Name: Isolamento di ghiandole multicellulari vitali dal tessuto della pianta carnivora, Nepenthes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-22T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Scopri la tecnica di micropreparazione meccanica per isolare ghiandole vitali da Nepenthes. Questo metodo consente analisi molecolari e biochimiche dettagliate delle strutture specializzate nella biosintesi.

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Ringraziamo il team della serra presso l'MPI-CE presso l'Orto Botanico dell'Università Friedrich Schiller, Jena, per la coltivazione delle piante e Wilhelm Boland e la Max Planck Society per il supporto.

1. Preparazione del materiale vegetale
<ol>
	<li>Tutte le specie di Nepenthes sono state coltivate nelle serre dell'MPI per l'ecologia chimica o nell'Orto botanico di Jena, in Germania.</li>
	<li>Per la preparazione del tessuto secernente, prelevare una brocca e rimuovere il terzo superiore, compreso il coperchio, il peristoma e la zona scivolosa. La caraffa può essere utilizzata fresca o congelata in azoto liquido e conservata a -80 °C.</li>
</ol>
2. Microdissezione del tessuto dell'ascidio
<ol>
	<li>La piattaforma di microcampionamento è costituita da uno stereomicroscopio e da un micromanipolatore, che è collegato direttamente al corpo del microscopio ed è azionato da un joystick 3D. Qui, un primo prototipo di aureka è stato utilizzato come documentato (Figura 2A).</li>
	<li>Per la dissezione delle ghiandole secretorie dagli ascidi di Nepenthes utilizzare una micropinza e attaccarla al manipolatore (Figure 2A e 2B).</li>
	<li>Per l'estrazione dell'RNA, trattare tutti gli strumenti (lame di rasoio, pinzette, micromanipolatore, micropinze, vetrino per oggetti) con RNaseZAP.</li>
	<li>Preparare le provette di raccolta aggiungendo 9 μl di acqua priva di nucleasi e 1 μl di inibitore della RNasi in una provetta PCR per l'estrazione dell'RNA. Per la PCR diretta da campioni di tessuto, utilizzare solo acqua priva di nucleasi (10 μl).
	<ol>
		<li>Prendi la brocca fresca o congelata e rimuovi un pezzo di tessuto di 1-2 cm2 contenente le ghiandole secretorie usando una lama di rasoio e una pinzetta. Lavare il fazzoletto con acqua; aggiungere lo 0,1% di dietilpirocarbonato (DEPC) se l'RNA verrà estratto.</li>
		<li>Fissare il materiale vegetale con nastro biadesivo su un vetrino per oggetti (la superficie coperta dal pressacavo deve essere rivolta verso l'alto, Figure 2C e 2D) e fissare il vetrino con nastro adesivo su un tavolino universale, che deve essere applicato con un tavolo mobile.</li>
		<li>Per l'estrazione degli acidi nucleici la preparazione deve essere fatta con ghiaccio. Prendete quindi una scatola piatta di polistirolo, posizionate all'interno il tavolino universale contenente il campione e riempite la scatola di ghiaccio. Successivamente, posizionare la scatola sotto il microscopio.</li>
		<li>Per la preparazione il posizionamento delle ghiandole è molto importante. Le ghiandole secretorie sono parzialmente coperte da un cappuccio protettivo (Figura 3) e accessibili solo dalla pinza da un lato. Inoltre, l'angolo del campione rispetto alla pinza deve essere regolato inclinando la tavola del tavolino universale di circa 135°, a seconda della specie di Nepenthes.</li>
		<li>La microdissezione viene eseguita sotto controllo visivo. Per l'isolamento delle ghiandole, utilizzare un filtro non UV, per limitare la degradazione di DNA e RNA.</li>
		<li>Spostare il micromanipolatore e la pinza tramite il pannello di controllo fino al pressacavo selezionato. Una volta raggiunta la ghiandola, posizionare ciascun braccio della pinza su entrambi i lati della ghiandola. Rimuovere la ghiandola dal tessuto rimanente chiudendo la pinza (Figura 4A).</li>
		<li>Dirigere il premistoppa attaccato alla pinza lontano dall'oggetto e al tubo di raccolta. Portare le punte delle pinze a contatto con la soluzione nel tubo (Figura 4B). Il rilascio della ghiandola aprendo la pinza deve essere ben osservato, perché le ghiandole tendono ad attaccarsi alla punta dell'utensile. Il tessuto può essere conservato a -80 °C fino all'estrazione con PCR o RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Amplificazione diretta della PCR dal tessuto Nepenthes
<ol>
	<li>Per dimostrare l'efficienza del metodo di preparazione, è possibile eseguire un approccio PCR direttamente dal tessuto ghiandolare senza una fase di estrazione del DNA.</li>
