Raccolta e identificazione di elminti dalla fauna selvatica
14 dicembre 2013
Gli animali selvatici sono comunemente parassitati da una vasta gamma di elminti. I quattro tipi principali di elminti sono "nematodi" (nematodi), "vermi dalla testa spinosa" (acantocefali), "trematodi" (trematodi) e "tenie" (cestodi). Qui descriviamo come gli elminti vengono raccolti da un animale vertebrato e come vengono conservati e identificati tassonomicamente.
L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere, conservare e identificare gli elmetti provenienti dalla fauna selvatica. Ciò si ottiene innanzitutto eseguendo una necroscopia su un animale selvatico. Successivamente, gli elmetti vengono raccolti da diversi organi e quindi conservati mediante diverse tecniche per l'identificazione successiva.
Infine, gli elmetti vengono schiariti, colorati e montati, e le specie vengono identificate. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano strutture specifiche degli elmetti mediante tecniche di schiarimento e/o colorazione, che possono notevolmente facilitare l'identificazione delle specie. Sebbene questo metodo possa essere applicato per l'identificazione di elmetti di mammiferi, uccelli, rettili e anfibi.
È possibile applicarlo anche ad altri organismi come i pesci. Per iniziare, posizionare l'animale su una superficie piana e utilizzare una lente di ingrandimento per esaminare tutte le aperture esterne, inclusi orecchi, cavità orale e occhi, alla ricerca della presenza di nematodi, CSE, dita dei piedi e trematodi. Utilizzando una lama affilata o un coltello e un paio di pinzette da dissezione.
Eseguire un'incisione sulla cavità addominale avendo cura di non lacerare alcun organo. Quindi, con forbici da osso o un piccolo seghetto manuale se necessario, aprire la cavità toracica. Esaminare entrambe le cavità per la presenza di peli, nematodi e trematodi di grandi dimensioni.
Quindi annodare un filo vicino all'inizio dell'esofago e un altro alla fine dell'intestino crasso per l'esame. Sotto un microscopio stereoscopico, separare il cuore e i vasi sanguigni principali, la trachea e i polmoni in piatti di Petri separati. Rimuovere il fegato, la cistifellea e il dotto pancreas, la milza, i reni e la vescica urinaria, ed esaminarli al microscopio stereoscopico.
Quindi rimuovere l'intero sistema digerente e posizionare ogni sezione in una capsula di vetro. Dopo aver asportato gli organi, utilizzare un tubo o una bottiglia spray riempita con soluzione salina allo 0,9% per lavare la cavità corporea, facendola filtrare attraverso un setaccio con maglia da 106 micrometri. Risciacquare all'indietro il contenuto del setaccio in una capsula di Petri ed esaminare il materiale al microscopio stereoscopico. Per i vermi Fal o i trematodi ematici, aprire ciascun tratto digerente con le forbici.
Scrapare la mucosa ed esaminarla attentamente per verificare la presenza di parassiti di grandi dimensioni. I psci di encanto cephas sono spesso profondamente integrati nella parete dell'intestino. Pertanto, se necessario, utilizzare pinze e/o piccole forbici per estrarli con cura dal tessuto.
Posizionare ogni sezione aperta sotto acqua corrente e lavare il contenuto in un setaccio da 106 micrometri. Quindi aprire il cuore e i principali vasi sanguigni, la trachea e le vesciche urinaria e biliare, ed esaminare il contenuto nello stesso modo; utilizzare una lama affilata e pinze per tagliare e separare delicatamente organi solidi come fegato, polmoni, reni, milza e pancreas, quindi lavare ed esaminare il contenuto. Registrare i tipi di parassiti.
Ha determinato il numero di ciascun tipo e gli organi in cui si trovano. Etichettare i flaconi o i barattoli inserendo al loro interno un piccolo pezzo di scheda bianca etichettata a matita, per preservare gli elmetti per successivi studi genetici. Posizionarli prima direttamente nell'etanolo.
Dopo aver fissato il campione per uno o più giorni, trasferirlo in una provetta di vetro da cinque millilitri riempita con etanolo al 70% per la conservazione a lungo termine. Per conservare i Trematodi, posizionare i campioni vivi su un vetrino da microscopio in una goccia di soluzione salina, applicare un coprioggetto di vetro e passare il vetrino su una fiamma senza far bollire la soluzione salina. Successivamente, immergere il vetrino in una piastra di Petri contenente alcol, acido acetico o una soluzione di FA e lasciare che il coprioggetto si stacchi galleggiando.
Fissare i trematodi morti in formalina acetica (FA) o in formalina tamponata al 10% per 48 ore prima di trasferirli in un barattolo contenente etanolo al 70% per la conservazione a lungo termine. Per fissare gli estos, rilassare gli animali vivi in una piastra di Petri versando acqua quasi bollente su di essi, quindi trasferirli in un barattolo contenente etanolo al 70% per la conservazione a lungo termine. Rilassare gli encanto cephas vivi ponendoli in una piastra di Petri con acqua del rubinetto e mantenendoli in frigorifero per una o più ore fino a quando il proboscide non si sarà completamente ritratto.
