Name: Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Impara la nucleofezione di neuroblasti di roditori per studiare la migrazione cellulare in un saggio 3D. Questo metodo offre un approccio efficiente per analizzare la neurogenesi postnatale in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato finanziato da una Wellcome Trust progetto di sovvenzione assegnato al PD e GL (089236/Z/09/Z). SG stato supportato da una Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council PhD borsa di studio. Ringraziamo Matthieu Vermeren per il gentile dono del vettore shRNA e Jennifer Shieh per preziosi consigli su neuroblasti nucleofection.

Questa procedura è in conformità con i regolamenti interni del Regno Unito Office (Procedure di animale scientifici Act, 1986). Gli scienziati devono seguire le linee guida stabilite e approvate dalle loro organizzazioni di regolamentazione nazionali o istituzionali animali. 1. Dissezione e dissociazione di Rat RMS neuroblasti <ol><li> Preparare le soluzioni necessarie per RMS dissezione e la dissociazione: </li></ol> Medio Dissection (100 ml) Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) - 98.5 ml 5 M HEPES pH 7,4-0,5 ml Penicillina-streptomicina (10.000 unità / ml e 10.000 mg / ml) - 1 ml Medio dissociazione (2 ml) HBSS - 1.760 ml 10x tripsina (2,5%) - 200 ml DNAse1 (1 mg / ml) - 40 microlitri Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% Fetal Calf Serum (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS - 4 ml Terreno completo (12 ml) Medie Neurobasal - 11,46 ml Supplemento B27 - 250 microlitri L-glutammina (200 mm) - 125 microlitri Glucosio (45%) - 165 microlitri 2. Filtro-sterilizzare l&#39;% FCS DMEM + 10 e il mezzo completo e preequilibrate in un C / 5% CO 2 incubatore 37 °. <ol><li> Dissezione <ol><li> Sacrifica un ratto cucciolata P6-P7 (circa 12 cuccioli) per dislocazione cervicale e decapitare con le forbici. </li><li> Fare un&#39;incisione antero-posteriore in pelle lungo la sutura sagittale dal naso al cervelletto con una lama da bisturi. Sbucciare la pelle fuori e ripetere la stessa incisione lungo il cranio. </li><li> Rimuovere delicatamente i lembi cranici con una pinza e rimuovere con attenzione il cervello con una spatola, avendo cura di includere i bulbi olfattivi. </li><li> Tagliare il terzo più caudale del cervello e scartarla. </li><li> Tritare the tessuto cerebrale in 1,4 millimetri di spessore fette coronali con un chopper tessuto. </li><li> Mettere le fette in piatti contenenti medio dissezione a freddo e separare con cura utilizzando un ago. </li><li> Il RMS appare come triangolare, zona traslucida nel centro di sezioni OB e come una piccola area circolare in più sezioni cerebrali caudale. Tagliare i RMS su ogni fetta con un coltello microchirurgico, avendo cura di evitare compreso il tessuto circostante. In P7 cuccioli di ratto, di solito i ~ 8 fette più rostrale (compresi OB) contengono RMS. </li><li> Raccogliere i frammenti RMS con una pipetta Pasteur di plastica e metterli in un piccolo piatto contenente il mezzo di dissezione a freddo sul ghiaccio. </li><li> Quando la dissezione è completa, trasferire i frammenti RMS in una provetta da 15 ml con una pipetta di plastica. Lasciare frammenti di stabilirsi sul fondo della provetta. </li></ol></li><li> Dissociazione <ol><li> Sostituire il mezzo dissezione con 2 ml di terreno dissociazione. </li><li> Triturare i frammenti RMS delicatamente pipetting la sospensione frammento su e giù circa 10x con una pipetta P1000. </li><li> Lasciare il tubo con i frammenti di tessuto in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per 2 min. </li><li> Pipettare la soluzione nuovamente 10x e garantire che i frammenti si sono dissociati (la sospensione dovrebbe diventare torbida). </li><li> Inattivare la tripsina aggiungendo 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 433 xg per 5 min. </li><li> Nel un&#39;aliquota frattempo la quantità necessaria di siRNA / DNA in provette Eppendorf (di solito 3-5 mg DNA / shRNA o 5-9 mg oligo siRNA per nucleofection, tuttavia la quantità di DNA / siRNA può richiedere ottimizzazione). </li><li> Rimuovere eccesso di terreno e risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente in 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS. </li><li> Eseguire un conteggio delle cellule. Aspettatevi ~ 1 x 10 6 cellule per piccoli dei ratti cervello. Un minimo di 2,5 x 10 6 cellule sono necessari per ogni nucleofection, mentrerisultati ottimali si ottengono con 3-4 x 10 6 cellule per nucleofection. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 433 xg per 5 min. Assicurarsi di rimuovere quanto più mezzo possibile. </li></ol></li></ol> 2. Nucleofection <ol><li> Subito risospendere il pellet cellulare in ratto (o il mouse se usando cellule di topo) soluzione nucleofection neurone precedentemente incubate a temperatura ambiente. Utilizzare 100 ml per nucleofection. Nota: in genere una cucciolata di 12 cuccioli di ratto è sufficiente per eseguire 4 nucleofections e una cucciolata mouse (12 cuccioli) è sufficiente per eseguire 2 nucleofections. </li><li> Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare a ciascuna provetta Eppendorf contenente siRNA / DNA e mescolare delicatamente 2-3x pipettando con una pipetta P200. </li><li> Aggiungere il campione (sospensione cell-DNA/siRNA) al fondo della nucleofectioncuvette, avendo cura di evitare bolle. </li><li> Nucleofect utilizzando il programma G-013 (per le cellule di ratto) o O-005 (percellule di topo). Un nucleofection richiede circa 5 sec. </li><li> Aggiungere rapidamente 1 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS al campione nucleofected. </li><li> Ripetere i punti 2.4 e 2.5 per tutti gli altri campioni. Nota: per ottenere risultati ottimali, l&#39;intera procedura nucleofection non dovrebbe durare più di 5 minuti. </li><li> Trasferire ciascun campione in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS con la pipetta di plastica fornita dal kit nucleofection. Evitare il trasferimento delle eventuali detriti cellulari al tubo. </li><li> Centrifugare i campioni a 433 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere con cautela tutta eccesso di terreno e risospendere il pellet in 25-30 ml di preriscaldata DMEM + 10% FCS con una pipetta P20. Non usare più di 30 ml di mezzo. </li><li> Pipettare sospensione come una goccia sul lato interno di un coperchio piatto p35. </li><li> Invertire il coperchio sopra il piatto p35 contenente 2 ml di mezzo completo (vedi anche figura 1). </li><li> Lasciare in incubatrice (37 ° C / 5% di CO 2) peralmeno 5 ore e fino a 7 ore. Tempo di incubazione più lungo consente una migliore riaggregazione di gruppi di cellule. </li><li> Trasferire le gocce che pendono dal coperchio in terreno completo nel piatto con una pipetta P1000 con una punta tagliata. </li><li> Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per 24 ore per nucleofections DNA e 48 ore per nucleofections siRNA / shRNA. </li></ol> 3. Incorporare <ol><li> Preparare mezzo completo (25 ml) e preequilibrate è a 37 ° C / 5% di CO 2 per alcune ore. </li><li> Estrarre le aliquote congelate di matrice membrana basale da -80 ° C freezer e scongelare sul ghiaccio in camera fredda. </li><li> Per ogni Nucleofection preparare un piatto di 6 centimetri che contiene fino a otto 13 millimetri coverlips sterili. </li><li> Porre le capsule in una scatola di ghiaccio coperto con pellicola trasparente. E &#39;importante mantenere i coprioggetti fresco per prevenire solidificazione matrice durante la procedura di incorporamento. </li><li> Per mantenere l&#39;umidità, mettere una striscia di tessuto umido in un piatto di 15 centimetri che will essere utilizzato per contenere fino a tre piatti 6 centimetri contenenti i neuroblasti incorporati. </li><li> Aggiungere mezzo completo alla matrice scongelato in un rapporto 1:3. Ad esempio, miscelare 40 ml di terreno completo con 120 ml di matrice pipettando. Questa quantità di matrice è sufficiente per l&#39;incorporamento aggregati su otto coprioggetto 12 mm. </li><li> Trasferire i gruppi di cellule reaggregated una provetta da 15 ml e centrifugare a 433 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere eccesso di terreno e risospendere il pellet in 10 ml di terreno completo. </li><li> Mettere 2 ml di cellule di sospensione aggregato su ogni vetrino sterile e aggiungere 18 ml di matrice / medio impasto completo. Utilizzare la punta della pipetta per diffondere la matrice su tutta vetrino. </li><li> Porre immediatamente la capsula di 6 cm contenente i coprioggetti nel piatto 15 centimetri e lasciare in incubatore (37 ° C / 5% di CO 2) per 15-20 minuti. Quando la matrice è solidificato, aggiungere delicatamente 5 ml di terreno completo per ogni sei centimetri assunzione piatto cura di spingeregiù qualsiasi vetrino galleggiante con una punta della pipetta. </li><li> Incubare per 24 ore a 37 ° C / 5% di CO 2 per far neuroblasti migrano degli aggregati cellulari. </li></ol> 4. 