	<li>Per l'amplificazione della PCR utilizzare primer gene specifici; qui codificano per la sequenza di una proteina thaumatin-like (TLP) (forward: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', reverse: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAAACAAC-3').
	<ol>
		<li>Raccogliere 1-5 ghiandole in una provetta per PCR contenente 10 μl di acqua priva di nucleasi. Per una reazione da 50 μl aggiungere 5 μl di tampone Taq 10x, 1 μl 10 mM di deossinucleosidi trifosfati (dNTP), 3 μl 25 mM MgCl2, 0,4 μl (1,25 U) di Taq DNA polimerasi, 1 μl (100 pmol) di ciascun primer e 28,6 μl di acqua priva di nucleasi.</li>
		<li>Eseguire le reazioni di PCR in un termociclatore con il seguente programma: denaturazione iniziale a 94 °C per 3 minuti; 35 cicli di denaturazione (94 °C per 30 secondi), ricottura (59 °C per 30 secondi) e prolungamento (72 °C per 1 minuto); e una fase finale di estensione di 10 minuti a 72 °C.</li>
		<li>Dimostrare l'amplificazione del prodotto PCR utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio. Utilizzare quindi l'agarosio all'1,5% (p/v) e scioglierlo in 1 tampone TAE (40 mM di base Tris, 20 mM di acido acetico glaciale, 1 mM di EDTA, pH 8). Scaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando l'agarosio non si sarà sciolto. A 100 ml di soluzione di agarosio, aggiungere 1 μl di bromuro di etidio (10 μg/μl) per la visualizzazione a valle. Far funzionare il gel in 1x tampone TAE a 300 V, 115 mA per circa 20 minuti in una camera di elettroforesi. La dimensione corretta dell'amplicone TLP deve essere a 690 bp.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Estrazione dell'RNA da piccoli campioni di tessuto e trascrizione inversa
<ol>
	<li>Eseguire i seguenti passaggi sul ghiaccio. Per l'estrazione dell'RNA sono stati utilizzati due metodi di estrazione, un Micro Kit per l'estrazione dell'RNA totale e un kit di isolamento dell'mRNA applicato con biglie magnetiche.</li>
	<li>Raccogliere almeno 30 ghiandole secretorie mediante micropreparazione in una provetta PCR contenente 1 μl di inibitore della RNasi e 9 μl di acqua priva di nucleasi. Successivamente lisare il tessuto in un termociclatore per 10 minuti a 75 °C.</li>
	<li>Estrazione dell'RNA totale.
	<ol>
		<li>Dopo la preparazione, aggiungere 90 μl di soluzione di lisi al campione e incubare per 10 minuti a 75 °C. Successivamente caricare la miscela di reazione sulla colonna (fornita con il kit) e procedere con le fasi di lavaggio come descritto nel manuale del produttore.</li>
		<li>Eluire l'RNA due volte con 10 μl di soluzione di eluizione e continuare con il trattamento con DNasi I.</li>
		<li>Ai 20 μl di RNA estratto, aggiungere 2 μl di tampone 10x DNasi I e 1 μl di DNasi I (fornito con il kit di estrazione dell'RNA) e incubare 1 ora a 37 °C. Arrestare la reazione aggiungendo 2 μl di reagente di inattivazione DNasi e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. Dopo una fase di centrifugazione per 1,5 minuti alla massima velocità, l'RNA può essere trasferito in una provetta fresca priva di RNasi. Determinare la concentrazione di RNA di ciascun campione utilizzando uno spettrofotometro. I campioni devono essere conservati a -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Estrazione dell'mRNA mediante biglie magnetiche.
	<ol>
		<li>Regolare il volume del campione a 100 μl con il tampone di lisi/legante (fornito nel kit) e incubare per 10 minuti a 75 °C. Aggiungere 20 μl di biglie magnetiche fornite con una sporgenza Oligo (dT)25 e mescolare la reazione per 5 minuti a temperatura ambiente. L'mRNA si lega attraverso la coda di poli(A) alla sporgenza dell'Oligo (dT)25 delle perle.</li>
		<li>Eseguire le fasi di lavaggio dell'mRNA legato alle biglie magnetiche seguendo il protocollo del produttore. Le soluzioni possono essere rimosse utilizzando un magnete. Risospendere le perle in 20 μl di tampone Tris-HCl da 10 mM (pH 7,5).</li>
		<li>Rimuovere le contaminazioni del DNA genomico trattando il campione con 2U (1 μl) di DNasi (2 μl di tampone DNasi 10x e 17 μl di acqua priva di nucleasi) per 1 ora a 37 °C. Successivamente, la soluzione enzimatica viene rimossa dal magnete e le microsfere vengono risospese in 20 μl di tampone Tris-HCl da 10 mM. Non è possibile misurare la concentrazione di RNA poiché è attaccato alle perline. I campioni devono essere conservati a -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per la trascrizione inversa utilizzare un kit di sintesi del cDNA. Le reazioni sono state eseguite seguendo il protocollo del produttore.
