trasferiscili in una provetta da 15 millilitri. Lasciare depositare i frammenti sul fondo del tubo. Sostituire il mezzo di dissezione con due millilitri di terreno di dissociazione T tri.

Valutare i frammenti RMS pipettando delicatamente la sospensione del frammento su e giù circa 10 volte utilizzando una pipetta P 1000 in seguito. Lasciare il tubo con i frammenti di tessuto in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per due minuti. Successivamente, pipettare nuovamente la soluzione 10 volte e assicurarsi che i frammenti si siano dissociati.

Quindi inattivare la tripsina aggiungendo cinque millilitri di DMEM pre-vermifugo più il 10% di FCS e centrifugare la sospensione cellulare a 433 volte G per cinque minuti. Rimuovere il terreno in eccesso e risus. Sospendere il pellet cellulare pipettandolo delicatamente in un millilitro di DMEM preriscaldato più il 10% di FCS, quindi aggiungere altri quattro millilitri dello stesso terreno.

Quindi eseguire un conteggio delle cellule. Per ogni affezione del nucleo sono necessarie almeno 2,5 volte 10 per ogni affezione del nucleo, mentre si ottengono risultati ottimali. Usando da tre a quattro volte da 10 a sei cellule per affezione del nucleo.

Centrifugare la sospensione cellulare a 433 volte G per cinque minuti. Successivamente, rimuovere quanto più terreno possibile in questa procedura. Immediatamente Resus, sospendere il pellet cellulare nella soluzione di affetto del nucleo del neurone di ratto precedentemente incubata.

A temperatura ambiente trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascuna provetta EOR contenente SI R-N-A-D-N-A. Quindi miscelare delicatamente pipettando due o tre volte con una pipetta P 200. Successivamente, aggiungere il campione sul fondo del nucleo affettivo vete facendo attenzione a non generare bolle.

Per l'affezione del nucleo, utilizzare il programma G dash 0, 1, 3 per le cellule di ratto o O dash 0, 0, 5 per le cellule di topo. Successivamente, aggiungere rapidamente un millilitro di DMEM prebellico più il 10% di FCS al campione interessato dal nucleo. Trasferire il campione in una provetta da 15 millilitri contenente cinque millilitri di DMEM prebellico più il 10% di FCS utilizzando la pipetta di plastica fornita dal kit di affezione del nucleo.

Quindi centrifugare il campione a 433 volte G per cinque minuti. Rimuovere con cura tutto il terreno in eccesso e risospendere il pellet in 25-30 microlitri di DMEM prebellico più il 10% di FCS utilizzando una pipetta P 20. Non utilizzare più di 30 microlitri di terreno.

Successivamente, pipettare la sospensione a goccia sul lato interno del coperchio di un piatto P 35. Quindi capovolgere il coperchio sul piatto P 35 contenente due millilitri di terreno completo. Lasciarlo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per almeno cinque ore.

Dopo cinque ore, trasferire le gocce pendenti dal coperchio nell'intero mezzo del piatto. Utilizzando una pipetta P 1000 con punta tagliata. Quindi incubare i campioni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore per le infezioni nucleari da DNA NU o 48 ore per le affezioni del nucleo SI A HRA.

Ora prepara 25 millilitri di terreno completo e pre equilibra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per alcune ore. Nel frattempo, estrarre le aliquote congelate della matrice della membrana del seminterrato dal congelatore a 80 gradi Celsius negativi e scongelarle con ghiaccio nella cella frigorifera. Per ogni nucleo affettivo, preparare un piatto di sei centimetri contenente fino a otto vetrini di copertura sterili da 13 millimetri.

Disporre i piatti su una ghiacciaia coperta con pellicola trasparente. Per mantenere l'umidità, posizionare una striscia di tessuto umido all'interno di un piatto di 15 centimetri che verrà utilizzato per contenere fino a tre piatti da sei centimetri contenenti oblast' incorporati nel ginocchio. Quindi, aggiungere il terreno completo alla matrice haw in un rapporto da uno a tre, trasferire i cluster di cellule riaggregate in una provetta da 15 millilitri e centrifugarla 433 volte G per cinque minuti.

Successivamente, rimuovere il terreno in eccesso e risospendere il pallet in 10 microlitri di terreno completo. Quindi posizionare due microlitri di sospensione di aggregati cellulari su ciascun vetrino protettivo sterile. Aggiungere 18 microlitri di matrice di miscela media completa e utilizzare la punta della pipetta per distribuire la matrice su tutto il coperchio.

Infilate subito dopo aver inserito il piatto da sei centimetri contenente i vetrini coprioggetti nel piatto da 15 centimetri. Trasferire il piatto nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 15-20 minuti. Dopo che la matrice si è solidificata, aggiungere delicatamente cinque millilitri di terreno completo a ciascun piatto di sei centimetri e spingere verso il basso eventuali vetrini di copertura galleggianti con la punta della pipetta, quindi incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di carbogeno per consentire al neuroblasto di migrare fuori dagli aggregati cellulari.

In questa figura, le cellule RMS isolate di ratto hanno dimostrato di essere immunopositive per i marcatori dei neuroblasti migratori DCX e beta tre tubulina. E questa figura mostra che i marcatori dei neuroblasti migratori DCX e PSA NCA sono espressi nelle cellule che migrano fuori dal topo. RMS Explan per l'affezione nucleare di Neuroblast Nu di topo, il Neuroblasto RMS dissociato di topo è stato affetto da nucleo con GFP riaggregato incorporato in una matrice tridimensionale e lasciato migrare per sei ore.

I neuroblasti che migrano da un cluster di cellule riaggregate mostrano un'elevata efficienza di trasfezione. Qui, i neuroblasti di ratto sono stati colpiti dal nucleo con due diversi plasmidi codificanti GFP riaggregati incorporati nella matrice e lasciati migrare per 24 ore. Le cellule sono state quindi fissate e immunocolorate per GFP e beta tre tubulina per misurare la distanza di migrazione.

Il cluster di celle aggregate è diviso in sei settori uguali e per ciascun settore viene misurata la distanza tra il bordo del cluster e la cella migrata più lontana. Questa figura mostra la quantificazione della distanza relativa migrata dalle cellule affette da NUCLE GFP positive e controlla le cellule non affette da nucleo GFP negative per monitorare la migrazione dei neuroblasti. Dopo che S-H-R-N-A Nucle affezione, i neuroblasti di ratto sono stati colpiti dal nucleo con un vettore S-H-R-N-A di controllo o lo stesso vettore contenente un bersaglio HRNA che fissa e le cellule proteiche di raggruppamento dell'actina sono state riaggregate per 48 ore incorporate nella matrice e lasciate migrare per 24 ore.

Gli aggregati sono stati quindi fissati e colorati immuno per GFP e beta tre tubulina. L'efficace deplezione di fissaggio può essere rilevata 50 ore dopo l'affezione dei nuclei S-H-R-N-A mediante Western Blood Analysis e Acton è mostrato qui come controllo di carico. Ecco l'analisi quantitativa della distanza di migrazione relativa che mostra che la deplezione accelerata compromette significativamente la migrazione dei neuroblasti.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'elettroporazione postnatale per convalidare in vivo i risultati ottenuti con il saggio di migrazione NU Nuclear Affection.