3D migrazione Assay <ol><li> Preparare le soluzioni necessarie per immunoistochimica. <ol><li> Preparare la soluzione del blocco: Soluzione blocco Capra (50 ml) Soluzione tampone fosfato (PBS) - 5 ml Siero di capra - 7,5 ml 10% Triton X-100 - 1,5 ml BSA - 50 mg H 2 O - 36 ml </li><li> Filtrare e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione di fissaggio: Soluzione di fissaggio (100 ml) Paraformaldeide (PFA) - 4 g ATTENZIONE: maneggiare sempre PFA sotto una cappa Saccarosio - 20 g (opzionale) PBS fino a 100 ml </li><li> Su una piastra calda e sotto costante agitazione sciogliere il PFA in 80 ml di PBS mantenuta a 65 ° C. </li><li> Una volta che il PFA è sciolta, aggiungere 20 g di saccarosio. </li><li> Regolare il pH a7.4 (di solito con l&#39;aggiunta di 60 microlitri ~ 1 M NaOH per 100 ml di soluzione). </li><li> Portare a un volume totale di 100 ml con PBS. </li></ol></li><li> Immunostaining <ol><li> Mettere coprioggetto in una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Risciacquare coprioggetto con PBS 2x. </li><li> Fissare gli aggregati neuroblasti RMS con soluzione di fissaggio per 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare coprioggetto con PBS 3x (5 min / lavaggio - su una piattaforma oscillante). </li><li> Bloccare per 30-60 min con la soluzione del blocco di capra. </li><li> Diluire gli anticorpi primari in soluzione blocco di capra e incubare una notte a 4 ° C. (Se lo si desidera, falloidina fluorescente (1:400) e colorante Hoechst (1:10.000) possono anche essere aggiunti alla soluzione di anticorpo primario per visualizzare actina filamentosa e nuclei). </li><li> Risciacquare coprioggetto con PBS 3x (5 min / lavaggio). </li><li> Diluire anticorpi secondari in soluzione blocco capra e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare coverslips con PBS 3x (5 min / lavaggio) </li><li> Mount coprioggetto con mezzo di montaggio fluorescenti e lasciare asciugare per una notte a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Analisi di migrazione <ol><li> Cattura immagini di aggregati fissi neuroblasti RMS con un microscopio a fluorescenza con obiettivo 10X. Include una barra di scala un&#39;immagine campione in. </li><li> Per impostare la scala per quantificare, misurare la barra della scala nell&#39;immagine selezionando lo strumento &#39;Retta&#39; nella barra degli strumenti ImageJ. </li><li> Scegliere l&#39;opzione &#39;Analizza&#39; e cliccare su &#39;impostare la scala&#39;. </li><li> Nella finestra scala di impostare la &#39;distanza nota&#39; e spuntare la casella &#39;globale&#39; per mantenere le stesse impostazioni per tutte le misurazioni. </li><li> Utilizzare lo strumento &#39;linea segmentata&#39; sulla barra degli strumenti ImageJ per misurare la distanza dal bordo dell&#39;aggregato al lontano neuroblast migrato in 6 diversi settori in tutto l&#39;intero aggregato (Figura 3B). Considerare solo isolato aggregates per l&#39;analisi. </li><li> Calcolare una distanza media migrazione dai valori 6 ottenuti per ciascun aggregato. </li><li> Misura 10-20 aggregati per ciascuna condizione in ogni esperimento e piscina indipendenti risultati da un minimo di tre esperimenti indipendenti. Sempre includere un controllo nucleofection (ad es. GFP o un sh controllo / siRNA). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Neurogenesis+in+the+Mammalian+Brain%3A+Significant+Answers+and+Significant+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li>
<li>Alonso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adult-born+neurons+facilitates+learning+and+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory.</a> Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).</li>
<li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Is adult neurogenesis essential for olfaction?</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li>
<li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li>
<li>Jin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).</li>
<li>Kim, Y., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+subventricular+zone+stem+cells+after+neuronal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury.</a> Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).</li>
<li>Massouh, M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De-routing+neuronal+precursors+in+the+adult+brain+to+sites+of+injury%3A+Role+of+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature.</a> Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).</li>
<li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li>
<li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Distance+Neuronal+Migration+in+the+Adult+Mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li>
<li>Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+migration+of+neuronal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chain migration of neuronal precursors.</a> Science. 271, 978-981 (1996).</li>
<li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Neuronal+Migration+Changes+the+Fate+of+Developing+Neurons+in+the+Postnatal+Olfactory+Bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li>
<li>Battista, D., Rutishauser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+Polysialic+Acid+Triggers+Dispersion+of+Subventricularly+Derived+Neuroblasts+into+Surrounding+CNS+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues.</a> J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).</li>
<li>Conover, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Eph%2Fephrin+signaling+affects+migration+and+proliferation+in+the+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone.</a> Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).</li>
<li>Mobley, A. K., McCarty, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta+8+Integrin+is+Essential+for+Neuroblast+Migration+in+the+Rostral+Migratory+Stream%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream.</a> Glia. 59, 1579-1587 (2011).</li>
<li>Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+for+slits+in+the+control+of+cell+migration+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).</li>
<li>Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+regulates+migration+of+olfactory+interneuron+precursors+in+the+rostral+migratory+stream+through+Met-Grb2+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling.</a> J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).</li>
<li>Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+signaling+in+postnatal+neurogenesis%3A+The+first+leg%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg.</a> Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).</li>