	<ol>
		<li>Per la trascrizione inversa dell'RNA totale, aggiungere 1 μl (100 pmol) di primer Oligo (dT)20 o 1 μl (0,4 μg) di esameri casuali, 1 μl di inibitore della RNasi e 1 μl di miscela dNTP da 10 mM a 1 μg di RNA e regolare il volume a 14 μl con acqua priva di nucleasi. Incubare a 65 °C per 5 minuti e successivamente porre i campioni sul ghiaccio. Aggiungere 1 μl di DTT 0,1M, 1 μl di trascrittasi inversa e 4 μl di tampone RT 5x. Le reazioni vengono incubate per 55 minuti a 50 °C, seguite da una fase di inattivazione a 70 °C per 10 minuti. Dopo la trascrizione inversa, i campioni possono essere conservati a -20 °C.</li>
		<li>Per l'mRNA legato alle biglie magnetiche, sostituire il tampone Tris-HCl con la prima miscela di reazione (1 μl di inibitore della RNasi, 1 μl di miscela dNTP da 10 mM e 12 μl di acqua priva di nucleasi) e incubare per 5 minuti a 65 °C. A causa della sporgenza Oligo (dT)25 delle perline, non è necessario aggiungere un primer Oligo (dT)20 o esameri casuali ai campioni. Successivamente seguire il protocollo sopra (passaggio 4.5.1).</li>
		<li>Misurare la concentrazione di cDNA con uno spettrofotometro. Conservare i campioni a -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. PCR in tempo reale
<ol>
	<li>Per le analisi con Real-time PCR utilizzare l'RNA totale estratto con il Micro Kit e un SYBR Green QPCR Master Mix. Per garantire una quantità uguale di trascritti, regolare la concentrazione di cDNA di ciascun campione allo stesso valore dopo la trascrizione inversa.</li>
	<li>Oltre ai campioni, inserire reazioni di controllo. Utilizzare un controllo senza modello per verificare la presenza di contaminanti nei reagenti e per verificare la qualità dei primer. Per verificare l'assenza di DNA genomico eseguire un controllo non-RT. Entrambe le reazioni devono essere negative (nessun segnale di fluorescenza) nella PCR in tempo reale.</li>
	<li>Per garantire un livello di trascrizione uguale tra i diversi campioni, utilizzare almeno un gene di riferimento. Qui, sono state utilizzate coppie di primer progettate che codificano per un'actina (avanti: 5'-CTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3', inverso: 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') e un 18SrRNA (avanti: 5'-CTTGATTCTATGGGGGGTGGTG-3', inverso: GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3'). Come gene bersaglio è stato scelto il TLP (forward: 5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', reverse: 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3'). La dimensione di ogni frammento amplificato era di circa 100 bp.</li>
	<li>Per una reazione di 25 μl aggiungere 12,5 μl 2x SYBR Green QPCR Master Mix, cDNA (≥20 ng), 400 nM di ciascun primer e 30 nM del colorante di riferimento passivo ROX (fornito con il kit). Regolare il volume del campione a 25 μl con acqua priva di nucleasi.</li>
	<li>Le reazioni sono state eseguite in un termociclatore QPCR con il seguente programma: denaturazione iniziale a 95 °C per 10 minuti per attivare la polimerasi; 40 cicli di denaturazione (95 °C per 30 sec), ricottura (61 °C per 60 sec) ed estensione (72 °C per 1 min); seguita dalla curva di dissociazione (95 °C per 60 sec, 55 °C per 30 sec, 95 °C per 30 sec). La curva di dissociazione è necessaria per determinare l'assenza di dimeri di primer, che può essere rilevata da un picco aggiuntivo.</li>
	<li>Determinare l'efficienza (E) di ciascuna reazione PCR utilizzando il metodo di Liu e Saint8. L'efficienza può essere deviata dalla parte lineare della curva di amplificazione. Qui il numero relativo di ampliconi (Rn, A) di un punto di ciclo (CPA) è legato alla quantità di ampliconi (Rn, B) di un altro ciclo (CPB).</li>
	<li>Analizza i risultati della PCR in tempo reale con il Relative Expression Software Tool (REST 2009, <a href="http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html" target="_blank">http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html</a>) o un software simile. Utilizzare il programma per calcolare il rapporto di espressione di un gene in un campione trattato rispetto a un controllo.</li>
</ol>

