Valutare Miogenica risposta e Vasoactivity nelle arterie di resistenza mesenteriche Utilizzando Myography Pressione

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare l'effetto di un agente farmacologico o di uno stato patologico sul tono vascolare indotto dalla pressione in arterie mesenteriche di piccola resistenza. Questo viene raggiunto innanzitutto isolando l'arcata mesenterica da un modello murino. Il secondo passaggio consiste nel dissezionare le arterie di piccola resistenza del quarto ordine.

I passaggi successivi sono la cannullazione, la pressurizzazione e l'incubazione del preparato arterioso. Nel PSS, l'ultimo passaggio consiste nella valutazione dell'integrità fisiologica del preparato arterioso, dimostrata dallo sviluppo spontaneo del tono vascolare e da una risposta reversibile appropriata a un vasocostrittore e a un vasodilatatore. Infine, può essere misurata la costrizione indotta dalla pressione.

L'implicazione di questa tecnica riguarda la terapia o la diagnosi di ipertensione, ipotensione o disfunzione vascolare. Poiché questa tecnica identifica i meccanismi chiave alla base delle variazioni indotte dalla pressione nel tono vascolare, che rappresenta un determinante fondamentale della resistenza vascolare, della perfusione e della pressione sanguigna. Questa procedura sarà dimostrata dal Dott. Jja, che è un ricercatore post-dottorato nel nostro laboratorio.

Iniziare questa procedura caricando una cannula di vetro in un supporto per micropipetta e collegando il supporto per micropipetta a una camera di perfusione per preparare la camera di perfusione. Risciacquarla con acqua Milli Q, seguito da soluzione di dissezione per cinque minuti ciascuno. Quindi caricare la camera con due millilitri di soluzione di dissezione.

Successivamente, riempire con attenzione l'intera cannula e il tubo collegato senza generare bolle. Preparare due suture, ciascuna con un nodo semplice, utilizzando pinze atraumatiche sotto il microscopio per dissezione. Utilizzare le pinze da dissezione per inserire entrambe le cannule con i nodi di sutura parzialmente chiusi leggermente distanti dalla punta.

Successivamente, eseguire una laparotomia mediana su un ratto anestetizzato, dall'osso pelvico allo sterno, praticando innanzitutto un'incisione nella cute e successivamente un'incisione nello strato muscolare sottostante. È necessario fare attenzione a non danneggiare gli organi intra-addominali. Legare separatamente entrambe le estremità per prevenire la fuoriuscita di chimo e feci, al fine di evitare la contaminazione della soluzione di bagnatura extracellulare.

In seguito, tagliare l'estremità prossimale dell'intestino vicino ai pori e l'estremità distale, vicino alla giunzione ileocecale. Quindi effettuare un'incisione sul mesentere alla sua base, in prossimità della vascolarizzazione nutritiva. Successivamente, trasferire l'intero letto mesenterico dell'intestino tenue in un becher da 50 millilitri contenente soluzione di dissezione fredda di ghiaccio e incubare per cinque minuti.

Quindi risciacquare con una soluzione di dissezione fresca per rimuovere il sangue. Ora fissare l'estremità prossimale dell'intestino sul lato destro in una piastra rivestita con sardine, estendendo il resto dell'intestino lungo un percorso in senso antiorario. Fissare il segmento per distendere il mesentere ed esporre i vasi sanguigni sotto un microscopio stereoscopico con ingrandimento variabile.

Isolare le arterie mesenteriche piccole di terzo e quarto ordine parallele all'intestino tenue, rimuovendo innanzitutto tutto il grasso di rivestimento vicino al ramo di secondo ordine. Quindi dissezionare la vena e isolare l'arteria con un punto di biforcazione a forma di V. Avere cura di non perforare il segmento selezionato.

Successivamente, isolare un segmento di quattro-cinque millimetri dell'arteria parallelo all'intestino tenue. Recidere tutti i rami di quinto ordine che si immettono nell'intestino tenue leggermente distanti dall'origine dei rami e conservare una porzione. Queste porzioni serviranno come siti di aggancio per il trasferimento dei segmenti arteriosi in una camera di perfusione e successivamente guideranno la loro cannulazione.

Quindi tagliare i segmenti arteriosi praticando due incisioni distali ai rami di quinto ordine su ciascun lato dell'arteria e trasferirli nella camera di perfusione. Canulare un'estremità dei vasi su una pipetta microscopica di vetro tenendo il bordo del segmento arterioso con pinze da dissezione. Far scorrere il filo precedentemente caricato e parzialmente chiuso sull'estremità canulata e fissarlo.