<li>Dityateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+electroporation-based+gene+transfer+into+primary+dissociated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons.</a> J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).</li>
<li>Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+Regulates+Cell+Soma+Translocation+and+the+Distribution+of+Adhesion+Proteins+in+Migrating+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons.</a> PloS One. 6, (2011).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+Primary+Culture+of+Embryonic+Mouse+Hippocampal+and+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e2373(2011).</li>
<li>Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of primary neurons.</a> Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).</li>
<li>Causeret, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p21-Activated+Kinase+Is+Required+for+Neuronal+Migration+in+the+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).</li>
<li>Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+knockdown+of+neuropilin-1+in+the+developing+chick+nervous+system+by+siRNA+hairpins+phenocopies+genetic+ablation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse.</a> Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).</li>
<li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li>
<li>Ward, M., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+of+neuronal+migration+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigations of neuronal migration in the central nervous system.</a> Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Selection+for+High-Expression+Transfectants+with+a+Novel+Eukaryotic+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).</li>
<li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Acute+Slices+of+the+Adult+Mouse+Forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain.</a> J. Vis. Exp. , e4061(2012).</li>
<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Vessels+Form+a+Migratory+Scaffold+in+the+Rostral+Migratory+Stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
<li>Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Postnatal+Electroporation+and+Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Mouse+Acute+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain.</a> J. Vis. Exp. , in press (2013).</li>
<li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Subventricular+Zone+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neonatal Subventricular Zone Electroporation.</a> J. Vis. Exp. , e50197(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La migrazione dei neuroblasti lungo le RMS per la posizione finale in OB è un passo fondamentale nella neurogenesi postnatale. Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano questo processo complesso sono ben lungi dall&#39;essere pienamente compreso. La procedura sperimentale qui descritto consente lo studio della migrazione neuroblasti in vitro. Abbiamo adattato un protocollo precedentemente pubblicato per isolare RMS neuroblasti dai primi di topo postnatale o ratto 25. Per ottenere risultati ottimali, è importante avere il passo dissezione, dal momento che è fondamentale per mantenere l&#39;intervallo di tempo tra la dissezione e nucleofection al minimo. Dopo nucleofection, neuroblasti possono essere reaggregated, incorporati in una matrice tridimensionale e lasciati a migrare su un periodo di 24 ore. In alternativa, per scopi diversi migrazione (ad esempio, immunofluorescenza e western blot), le cellule possono essere immediatamente placcato dopo nucleofection su polyornithine/laminin-coprioggetto rivestiti, dove sopravvivono fino a 4-5 giorni. Neuroblasti topo e nel ratto migrano in Matrigel in misura simile, tuttavia cellule di topo sembrano avere una maggiore tendenza a migrare nelle catene di cellule di ratto. A seconda dello scopo dello studio, neuroblasti possono essere nucleofected con differenti plasmidi codificanti proteine ​​fluorescenti o Tipo / mutante proteine ​​selvatiche di interesse. Per ottimali plasmidi di espressione proteica con un promotore CAG (β-actina promotore di CMV enhancer e-β globina poly-A coda) 26 sono altamente raccomandati. Inoltre, oligo siRNA o plasmidi shRNA possono essere nucleofected per atterramento target di interesse. Proteina efficace deplezione può essere visualizzato mediante immunofluorescenza o Western Blot (di solito lisi aggregati incorporati dal 1 ratto cuccioli con 50 ml di tampone di lisi standard). Nucleofection è un metodo relativamente semplice per transfettare neuroblasts primari, offre un&#39;alternativa più facile e veloce a viral trasfezione mediata da vettori, e può raggiungere alte (~ 70-80%) efficienza di trasfezione. E &#39;fondamentale lavorare velocemente durante la procedura nucleofection, dopo aver lasciato neuroblasti nella soluzione nucleofection per un tempo prolungato riduce drasticamente la vitalità cellulare. La resa media di cellule da RMS dissezione è relativamente basso per i topi P7 (~ 5 x 10 5 cellule / cervello) in confronto ai ratti P7 (~ 1 x 10 6 cellule / cervello) e sono richiesti almeno 3 x 10 6 cellule per nucleofection per raggiungere trasfezione con ~ 50% di efficienza. Inoltre, neuroblasti ratto sembrano resistere meglio Nucleofection rispetto ai neuroblasti del mouse. Pertanto, cuccioli precoce postnatale (P6-P7) ratto potrebbero rappresentare una comoda fonte neuroblast, anche considerando che l&#39;organizzazione di RMS ratti e topi sono molto similar 27 e che la portata di ratto e topo migrazione neuroblasti in vitro è paragonabile. Si consiglia di non tenere i grappoli reaggregated di neuroblasti nucleofected in sospensione per più di 48 ore per evitare effetti anomali sulla morfologia cellulare e la migrazione (le nostre osservazioni non pubblicate). Il test 3D qui descritto può essere usato per quantificare la migrazione neuroblasti in un punto di tempo fisso dopo inclusione in matrice (ad es. 24 hr). Aggregati di dimensioni diverse possono essere utilizzati nell&#39;analisi, poiché non vi è alcuna correlazione significativa tra la dimensione degli aggregati e distanza di migrazione (nostre osservazioni non pubblicate). Per visualizzare e ulteriormente approfondire le dinamiche della migrazione neuroblasti, time-lapse imaging può essere utilizzato. Si raccomanda di effettuare l&#39;analisi di migrazione all&#39;interno di un intervallo di 24 ore dopo l&#39;incorporamento, in quanto la velocità di neuroblasti sembra diminuire drasticamente a tempi più lunghi (nostre osservazioni non pubblicate). &lt;/ P&gt; Ci sono alcune limitazioni a questo protocollo. In primo luogo, nucleofection può finora essere utilizzato per i primi neuroblasts roditori postnatale, mentre l&#39;infezione con vettori virali rimane il metodo più efficiente per trasfezione neuroblasti adulti 28. In secondo luogo, la migrazione in vitro non riproduce completamente la complessa architettura delle RMS osservati in vivo. Infatti, anche se neuroblasti mantengono la capacità di migrare in modo simile alle loro controparti in vivo, nel setup sperimentale qui descritte non hanno interazioni con altri componenti di RMS come astrociti e vasi sanguigni, che contribuiscono anche a regolare la loro motilità 9,29, 30. Questo problema può essere affrontato in futuro ottimizzazione del tridimensionali sistemi modello di co-coltura. In conclusione, combinando nucleofection con un saggio di migrazione 3D rappresenta uno strumento prezioso per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla basemigrazione neuroblasti. Questa procedura sperimentale fornisce un metodo iniziale, veloce e relativamente semplice per valutare il ruolo dei regolatori candidati di migrazione neuroblasti, che possono essere ulteriormente convalidate da altri approcci come in vivo postnatale elettroporazione e time-lapse imaging di culture fetta cerebrali 28,31,32 .