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Per molto tempo, gli studi sulle strutture secretorie delle piante, in particolare sui tricomi, sono stati eseguiti essenzialmente sull'anatomia ed erano puramente descrittivi. C'è un ampio corpus di pubblicazioni di questo tipo, come riassunto nelle recensioni di9-11. La nostra conoscenza biochimica e molecolare delle strutture secretorie delle piante è ancora limitata, nonostante alcuni lavori iniziali notevoli , ad esempio sui tricomi ghiandolari della menta, che dimostrano che i tricomi ghiandolar...

Le piante producono una grande varietà di composti con diverse applicazioni industriali e farmaceutiche, che vanno da molecole di basso peso molecolare a polimeri. Tali composti sono spesso prodotti e secreti da strutture altamente specializzate, molte delle quali localizzate sulla superficie delle piante, come i tricomi glandolari o le nettarie, oppure all'interno, come gli idioblasti o i dotti del lattice e della resina, rispettivamente. Tuttavia, si conosce relativamente poco sulla biologia di queste strutture secretorie specializzate, sebbene tutti i tipi di queste ghiandole presentino numerose caratteristiche indicative di un metabolismo attivo. In particolare, le ghiandole delle piante carnivore come Nepenthes possono essere considerate sistemi modello nella biologia cellulare vegetale1.
Le piante carnivore sono oggetto di numerosi studi dal 1875, anno di pubblicazione dell'opera di Charles Darwin 'Le piante insettivore'2Tuttavia, solo negli ultimi anni sono state condotte ricerche a livello molecolare e tuttora le nostre conoscenze sono limitate. Ad esempio, la composizione proteica del fluido digestivo nelle piante carnivore del genere *Nepenthes* Nepenthes non è ancora completamente noto. Solo recentemente sono state identificate diverse proteine idrolitiche e alcuni dei corrispondenti geni3. Nei trappole a caduta di Nepenthes (Figura 1), le ghiandole pluricellulari sono localizzate nella parte interna inferiore dei bricchi. Queste ghiandole producono e secernono enzimi digestivi nel liquido contenuto nel bricco e assorbono i nutrienti disciolti dallo stesso liquido4. Pertanto, queste ghiandole bifunzionali rappresentano un microtessuto unico con una posizione e una funzione centrali nella carnivoria di Nepenthes che merita di essere studiato in dettaglio.
<img alt="Anatomia della pianta carnivora, dettaglio dell'urna di Nepenthes, studio botanico, meccanismo della trappola, adattamento." src="/files/ftp_upload/50993/50993fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1. Urna di Nepenthes alata. La parte inferiore dell'urna contiene il liquido digestivo e le ghiandole sulla superficie interna.
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50993/50993fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
Nelle scienze vegetali, molti approcci sperimentali si basano su "materiale bulk" poiché non viene analizzato un tessuto definito, ma organi interi. Di conseguenza, la loro omogeneizzazione e analisi possono fornire risultati solo diluiti e proporzionali rispetto ai singoli tessuti e cellule5. Per risolvere questo problema, sono state sviluppate e utilizzate con successo tecniche di micropreparazione, come ad esempio la cosiddetta microdissezione laser assistita (LCM), per raccogliere tessuti vegetali specifici e analizzarne i contenuti individuali6. Tuttavia, la LCM è spesso limitata quando si mira a componenti cellulari instabili e/o rapidamente degradabili, come l'RNA. In tal caso, la necessità di una fissazione preliminare del tessuto, che richiede tempo ed è spesso accompagnata da degradazione delle biomolecole, rappresenta uno svantaggio. Inoltre, a causa dell'elevato contenuto idrico di molti tessuti vegetali e della resistenza delle pareti cellulari, la LCM ha spesso fallito nel preparare direttamente tessuti freschi7. Ogni approccio volto a studiare componenti cellulari presenti nelle ghiandole secretorie, dai geni, mRNA e proteine ai composti secondari e alla loro biosintesi, richiede tecniche alternative per la preparazione specifica. Pertanto, sono necessarie tecniche specifiche per isolare singole cellule o persino ghiandole multicellulari che rimangano integre dopo la preparazione.
Viene presentato un metodo che utilizza una piattaforma automatizzata di microcampionamento dotata di visualizzazione microscopica diretta. Questa tecnica è rapida ed efficiente nella preparazione di ghiandole singole provenienti dalle urne delle specie di Nepenthes. Queste ghiandole pluricellulari sono bifunzionali, ovvero sono coinvolte sia nei processi di secrezione che di assorbimento; sono sessili e gli strati cellulari non esposti sono impregnati per formare un endoderma. Le ghiandole intere possono essere isolate senza tessuto adiacente e depositate in modo ben definito in una provetta per PCR. Questa tecnica viene applicata per lo studio di geni specifici nonché dell'espressione genica nei tessuti delle ghiandole.

