Isolamento di ghiandole multicellulari vitali dal tessuto della pianta carnivora, Nepenthes

Lo scopo del metodo presentato è ottenere ghiandole singole e pure da tessuto vegetale fresco per l'analisi molecolare. Questo si ottiene innanzitutto raccogliendo un bocciolo dalla pianta di nepenthes. Il tessuto viene quindi fissato direttamente su una piattaforma microcampionatrice su ghiaccio per mantenerlo fresco.

Durante la procedura di microcampionamento, le ghiandole vengono isolate con precisione e trasferite nel tubo PCR prima di eseguire l'analisi di PCR quantitativa sul materiale raccolto. In definitiva, la tecnologia meccanica di microcampionamento viene utilizzata per ottenere ghiandole singole e pure da piante di napes, al fine di fornire rapidamente e in modo minimamente invasivo tessuti specifici per ulteriori analisi molecolari. Le piante carnivore sono specialiste tra la flora poiché sono in grado di digerire proteine animali.

La nostra conoscenza su come ciò funzioni a livello molecolare è ancora limitata. Un buon modello per affrontare questa domanda è la combinazione di immagini dell'appendice geniale, poiché possiede organi distinti, immagini che producono ghiandole, le quali contribuiscono ai processi digestivi. Nell'appendice.

Queste ghiandole si trovano all'interno delle immagini in basso. Per l'analisi molecolare, è necessario isolare queste strutture ampie e piatte, con un diametro di circa 100-200 micrometri, direttamente dal tessuto fresco. A complicare ulteriormente le cose, le ghiandole sono ricoperte da un cappuccio protettivo.

Avendo una struttura simile a un posto auto coperto, che richiede osservazioni tridimensionali durante il campionamento, nonché uno strumento in grado di muoversi in tre dimensioni con delicatezza. Abbiamo appreso che le attuali tecniche di microdissezione non erano state progettate per risolvere i nostri problemi. Un laser, ad esempio, ha fallito a causa dell'elevato contenuto di acqua nel tessuto vegetale.

Pertanto, abbiamo deciso di utilizzare una nuova tecnica meccanica di microdissezione chiamata aika, specificamente per isolare parti di tessuti o persino singole cellule di strutture tridimensionali. Tale tecnica consiste in un microscopio stereoscopico o som (sum) in cui è integrato un micromanipolatore 3D in modo da poter raggiungere agevolmente oggetti molto piatti o molto alti. Si muove semplicemente insieme al microscopio come un pilastro; per campionare sulle piante, si utilizzano spesso micropipette.

Tuttavia, nel caso del vetro appendicolare, abbiamo riscontrato che la pinzetta microforzata azionata da PTO funziona in modo più efficace per la nostra procedura. Per l'appendice, la piattaforma è stata modificata. Un piccolo stadio VXY sostiene un contenitore per campioni riempito di ghiaccio, di dimensioni sufficienti a contenere sia il campione di tessuto con il suo supporto sia il punto in cui la ghiandola dovrà essere depositata.

Il ghiaccio fa sì che i processi di degradazione all'interno del tessuto vengano rallentati al punto da permettere di riconoscere lo stato molecolare originale del tessuto. La seguente procedura è stata eseguita a partire dalla porzione inferiore di un'immagine. Viene escissa una porzione di circa uno-due centimetri quadrati, che viene quindi appiattita.

Il tessuto viene quindi fissato su un vetrino mediante nastro adesivo doppia faccia. Questo campione di tessuto è ricoperto con acqua priva di RNAsi ed è mantenuto umido durante il processo di campionamento. Il campione viene poi posizionato con le ghiandole e i cappucci protettivi rivolti verso il lato del manipolatore.

L'angolo tra campione e strumento deve essere regolato in modo che le ghiandole giacciano piatte. Utilizzando un palco universale, l'inclinazione può essere regolata su due assi ed essere corretta facilmente al microscopio. Il palco metallico mantiene il campione freddo sotto il microscopio.

Le ghiandole sono ben distinte. La fluorescenza aiuta a riconoscere facilmente il contorno sia della ghiandola che del cappuccio protettivo. Il campione viene osservato attraverso un filtro FSE per l'isolamento delle ghiandole.

Per l'estrazione dell'RNA, si utilizza un filtro UV. Una posizione molto precisa delle pinzette microchirurgiche è essenziale per l'isolamento della ghiandola. Si raccomanda di manovrare lo strumento in modalità a bassa velocità.

Con la pinzetta microforza, si avvicina una ghiandola e le braccia vengono posizionate ai suoi margini mediante joystick; quindi la pinzetta microforza viene chiusa delicatamente. La ghiandola viene quindi sollevata dal tessuto circostante. Dopo un isolamento preciso, si può osservare la cavità intatta che mostra il tessuto vascolare sottostante.

La ghiandola isolata viene quindi trasferita nel tubo PCR e depositata nel buffer preparato. Per convalidare questo metodo, è stata determinata l'espressione genica della proteina corta della gamba atoma, TAP, che viene secreta nella goccia di fluido; il gene può essere amplificato direttamente dalle ghiandole senza una pregressa estrazione del DNA genomico. Basta aggiungere la miscela di reazione PCR al tessuto isolato.

La serie di esperimenti ha coinvolto ghiandole provenienti da piante di nepente sottoposte a diversi trattamenti, nonché campioni dei relativi tessuti epidermici circostanti. Per ogni esperimento è stato estratto l'RNA totale. L'mRNA ottenuto è stato tradotto nel corrispondente cDNA mediante trascrizione inversa ed utilizzato per la successiva reazione di PCR.

Per amplificare la sequenza genica di interesse, è stata utilizzata la PCR in tempo reale per confrontare il livello di espressione della TLP nelle ghiandole e nell'epidermide di nepenthes. I risultati mostrano che il livello di trascritto della TLP è più elevato nelle ghiandole secernenti rispetto al tessuto epidermico sia in nepenthes allotta che in nepenthes miis, come visualizzato da un rapporto tra tessuto epidermico e tessuto ghiandolare inferiore a uno, per verificare se il contatto con la preda possa indurre l'espressione genica. I livelli di trascritto della TLP e immagini non trattate e immagini alimentate con drosophila melanogaster sono stati confrontati dopo l'assunzione della preda.

Il tessuto epidermico ha mostrato qui un'espressione più elevata di TLP. È stato confrontato il livello di trascritto di TLP nelle ghiandole e nel tessuto epidermico e un'immagine trattata di nepenthes miis. L'upregolazione dell'espressione di TLP in entrambi i tipi di tessuto indica che la produzione di proteine del fluido pitcher può effettivamente essere indotta dalla presenza di prede.

I risultati della PCR suggeriscono che l'alimentazione modifica efficacemente l'espressione di TLP in entrambi i tipi di tessuto e può alterare il rapporto di espressione tra ghiandola ed epidermide. Abbiamo sviluppato un metodo efficiente per raccogliere il materiale da tessuto di apice FA e isolare una quantità sufficiente di mRNA per condurre esperimenti di espressione genica. Con questo nuovo metodo sviluppato, è non solo possibile analizzare la trascrittomica nelle ghiandole dell'apice, ma in aggiunta a ciò, possiamo anche affrontare la metabolomica e la proteomica.