Successivamente, collegare una siringa da 10 millilitri caricata con soluzione di dissezione al rubinetto collegato a questa cannula. Sollevare delicatamente la siringa. La forza di gravità esercitata sulla soluzione rimuoverà il sangue intravascolare dall'estremità aperta del vaso.

Dopo aver rimosso il sangue intra-arterioso, chiudere il rubinetto a tre vie. Ora legare l'estremità distale dei vasi su una seconda cannula di vetro avvicinando con attenzione l'altra cannula il più possibile all'estremità non legata del segmento arterioso. Far scivolare il punto di sutura precedentemente caricato e parzialmente chiuso sull'estremità cannullata e fissarlo.

È necessario fare attenzione a non tirare o sollecitare i segmenti arteriosi e assicurarsi che i rubinetti a chiusura rapida collegati a entrambe le cannule siano chiusi. Trasferire la camera di perfusione sul piano del microscopio invertito dotato di registrazione video in tempo reale. Successivamente, collegare il rubinetto a chiusura rapida della cannula legata all'estremità prossimale del segmento arterioso a un dispositivo regolatore di pressione controllato da un servomeccanismo.

Assicurarsi che il rubinetto a tenuta collegato all'altra cannula rimanga chiuso per mantenere una pressione intraluminale stabile. Successivamente, collegare il tubo del vuoto al tubo di perfusione e la presa di aspirazione alla porta di perfusione della camera. Iniziare a perfondere il vaso con PSS caldo attraverso il riscaldatore in linea singolo a due millilitri al minuto.

Utilizzando una pompa peristaltica, accendere il vuoto e impostare la temperatura del PSS nella camera a circa 37 gradi Celsius. Aumentare lentamente la pressione intraluminale da 20 a 100 millimetri di mercurio. Verificare la presenza di eventuali perdite nel vaso mediante l'impostazione automatica della pressione sul regolatore di pressione.

In seguito, valutare il segmento arterioso per verificare la presenza di curve mantenendo la pressione a 100 millimetri di mercurio. Utilizzando la leva a vite, spostare la cannula per raddrizzare il segmento arterioso e non stirare eccessivamente i segmenti arteriosi. Ridurre quindi la pressione a 70 millimetri di mercurio per simulare la pressione in vivo nell'arco mesenterico e permettere al segmento arterioso di stabilizzarsi e sviluppare un tono miogeno.

In questa procedura, osservare l'arteria con un obiettivo 10x al microscopio equipaggiato con una videocamera monocromatica. Collegare la telecamera del dispositivo. Misurare il diametro luminale utilizzando un acquisitore di fotogrammi video e un sistema di rilevamento dei margini in tempo reale.

Quindi registrare il diametro del vaso e monitorare lo sviluppo del tono miogeno. Successivamente, ridurre la pressione a 20 millimetri di mercurio e consentire al diametro di stabilizzarsi. Poi aumentare la pressione intraluminale in passaggi incrementali come 20, 40, 60, 80 e 100, permettendo all'arteria di raggiungere un diametro stabile a ogni valore di pressione.

Passo successivo, ripetere la risposta alla variazione di pressione in PSS privo di calcio contenente 0,39 millimolari di EGTA e 0,1 millimolari di nitroprussiato di sodio come indicato dal tracciato; il diametro delle arterie mesenteriche piccole di ratto diminuisce spontaneamente quando viene applicata una pressione di 70 millimetri di mercurio. L'aggiunta di 1 micromolare di acetilcolina aumenta il diametro fino a valori prossimi al diametro iniziale. L'aggiunta di 1 micromolare di fenilefrina nel bagno tissutale riduce il diametro arterioso, e questa figura mostra che l'incubazione delle arterie mesenteriche piccole in PSS privo di calcio aumenta il diametro arterioso. Il diametro di un singolo segmento arterioso pressurizzato in diverse condizioni di perfusione è riportato in questa tabella.

Qui il diametro arterioso viene registrato in continuo mentre la pressione intraluminale aumenta in modo incrementale in presenza di PSS e di PSS senza calcio. Qui sono mostrate le curve del diametro arterioso ottenute a ogni passo di pressione e l'istogramma del tono miogeno raggiunto a ogni passo di pressione è mostrato qui Off. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare il comportamento miogeno delle piccole arterie di resistenza.

Seguendo questa tecnica, è possibile eseguire ulteriori procedure come la rimozione dell'endotelio e la permeabilizzazione arteriosa. Entrambe queste procedure possono fornire risposte a domande aggiuntive riguardo al ruolo dell'endotelio e del calcio nella regolazione del tono vascolare delle piccole arterie di resistenza.