<table><tbody><tr><td>RNAqueous-Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, Germania</td><td>AM1931</td><td>Isolamento di RNA totale, 50 campioni</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, Germania</td><td>61011</td><td>5 ml Dynabeads Oligo (dT)25</td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet</td><td>Life Technologies GmbH, Germania</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript CellsDirect cDNA Synthesis System</td><td>Life Technologies GmbH, Germania</td><td>18080-200</td><td>25 reazioni</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies GmbH, Germania</td><td>10777-019</td><td>Inibitore della RNASI, 5.000 unità</td></tr><tr><td>Esaminatori casuali (0,4 &mu; g/&mu; l)</td><td>QIAGEN GmbH, Germania</td><td>79236</td><td>100 &mu; l</td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, grado di biologia molecolare</td><td>Fermentas GmbH, Germania</td><td>R0192</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi, (ricombinante)</td><td>Fermentas GmbH, Germania</td><td>EP0402</td><td>Fornito con 10 tamponi Taq (con KCl o (NH4)2SO4) e 25 mM di MgCl2</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies GmbH, Germania</td><td>AM2238</td><td>1.000 unità</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH Co. Germania</td><td>T846.3</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Scala DNA a bassa gamma, pronto all'uso</td><td>Fermentas GmbH, Germania</td><td>SM1193</td><td>50 &mu; g</td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix</td><td>Agilent Technologies, Inc., USA</td><td>600828</td><td>Kit singolo</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Carl Roth GmbH Co., Germania</td><td>CK08.1</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Carl Roth GmbH Co., Germania</td><td>2801.1 / 2855.1</td><td></td></tr><tr><td>GE Spettrofotometro NanoVue</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Germania</td><td>28-9569-62</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler gradient</td><td>Eppendorf AG, Amburgo, Germania</td><td>5331 000.010</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Stratagene, USA</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis Chamber</td><td>Biometra</td><td>Discontinued</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>aura optik gmbh</td><td>aureka aureka</td><td>Dotato di una micropinza</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germania</td><td>SteREO Lumar.V12</td><td>Dotato di un set di filtri AxioCam</td></tr><tr><td>Lumar 01</td><td>Carl Zeiss, Microscopia, Jena, Germania</td><td>485001-0000-000</td><td>Filtro UV</td></tr><tr><td>Set di filtri Lumar 09</td><td>Carl Zeiss, Microscopia, Jena, Germania</td><td>485009-0000-000</td><td>filtro non UV</td></tr></tbody></table>

isolamento di ghiandole multicellulari vitali dal tessuto della pianta carnivora, nepenthes