Trasferirli in un barattolo contenente etanolo al 70% o un fissativo per la conservazione a lungo termine. Uccidere i nematodi piccoli o fragili con etanolo caldo al 70% e conservarli in un barattolo riempito con etanolo al 70% contenente il 5% di glicerina per uccidere i nematodi di media e grande taglia.
Posizionarli in acido acetico glaciale freddo e, dopo 15 minuti, trasferirli in un barattolo contenente etanolo al 70% e glicerina al 5%. Preparare l'ematina di Harris sciogliendo l'ematina in alcol e sciogliendo il solfato di ammonio e alluminio in acqua a calore. Mescolare le due soluzioni e portarle a ebollizione.
Quindi aggiungere iodato di sodio e far bollire per due o tre minuti. Dopo il raffreddamento della soluzione, filtrare la soluzione attraverso carta da filtro 5 41 per evidenziare i trematodi e decantare. Collocare in ematina di Harris o carminio semipermanente per tutta la notte per fissare i campioni. Collocare nell’etanolo acido al 70% fino a quando gli organi diventano visibili.
Per arrestare la colorazione des, trasferire i campioni in etanolo basico al 70% per almeno 30 minuti. Disidratare i campioni in una serie di etanolo e utilizzare xilene o salicilato di metile per chiarirli. Per montare i campioni su un vetrino microscopico, aggiungere una goccia di Canada Bossum e un coprioggetto. Lasciare asciugare tutta la notte. Per chiarire nematodi di piccole o medie dimensioni ed encisto cefalici, posizionarli in montaggi di fenolo lattico su un vetrino microscopico e coprirli con un coprioggetto per 15-30 minuti. Per nematodi di grandi dimensioni ed encisto cefalici.
Collocare in fenolo all'80% per un massimo di 60 minuti. Esaminare al microscopio ottico per verificare la chiarificazione delle strutture più piccole al fine di osservare il culex atos. Tagliarlo e posizionarlo su una quantità di fenolo lattico.
Su un vetrino per microscopio. Utilizzare una lamella per schiacciare il Culex al fine di permettere la misurazione e il conteggio degli uncini stellari rossi. Rimuovere l'estremità anteriore e montarla su Foss al microscopio.
Fai scivolare sotto alcune gocce di fenolo lattico o in una gelatina glicerina per un preparato permanente. Osserva le parti boccali al microscopio ottico. Dopo aver tagliato le code dei nematodi di grandi dimensioni e montati in fenolo lattico, osserva il paoli ventrale e la morfologia degli spicoli dei maschi al microscopio ottico utilizzando i metodi descritti in questo video.
È stato condotto un sondaggio sui caschi dei crani di Sorex da maschera nei contesti della contea di Missoula, Montana, tra il 2007 e il 2011. Un totale di 56 esemplari di Sorex è stato raccolto mediante trappole a caduta e analizzato entro due ore dalla morte.
La prevalenza complessiva dell'infezione è stata del 96%. Solo due esemplari di topi muschiati erano privi di parassiti. Sono state identificate 15 specie di parassiti, incluse nove specie di cestodi e sei specie di nematodi. Una specie del genere Esto, Staphylocephalus, non era stata precedentemente descritta.
Gli organi risultati infetti includevano l'intestino tenue, lo stomaco, i polmoni e la vescica urinaria. L'intensità totale dell'infezione variava da sette a 234 parassiti per ospite infetto, mentre la ricchezza di specie di elmi o il numero di specie di elmi per ospite infetto variava da uno a otto, con una media di 4,1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in uno o due Rs su un piccolo mammifero come uno scoiattolo, e in quattro o cinque Rs su un mammifero più grande come un procione.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere, conservare e identificare elmi provenienti dalla fauna selvatica.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo completo per la raccolta, la conservazione e l'identificazione di elminti da ospiti vertebrati selvatici. Il metodo prevede una necroscopia sistematica, l'esame degli organi, l'estrazione dei parassiti, la loro conservazione e l'identificazione delle specie mediante tecniche di chiarificazione e colorazione. Il protocollo è applicabile a un'ampia gamma di vertebrati e consente una valutazione accurata della diversità degli elminti e dell'intensità di infezione nelle popolazioni selvatiche.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Parassitologia
- Biologia della fauna selvatica
- Tassonomia
Sfondo
- Gli animali selvatici sono frequentemente parassitati da elminti, tra cui nematodi, acantocfalidi, trematodi e cestodi.
- L'identificazione accurata degli elminti è essenziale per comprendere le relazioni ospite-parassita e l'ecologia delle malattie.
- La raccolta e l'identificazione degli elminti richiedono tecniche specializzate per la dissezione degli organi, l'estrazione dei parassiti e l'analisi morfologica.