Nel postnatale cervello dei mammiferi, la generazione di nuovi neuroni (neurogenesi) si verifica per tutta la vita ed è limitato a due nicchie neurogenici: la zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali e la zona subgranulare del giro dentato dell&#39;ippocampo 1. Diversi studi recenti hanno dimostrato l&#39;importante ruolo della neurogenesi adulta nel facilitare i compiti di apprendimento e memoria 2,3. Inoltre, la prova di proliferazione e il reclutamento di progenitori neurali seguenti lesioni cerebrali 4-7 solleva la possibilità di attivazione farmacologica della neurogenesi nella riparazione neurale. Neurogenesi postnatale è strettamente regolamentato in tutte le sue fasi, che comprendono la proliferazione neurali progenitrici, la migrazione, la differenziazione, la sopravvivenza e l&#39;integrazione sinaptica finale dei neuroni appena nati 8. Progenitori neurali (neuroblasti) derivate da cellule staminali nel SVZ migrano a grande distanza attraverso la migratorio rostralestream (RMS) verso il bulbo olfattivo (OB) dove maturano in neuroni funzionali 9. Neuroblasti migratori sono prevalentemente unipolare, con un corpo cellulare allungato estende un unico processo di primo piano. Queste cellule si muovono in catene in modo collettivo, scorrevoli l&#39;uno sull&#39;altro 10. La migrazione è un passo fondamentale per la successiva maturazione dei progenitori SVZ-derivati ​​in neuroni funzionali 11 ed è controllata da molteplici fattori e molecole di orientamento, tra cui: polysialylated neural molecola di adesione cellulare (PSA-NCAM) 12, ephrins 13, integrine 14, Slits 15, fattori di crescita e neurotrasmettitori 16 17, tuttavia i meccanismi molecolari alla base di questo processo non sono pienamente compresi. Indagare le vie di segnalazione intracellulare che regolano la migrazione neuroblasti non solo fornirà una migliore comprensione della neurogenesi adulta, ma contribuirà anche allo sviluppo della nuova terapeuticaapprocci per promuovere la riparazione del cervello. Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per studiare il ruolo dei regolatori candidati migrazione neuroblasti in vitro utilizzando nucleofection e un saggio di migrazione 3D. Nucleofection è una tecnica di trasfezione cellulare basato su un metodo migliorato di elettroporazione. Cell-tipo di corrente elettrica specifica e la soluzione nucleofection consentire il trasferimento di macromolecole polianionici come il DNA e shRNA vettori e oligonucleotidi siRNA direttamente nel nucleo della cellula e licenza di trasfezione lentamente divisione o mitoticamente cellule inattive, come i neuroni embrionali di mammifero e 18. Questo metodo è veloce, relativamente facile da eseguire ei risultati in trasfezione altamente riproducibile di una vasta gamma di tipi di cellule inclusi neuroblasti primarie e neuroni 19-21. Dissociazione del tessuto RMS consente l&#39;isolamento di neuroblasti migratori, che può essere nucleofected successo con DNA / SHRVettori NA o oligo siRNA targeting per geni di interesse. Dopo nucleofection, neuroblasti sono reaggregated in appeso gocce e successivamente incorporate in una matrice tridimensionale Matrigel. Queste condizioni consentono di neuroblasti migrano degli aggregati cellulari riassumono la modalità di migrazione osservato in vivo, fornendo così un ottimo sistema modello per studiare vie di segnalazione coinvolte nella migrazione neuroblasti e di valutare l&#39;influenza dei trattamenti farmacologici sulla motilità di queste cellule.