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Molte piante possiedono strutture specializzate che sono coinvolte nella produzione e secrezione di specifici composti e proteine a basso peso molecolare. Queste strutture sono quasi sempre localizzate sulle superfici delle piante. Tra questi ci sono i nettari o tricomi ghiandolari. I composti secreti sono spesso impiegati nelle interazioni con l'ambiente biotico, ad esempio come attrattivi per gli impollinatori o deterrenti contro gli erbivori.
Ghiandole uniche sotto diversi aspetti si possono trovare nelle piante carnivore. Nelle cosiddette piante carnivore del genere Nepenthes, le ghiandole bifunzionali all'interno della trappola a caduta da un lato secernono il fluido digestivo, compresi tutti gli enzimi necessari per la digestione delle prede, e dall'altro assorbono i nutrienti rilasciati. Pertanto, queste ghiandole rappresentano un tessuto ideale e specializzato predestinato a studiare i meccanismi molecolari, biochimici e fisiologici sottostanti alla secrezione proteica e all'assorbimento dei nutrienti nelle piante. Inoltre, in generale la biosintesi di composti secondari prodotti da molte piante dotate di strutture ghiandolari potrebbe essere studiata direttamente nelle ghiandole.
Per lavorare su tali strutture specializzate, devono essere isolate in modo efficiente, veloce, metabolicamente attivo e senza contaminazione con altri tessuti. Pertanto, è stata sviluppata e applicata una tecnica di micropreparazione meccanica per studi sul fluido di digestione Nepenthes. Qui viene presentato un protocollo che è stato utilizzato per preparare con successo singole ghiandole bifunzionali dalle trappole di Nepenthes, basato su una piattaforma di microcampionamento meccanizzato. Le ghiandole potrebbero essere isolate e utilizzate direttamente per l'analisi dell'espressione genica mediante tecniche di PCR dopo la preparazione dell'RNA.

Per la preparazione di ghiandole singole a partire dal tessuto delle bottiglie di Nepenthes, è stata sviluppata e applicata una tecnica di microdissezione meccanizzata. La piattaforma di micropreparazione deve essere dotata di micropinzette, fissate al micromanipolatore, che a loro volta sono azionate da un pannello di controllo. Le singole ghiandole, visibili al microscopio, possono essere individuate con le pinzette, che afferrano il tessuto ghiandolare e lo rimuovono meccanicamente (Figura 4A...

Le ghiandole vegetali sono strutture specializzate responsabili della biosintesi e della secrezione di molti composti coinvolti nelle interazioni con l'ambiente biotico. Per consentire lo studio delle loro caratteristiche molecolari e biochimiche, è stata messa a punto una tecnica di micropreparazione meccanica per isolare singole ghiandole metabolicamente attive, qui dalla pianta carnivora Nepenthes.

Isolamento di ghiandole multicellulari vitali dal tessuto della pianta carnivora, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Lo scopo del metodo presentato è ottenere ghiandole singole e pure da tessuto vegetale fresco per l'analisi molecolare. Questo si ottiene innanzitutto raccogliendo un bocciolo dalla pianta di nepenthes. Il tessuto viene quindi fissato direttamente su una piattaforma microcampionatrice su ghiaccio per mantenerlo fresco.Durante la procedura di microcampionamento, le ghiandole vengono isolate con precisione e trasferite nel tubo PCR prima di eseguire l'analisi di PCR quantitativa sul materiale raccolto. In definitiva, la tecnologia meccanica di microcampionamento viene utilizzata per ottenere ghiandole singole e pure da piante di napes, al fine di fornire rapidamente e in modo minimamente invasivo tessuti specifici per ulteriori analisi molecolari. Le piante carnivore sono specialiste tra la flora poiché sono in grado di digerire proteine animali.La nostra conoscenza su come ciò funzioni a livello molecolare è ancora limitata. Un buon modello per affrontare questa domanda è la combinazione di immagini dell'appendice geniale, poiché possiede organi distinti, immagini che producono ghiandole, le quali contribuiscono ai processi digestivi. Nell'appendice.Queste ghiandole si trovano all'i

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Biologia

Isolamento di ghiandole multicellulari vitali dal tessuto della pianta carnivora, Nepenthes

Qui si descrive una strategia efficace per rimuovere la seta ghiandole che producono con l'addome della femmina ragni vedova nera. Questa procedura permette l'isolamento rapido della seta producono sette distinte ghiandole in un modo altamente purificato, un importante processo di ricercatori che studiano la produzione della seta di ragno e l'assemblaggio delle fibre.