- I metodi di conservazione e colorazione sono fondamentali per lo studio a lungo termine e per l'identificazione a livello di specie.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo standardizzato per la raccolta, la conservazione e l'identificazione di elminti provenienti dalla fauna selvatica.
- Illustrare tecniche per l'estrazione di elminti da diversi organi e per il loro allestimento ai fini dell'esame morfologico.
- Permettere un'accurata identificazione a livello di specie mediante procedure di chiarificazione e colorazione.
Metodi Utilizzati
- Necroscopia di animali selvatici appena deceduti (entro 4–6 ore dalla morte).
- Dissezione sistematica ed esame di tutti i principali organi mediante microscopia stereoscopica.
- Lavaggio degli organi su un setaccio da 106 μm per raccogliere gli elminti.
- Conservazione degli elminti in etanolo, formalina o alcol-formalina-acido acetico a seconda del tipo di parassita.
- Chiarificazione (con lattofenolo o fenolo) e colorazione (con ematossilina di Harris o carminio di Semichon) per l'identificazione morfologica.
- Montaggio dei campioni su vetrini per l'esame dettagliato.
Risultati principali
- Il protocollo consente un recupero ed una conservazione efficienti di elminti da una varietà di ospiti vertebrati.
- L'identificazione delle specie è facilitata dalla visualizzazione di caratteristiche morfologiche chiave dopo la chiarificazione e la colorazione.
- In uno studio caso sui topi muschiati (Sorex cinereus) nel Montana, il 96% era infetto, con 15 specie di elminti identificate (9 cestodi, 6 nematodi), inclusa una specie precedentemente non descritta.
- L'intensità delle infezioni variava da 7 a 234 vermi per ospite, con una ricchezza di specie per ospite compresa tra 1 e 8.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile e adattabile per la raccolta e l'identificazione di elminti nella ricerca sulla fauna selvatica.
- Richiede attrezzature di laboratorio di base e una certa competenza in anatomia e riconoscimento dei parassiti.
- L'identificazione a livello di specie potrebbe richiedere una consulenza specialistica o un'analisi molecolare nei casi più difficili.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La raccolta e l'identificazione di elminti provenienti dalla fauna selvatica supportano la validazione degli obiettivi nella ricerca in parasitologia e sulle malattie infettive, consentendo una riduzione meccanicistica dei rischi legati alle interazioni ospite-patogeno. Questo metodo fornisce un'elevata affidabilità predittiva nei modelli preclinici caratterizzando il carico parassitario e la diversità delle specie negli ospiti vertebrati. Contribuisce inoltre alla scoperta di biomarcatori traslazionali e allo sviluppo di sistemi pertinenti per la malattia, finalizzati all'identificazione di composti antiparassitari promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione di ipotesi terapeutiche sulle interazioni elminti-ospite mediante il recupero di parassiti specifici per organo.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico validando l'accessibilità del bersaglio in contesti tissutali nativi.
- Valore predittivo: Facilita il triage del portafoglio quantificando la prevalenza e l'intensità dell'infezione tra diverse specie di ospiti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per la standardizzazione di saggi successivi mediante campioni chiarificati e colorati.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di lavaggio degli organi, setacciatura ed esame microscopico.
- Scalabilità: Permette una valutazione affidabile dei composti mediante conteggi quantificabili di elminti per organo e per ospite.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie collegando l'identificazione delle specie di elminti al tropismo degli organi ospiti.
- Valore operativo: Fornisce un allineamento traslazionale dei biomarcatori attraverso l'analisi morfometrica di strutture specifiche per specie.
- Avanzamento corretto per il rischio: Informa sulla continuità preclinica documentando la dinamica dell'infezione in modelli vertebrati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della molecola bersaglio fino alla validazione preclinica, generando dati quantificabili di parassitologia per prendere decisioni di avanzamento o interruzione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante esame degli organi basato su necroscopia e isolamento dei parassiti.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso setacciatura standardizzata con setaccio da 106 μm e microscopia stereoscopica per un recupero costante degli elminti.
- Analisi: Permette l'analisi comparativa tramite registrazione dei tipi di parassiti, della localizzazione negli organi e delle metriche di intensità per singolo ospite.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'identificazione delle specie, utile per la valutazione della rilevanza del modello.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile in sistemi di ospiti mammiferi, uccelli, rettili e anfibi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie all'identificazione dei parassiti a livello di specie.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante protocolli fissi di esame e conservazione degli organi.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione dello studio riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi parassita-ospite.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio basata su dati quantificati di ricchezza e intensità dei parassiti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'esecuzione di necroscopie su vertebrati e nel riconoscimento degli organi.
- Necessita di microscopia stereoscopica e ottica con capacità di chiarificazione e colorazione.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le tecniche di lavaggio, setacciatura e conservazione degli organi.
- Comporta la necessità di adattamenti in base a diverse tassonomie degli ospiti e alle morfologie dei parassiti.
- Limitazione pratica: l'identificazione tassonomica fino al livello di specie richiede molto tempo e può necessitare di consulenza specialistica o di analisi del DNA.