<table><tbody><tr><td>Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Tripsina-EDTA (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>negozio 200 &; l aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>DNAsi I Fiala (D2)</td><td>Worthington</td><td>LK003170</td><td>&ge; 1.000 unità per fiala; negozio 50 &micro; l aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale per vitello (FCS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3007902</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di D-(+)-glucosio (45%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrice di membrana basale, fattore di crescita ridotto (GFR), senza rosso fenolo, 10 ml, senza LDEV</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>preparare 120 &micro; l aliquote a 4 gradi C, quindi conservare a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich 441242</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>BDH</td><td>102745C</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Chemical</td><td>BPE9701-100</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio a fluorescenza Dako</td><td></td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Kit di nucleofecazione del neurone di ratto</td><td>Lonza</td><td>VPG-1003</td><td></td></tr><tr><td>Kit di nucleofecazione del neurone di topo</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>Coltello microchirurgico</td><td>Angiotech</td><td>7516</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain trinciatutto di tessuti</td><td>The Mickle Laboratory Engineering Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione<em&gt; in vitro</em

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

La zona subventricolare (SVZ) situata nella parete laterale dei ventricoli laterali gioca un ruolo fondamentale nella neurogenesi adulta. In questa zona ristretta del cervello, le cellule staminali neurali proliferano e costantemente generano neuroblasti che migrano tangenzialmente in catene lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) per raggiungere il bulbo olfattivo (OB). Una volta in OB, neuroblasti passare alla migrazione radiale e poi differenziarsi in neuroni maturi capaci di integrare nella rete neuronale preesistente. Migrazione corretta neuroblast è un passo fondamentale nella neurogenesi, garantendo la corretta maturazione funzionale dei neuroni neonati. Data la capacità di neuroblasti SVZ derivati ​​per indirizzare le aree lese del cervello, indagando i meccanismi intracellulari alla base della loro motilità non solo migliorare la comprensione della neurogenesi, ma può anche favorire lo sviluppo di strategie neurorigenerativo. Questo manoscritto descrive una dettagliataprotocollo per la trasfezione di roditore primaria RMS neuroblasti postnatale e l&#39;analisi della loro motilità con un 3D in vitro migrazione saggio di ricapitolare le loro modalità di migrazione osservato in vivo. Entrambi i ratti e topi neuroblasti possono essere rapidamente ed efficacemente trasfettate via nucleofection sia con DNA plasmidico, piccolo tornante (sh) RNA interferenti o corto (si) oligo RNA mira geni di interesse. Per analizzare la migrazione, le cellule nucleofected sono reaggregated in &quot;gocce appesi&quot; e successivamente incorporate in una matrice tridimensionale. Nucleofection di per sé non altera in modo significativo la migrazione dei neuroblasti. Il trattamento farmacologico dei neuroblasti nucleofected e reaggregated può essere eseguita anche per studiare il ruolo delle vie di segnalazione coinvolte nella migrazione neuroblasti.