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Qui mostriamo il nostro protocollo per l'isolamento di cellule della ghiandola basali e sottomucoso condotto da trachee del mouse. Abbiamo anche dimostrare il metodo di iniezione di cellule staminali nel cuscinetto di grasso dorsale del mouse per creare...

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Questo video descrive un metodo per isolare le cellule epiteliali gastriche dal tessuto fundico umano. Le cellule epiteliali isolate possono essere utilizzate come modello in vitro per studiare i loro ruoli regolatori nella fisiologia e fisiopatologia gastrica.

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Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

Le colture derivate da cellule staminali hanno un enorme potenziale per modellare le malattie infettive. Qui viene descritta la coltura di organoidi gastrici di topo e umani derivati da cellule staminali adulte. Gli organoidi vengono microiniettati con l'agente patogeno gastrico Helicobacter pylori.

Organoidi come modello per le malattie infettive: cultura dei diritti dell&#39;uomo e organoidi stomaco murini e microiniezione dell&#39;Helicobacter Pylori

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento del mouse intero, intatto ghiandole mammarie per studiare l'espressione di matrice extracellulare (ECM) e morfologia duttale. Mouse #4 ghiandole addominali sono state estratte da topi femmine nullipare 8-10 settimane vecchio, fissato in formalina neutra tamponata, sezionato e macchiato usando immunohistochemistry per proteine ECM.

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

Qui descriviamo un protocollo per stabilire e coltura umano e del mouse-derivato organoids gastrico 3-dimensionale (3D) e il metodo per il trasferimento di organoids 3D di un monostrato di 2-dimensionale. L'uso del monolayer epiteliale gastrico come un'analisi novella di zero-ferita per studi di rigenerazione è anche descritto.

Mouse e umano-derivato cultura dello strato monomolecolare epiteliale gastrica primaria per lo studio della rigenerazione

La ghiandola lacrimale (LG) ha due tipi di cellule che esprimono α-liscio muscolo actina (αSMA): cellule miepiteliali (MECs) e pericytes. I MECs sono di origine ectodermica, trovati in molti tessuti ghiandolari, mentre i periciti sono cellule muscolari lisce vascolari di origine endodermica. Questo protocollo isola i MECs e i periciti di murine LGs.

Isolamento delle cellule Miepiteliali da adulti murina lacrimale e ghiandole sottomandibolari

Presentiamo un metodo per isolare e coltivare cellule epiteliali derivate dalla ghiandola umana primaria. Queste cellule presentano modelli di espressione genica coerenti con loro di origine epiteliale salivari e possono essere coltivate come salisfere su matrici di membrana seminterrato derivate da cellule tumorali Engelbreth-Holm-Swarm o come monostrati su piatti di coltura trattati.

Isolamento delle cellule epiteliali salivari dalle ghiandole salivari umane per la crescita in vitro come Salispheres o Monostrati

La ghiandola mammaria è una struttura bistrato, che comprende cellule epiteliali mitraeliliali ed interne interne. Presentato è un protocollo per preparare gli organoidi utilizzando la prova differenziale. Questo metodo efficiente consente ai ricercatori di manipolare separatamente questi due tipi di cellule per esplorare le domande riguardanti i loro ruoli nella forma e nella funzione della ghiandola mammaria.

Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

Viene presentato un protocollo per l'isolamento e l'arricchimento conveniente e ad alto rendimento dei tricomi ghiandolari e sessili da Cannabis sativa. Il protocollo si basa su un'estrazione secca e non tampone di tricomi utilizzando solo azoto liquido, ghiaccio secco e setacci di nylon ed è adatto per l'estrazione dell'RNA e l'analisi trascrittomica.

Isolamento non acquoso e arricchimento di tricomi ghiandolari e sessili da Cannabis sativa

Scopri la tecnica di micropreparazione meccanica per isolare ghiandole vitali da Nepenthes. Questo metodo consente analisi molecolari e biochimiche dettagliate delle strutture specializzate nella biosintesi.

Isolamento di ghiandole multicellulari vitali dal tessuto della pianta carnivora, Nepenthes

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