Neuroblasti possono essere isolati con successo da Dissected tessuto RMS (Figura 1A) e incorporati in una matrice tridimensionale. Le cellule isolate sia da ratto o RMS postnatali mouse sono immunopositive per i marcatori neuroblasti migratori, come doublecortin (DCX), βIII tubulina o PSA-NCAM (Figure 1B-C). Neuroblasti dissociate possono essere efficacemente nucleofected con il DNA (ad es. Un plasmide GFP-codifica, Figura 2) o plasmidi shRNA (Figura 4) per ottenere la deplezione proteica, che può essere valutata mediante analisi western blot (Figura 4B) o immunofluorescenza (non mostrato) . Le cellule nucleofected con plasmidi-GFP codifica migrano radialmente cluster neuroblasti reaggregated (Figura 3a). Quantificazione di relativa migrato a distanza 24 ore dopo l&#39;incorporamento (Figura 3B) mostra alcuna differenza di migrazione tra GFP-posit<html> ive cellule e cellule, nonnucleofected GFP-negativi (Figura 3C), indicando che nucleofection di per sé non interrompe la migrazione. Non vi è inoltre alcuna differenza significativa nel grado di migrazione tra neuroblasti nucleofected e neuroblasti migrano direttamente su espianti RMS (dati non riportati). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Dissezione dei neuroblasti RMS. (A) Rappresentazione schematica di RMS neuroblasti dissezione. Per una descrizione dettagliata si rimanda al testo. (B) isolate le cellule di RMS ratto sono immunopositive per i produttori di neuroblasti migratori DCX e tubulina βlll. Bar, 20 micron. (C) Le cellule che migrano su topo RMS espianti esprimono la neuroblast migratorio marcatori DCX e PSA-NCAM. Bar, 20 micron.0989/50989fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Neuroblasti nucleofection Mouse. Dissociata del mouse RMS neuroblasti sono stati nucleofected con PMAX-GFP, reaggregated, incorporati in una matrice tridimensionale e permesso di emigrare per 6 ore. Neuroblasti migrano da un cluster di cellule reaggregated (in alto, foto, contrasto di fase) mostrano un&#39;elevata efficienza di trasfezione (basso, le foto del canale GFP). I pannelli della colonna di destra mostrano le immagini di ingrandimento più elevati corrispondenti alle inserti evidenziati nei pannelli della colonna di sinistra. Bar, 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:c<html> ONTENUTO-width = src &quot;6in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 3. 3D test di migrazione. (A) neuroblasts ratto sono stati nucleofected con PMAX-GFP (GFP) o pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), reaggregated, incorporato in una matrice e lasciato a migrare per 24 ore. Le cellule sono state poi fissate e immunoistochimica per GFP (verde) e βIII tubulina (rosso). Bar, 50 pm. (B) Misurare distanza migrazione utilizzando ImageJ. Il cluster di cellule reaggregated è suddiviso in 6 settori uguali. La distanza tra il bordo del cluster (linea tratteggiata) e la più lontana cella migrato viene misurata per ciascun settore. (C) Quantificazione della distanza relativa migrato dalle cellule nucleofected, cellule nonnucleofected (GFP-positive) e di controllo (GFP-negativi) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figura 4&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 4. Monitoraggio migrazione neuroblasti dopo shRNA nucleofection. (A) neuroblasts ratto sono stati nucleofected con un shRNA vettore di controllo (PCA-b-EGFPm5 Silencer 3, che esprime anche EGFP 23) o lo stesso vettore contenente un shRNA mira fascin, an-actina bundling proteina 24. Le cellule sono state reaggregated oltre 48 ore, incorporati nella matrice e lasciato a migrare per 24 ore. Aggregati sono stati poi fissati e immunoistochimica per GFP (verde) e βIII tubulina (rosso). Bar, 50 pm. (B) fascina Efficace esaurimento può essere rilevato 50 ore dopo shRNA nucleofection da analisi western blot. Actina è mostrato come un controllo di carico (C) Analisi quantitativa di relativa distanza di migrazione mostrando che la deplezione fascina ostacola seriamente la migrazione neuroblasti. (Media ± SEM; ** p &lt;0.01, n = 3 esperimenti indipendenti). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.

Migrazione neuroblasti è un passo fondamentale nella neurogenesi postnatale. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per studiare il ruolo dei regolatori candidati migrazione neuroblasti impiegando DNA / piccolo tornante RNA (shRNA) nucleofection e un saggio di migrazione 3D con neuroblasti isolati dal flusso migratorio rostrale roditore postnatale.

Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

L'obiettivo generale di questa procedura è trasfettare neuroblasti primari postnatali di roditore al fine di esaminare l'effetto di proteine bersaglio sulla loro migrazione. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando i neuroblasti dal flusso migratorio rostrale dei roditore. Il secondo passaggio consiste nel dissociarli e trasfettarli mediante nucleofezione con DNA o S-H-R-N-A.Successivamente, i neuroblasti vengono riaggregati in gocce sospese e quindi coltivati in sospensione per un tempo appropriato. L'ultimo passaggio consiste nell'includere i cluster di neuroblasti riaggregati in una matrice tridimensionale e lasciarli migrare. Infine, la migrazione dei neuroblasti viene analizzata mediante microscopia a immunofluorescenza o microscopia a riprese successive.Questo metodo può contribuire a rispondere a una domanda fondamentale nel campo della neurogenesi, come ad esempio il controllo della migrazione dei neuroblasti derivati da cellule staminali nel cervello postnatale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è relativamente semplice e rapida rispetto all'uso di vettori virali, che possono risultare complessi e richiedere molto tempo. Dopo l'eutanasia di una cucciolata di ratti da P6 a P7, effettuare un'incisione cutanea postero-anteriore lungo la sutura sagittale mediana, dal naso al cervelletto, con una lama di bisturi su ciascun ratto.Successivamente, rimuovere la pelle. Ripetere lo stesso taglio lungo il cranio. Quindi, rimuovere delicatamente le falde craniche con pinze e asportare con attenzione il cervello insieme ai bulbi olfattivi utilizzando una spatola.Successivamente, tagliare la parte più caudale del cervello e scartarla. In seguito, tritare il tessuto cerebrale in fette coronali spesse 1,4 millimetri utilizzando un tritacervelli. Trasferire le fette in una piastra contenente mezzo di dissezione freddo.Quindi osservare le sezioni al microscopio stereoscopico. Separarle con attenzione utilizzando un ago. Il flusso migratorio rostrale appare come un'area traslucida di forma triangolare al centro delle sezioni del bulbo olfattivo e come una piccola area circolare.In sezioni cerebrali più coddle, tagliare la RMS da ciascuna sezione utilizzando un coltello microchirurgico, avendo cura di evitare di includere tessuto circostante. Successivamente, raccogliere i frammenti di RMS con una pipetta Pasteur di plastica e posizionarli in una piccola capsula contenente mezzo di dissezione freddo su ghiaccio. Quindi ruotare delicatamente la capsula per raccogliere i frammenti di RMS al centro del recipiente.Raccogliere i frammenti con una pipetta di plastica e trasferirli in un tubo da 15 millilitri. Lasciare che i frammenti si depositino sul fondo del tubo. Sostituire il mezzo di dissezione con due millilitri di mezzo di dissociazione T tri.Valutare i frammenti RMS pipettando delicatamente su e giù la sospensione di frammenti per circa 10 volte utilizzando una pipetta P1000. Lasciare il tubo con i frammenti di tessuto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per due minuti. Successivamente, pipettare nuovamente la soluzione per 10 volte e verificare che i frammenti si siano dissociati.Quindi inattivare la tripsina aggiungendo cinque millilitri di DMEM preriscaldito più 10% FCS e centrifugare la sospensione cellulare a 433 × g per cinque minuti. Rimuovere il mezzo in eccesso e risospendere. Risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente in un millilitro di DMEM preriscaldato più 10% FCS, quindi aggiungere altri quattro millilitri dello stesso mezzo.Quindi eseguire un conteggio cellulare. È richiesto un minimo di 2,5 × 10⁶ cellule per ogni nucleo affezione per ottenere risultati ottimali, utilizzando da tre a quattro × 10⁶ cellule per nucleo affezione.Centrifugare la sospensione cellulare a 433 ×g per cinque minuti. Successivamente, rimuovere la maggior quantità possibile di mezzo in questo passaggio. Sospendere immediatamente il pellet cellulare nella soluzione per nucleo affezione neuronale di ratto precedentemente incubata.A temperatura ambiente, trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare in ciascun tubo EOR contenente SI R-N-A-D-N-A. Quindi, mescolare delicatamente pipettando due o tre volte con una pipetta P 200. Successivamente, aggiungere il campione in fondo al vettore di affinamento nucleare, avendo cura di non generare bolle d'aria.Per la nucleoaffezione, utilizzare il programma G-0-13 per cellule di ratto o O-0-0-5 per cellule di topo. Successivamente, aggiungere rapidamente un millilitro di DMEM preriscaldato più 10% di FCS al campione nucleoaffetto. Trasferire il campione in una provetta da 15 millilitri contenente cinque millilitri di DMEM preriscaldato più 10% di FCS, utilizzando la pipetta di plastica fornita nel kit per nucleoaffezione.Quindi centrifugare il campione a 433 ×g per cinque minuti. Rimuovere con attenzione tutto il mezzo in eccesso e risospendere il pellet in 25-30 microlitri di DMEM preriscaldito più 10% FCS utilizzando una pipetta P20. Non utilizzare più di 30 microlitri di mezzo.In seguito, pipettare la sospensione sotto forma di goccia sulla faccia interna del coperchio di una piastra P 35. Quindi capovolgere il coperchio sulla piastra P 35 contenente due millilitri di mezzo completo. Lasciare nell'incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per almeno cinque ore.Dopo cinque ore, trasferire le gocce sospese dal coperchio nel mezzo completo presente nella piastra. Utilizzare una pipetta P 1000 con punta tagliata. Quindi incubare i campioni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore per le infezioni nucleari del DNA NU, oppure per 48 ore per le affezioni nucleari di SI A HRA.Ora preparare 25 millilitri di mezzo completo e preriscaldarli a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per alcune ore. Nel frattempo, prelevare le aliquote congelate della matrice della membrana basale dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelarle sul ghiaccio in ambiente refrigerato. Per ogni nucleo affetto, preparare una piastra da sei centimetri contenente fino a otto coprislip sterili da 13 millimetri.Posizionare le piastre su una scatola frigo coperta con pellicola trasparente. Per mantenere l'umidità, posizionare una striscia di carta assorbente inumidita all'interno di una piastra da 15 centimetri che verrà utilizzata per contenere fino a tre piastre da sei centimetri contenenti blastocisti con embrioni inclusi. Successivamente, aggiungere il mezzo completo alla matrice haw in un rapporto di uno a tre, trasferire gli aggregati cellulari ricostituiti in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 433 ×g per cinque minuti.In seguito, rimuovere il mezzo in eccesso e risospendere il pellet in 10 microlitri di mezzo completo. Quindi, depositare 2 microlitri di sospensione di aggregati cellulari su ciascun'ansa sterile. Aggiungere 18 microlitri di miscela di mezzo completo con matrice e utilizzare la punta della pipetta per distribuire uniformemente la matrice su tutta la superficie dell'ansa.Posizionare immediatamente la piastra da sei centimetri contenente i coverslip nella piastra da 15 centimetri. Trasferire la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 15-20 minuti. Dopo che la matrice si è solidificata, aggiungere delicatamente cinque millilitri di mezzo completo a ciascuna piastra da sei centimetri e premere verso il basso eventuali coverslip galleggianti con la punta della pipetta, quindi incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di carbogeno per consentire ai neuroblasti di migrare fuori dagli aggregati cellulari.In questa figura, si mostra che le cellule isolate dal RMS del ratto sono immuno positive per i marcatori dei neuroblasti migratori DCX e tubulina beta tre. E questa figura mostra che i marcatori dei neuroblasti migratori DCX e PSA-NCAM sono espressi nelle cellule che migrano fuori dal RMS del topo. Per esaminare l'affezione nucleare dei neuroblasti del topo, i neuroblasti del RMS del topo dissociati sono stati nucle affetti con GFP, riaggregati, inclusi in una matrice tridimensionale e lasciati migrare per sei ore.Il neuroblasto che migra fuori da un aggregato cellulare riaggregato mostra un'elevata efficienza di trasfezione. Qui, i neuroblasti di ratto sono stati nucleofettati con due plasmidi diversi che codificano per la GFP, riaggregati e inclusi in una matrice, quindi lasciati migrare per 24 ore. Le cellule sono state quindi fissate e sottoposte a immunomarcatura per la GFP e per la tubulina beta tre per misurare la distanza di migrazione.L'aggregato cellulare viene diviso in sei settori uguali e per ciascun settore viene misurata la distanza tra il bordo dell'aggregato e la cellula migrata più lontana. Questa figura mostra la quantificazione della distanza relativa percorsa dalle cellule interessate dal NUCLE positive al GFP e dalle cellule di controllo negative al GFP non interessate dal NUCLE, al fine di monitorare la migrazione dei neuroblasti. Dopo l'affezione del NUCLE mediante S-H-R-N-A, i neuroblasti di ratto sono stati interessati con un vettore di controllo S-H-R-N-A o con lo stesso vettore contenente una proteina legante l'HRNA e aggregante l'actina; le cellule sono state quindi riaggreghate per 48 ore, incorporate in una matrice e lasciate migrare per 24 ore.I frammenti sono stati quindi fissati e sottoposti a immunomarcatura per GFP e tubulina beta tre. Un'efficace riduzione di fastened può essere rilevata 50 ore dopo la trasfezione dei nuclei S-H-R-N-A mediante analisi Western blot, e Actin è mostrato qui come controllo di caricamento. Di seguito è riportata l'analisi quantitativa della distanza relativa di migrazione, che mostra come la riduzione di fastened comprometta significativamente la migrazione dei neuroblasti.Seguendo questa procedura, altri metodi come l'elettroporazione postnatale possono essere eseguiti per convalidare in vivo i risultati ottenuti con il saggio di migrazione NU Nuclear Affection.

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo protocollo descrive un metodo non-virale di consegna di costrutti genetici per una certa area del cervello dei roditori viventi. Il metodo consiste di preparazione plasmide, fabbricazione micropipetta, chirurgia neonatale dei cuccioli di ratto, microiniezione del costrutto,...

Gene consegna di cervello di ratto post-natale da parte di non-ventricolare iniezione plasmidi e Elettroporazione

Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

Per condurre una rapida valutazione della funzione dei geni nello sviluppo della corteccia cerebrale, si descrivono i metodi che comportano...

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

Si descrive un protocollo per tempo reale videoimaging della migrazione neuronale nel proencefalo mouse. La migrazione di viralmente-etichettati o innestate precursori neuronali è stata registrata in fettine acute vivo utilizzando ampio campo dell'imaging fluorescente con un intervallo di acquisizione relativamente rapido per studiare le diverse fasi di migrazione cellulare, comprese le durate delle fasi stazionaria e migrazione e la velocità di migrazione.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

Controllare l'espansione delle cellule staminali somatiche è un freno notevole loro studio e l'uso in terapia. Qui si descrive un sistema per controllare temporalmente neurale espansione delle cellule staminali durante lo sviluppo e adulta, che può essere utilizzato per aumentare il numero di neuroni generati nel cervello di topo.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

In questo protocollo, descriviamo come iniettare lentivirus nella cavità amniotica del topo a E7.5, portando a una trasduzione uniforme dell'intera piastra neurale, con effetti dannosi minimi sulla sopravvivenza o sullo sviluppo embrionale.

Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Qui, descriviamo un sistema di nucleofecazione progettato per migliorare l'efficienza del rilascio genico in cellule staminali neurali espanse (NSC) isolate dalla zona subventricolare murina adulta. I risultati dimostrano che questo metodo migliora significativamente la perturbazione genica nelle NSC, superando l'efficacia dei protocolli di trasfezione tradizionali e migliorando il tasso di sopravvivenza cellulare.

Isolamento, espansione e nucleofezione di cellule staminali neurali dalla zona subventricolare murina adulta

Impara la nucleofezione di neuroblasti di roditori per studiare la migrazione cellulare in un saggio 3D. Questo metodo offre un approccio efficiente per analizzare la neurogenesi postnatale in vitro.

Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione

Esplora altri video