Caratteristiche dei microgel di polietilenglicole formati per precipitazione sono controllate dal peso molecolare dei reagenti

L'obiettivo generale di questa procedura è formare microgel di polietilene glicole mediante una reazione di precipitazione fotopolimerizzata da utilizzare come veicoli per il rilascio di farmaci e come impalcature per l'ingegneria tissutale. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando i reagenti, tra cui un iniziatore fotochimico, tamponi, trietilammina e soluzione di PEG DL, e riscaldandoli a 37 gradi Celsius. Il secondo passaggio consiste nel trasferire i reagenti in una provetta per microcentrifuga e vortecchiarli mantenendo una temperatura di 37 gradi Celsius.

Successivamente, viene aggiunto il solfato di sodio e la soluzione viene esposta alla luce UV per 30 secondi al fine di indurre il reticolaggio. Al termine del reticolaggio, si formerà uno strato torbido sulla superficie della soluzione, contenente i microgel. L'ultimo passaggio prevede l'aggiunta di PBS alla miscela e la centrifugazione per formare un pellet.

Infine, la microscopia e la diffusione dinamica della luce vengono utilizzate per misurare la dimensione dei microgel, mentre la densità viene determinata mediante un gradiente di densità di destrina. Inoltre, il grado di rigonfiamento viene calcolato misurando i pesi a umido e a secco dei microgel. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come le tecniche di emulsione, sospensione e dispersione, è che i microgel formati mediante reazione di precipitazione presentano un indice di polidispersità basso senza l'uso di solventi organici o stabilizzanti; inoltre, le condizioni moderate della reazione di precipitazione, le proprietà personalizzabili dei microgel e la bassa viscosità per iniezioni li rendono adatti ad applicazioni NVivo.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ingegneria tissutale e della medicina rigenerativa, ad esempio nella fabbricazione di scaffold con dimensioni uniformi e basso indice di polidispersità. Le implicazioni di questa tecnica possono estendersi alle terapie di somministrazione di farmaci, poiché i fattori di crescita contenuti nei farmaci possono essere facilmente incapsulati. Per iniziare, pesare 500 milligrammi del fotoiniziante e aggiungerli a 100 millilitri di acqua deionizzata per ottenere una soluzione allo 0,5%.

Proteggere la soluzione dalla luce UV e riscaldarla a 40 gradi Celsius, agitando costantemente per circa un'ora, al fine di sciogliere completamente l'iniziatore fotochimico. Dopo il completo scioglimento, filtrare sterilmente la soluzione facendola passare attraverso un filtro da 0,22 micron e conservarla a quattro gradi Celsius al buio fino al momento dell'uso. Successivamente, preriscaldare la trietilammina a 37 gradi Celsius per ridurne la viscosità.

Quindi aggiungere 612 microlitri di questa soluzione insieme a 260 microlitri di acido cloridrico 6 molare a 39,4 millilitri di PBS e portare il pH a 7,8 sterile. Filtrare la soluzione finale attraverso un filtro da 0,22 micron e conservarla a 37 gradi Celsius fino al momento dell'uso. In seguito al lavoro di Sony et al. acro lte, preparare i precursori di PEG secondo metodi pubblicati e conservare il prodotto finito a meno 20 gradi Celsius sotto Argonne; immediatamente prima dell'uso, preparare un millilitro di una soluzione di Peg diacrillato 200 milligrammi per millilitro aggiungendo lentamente 0,8 millilitri di PBS con trietanolammina e acido cloridrico a 200 milligrammi di peg diacrillato.

Inoltre, immediatamente prima dell'esperimento, pesare 213 milligrammi di solfato di sodio e scioglierli in un millilitro di acqua deionizzata. Per preparare una soluzione 1,5 molare, riscaldare la soluzione a 37 gradi Celsius per 20 minuti, quindi vortexare la soluzione fino a quando non sarà completamente sciolta. Una volta sciolta, filtrare sia la soluzione finale di solfato di sodio sia la soluzione di PEG diacrilato a 37 gradi Celsius attraverso filtri da 0,22 micron.

Combinare 127,5 microlitri di PBS con trietilammina e acido cloridrico, 10 microlitri dell'iniziatore fotochimico allo 0,5% e 25 microlitri della soluzione di Peg di acrilato a 200 milligrammi per millilitro in un tubo microcentrifuga da 1,6 millilitri. Aggiungere quindi qualsiasi molecola desiderata per l'incapsulamento.

Riscaldare queste provette insieme alla soluzione di solfato di sodio 1,5 M a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere 87,5 µL della soluzione pre-riscaldata di solfato di sodio 1,5 M alla prima provetta della soluzione di PEG, e mescolare la provetta aspirando e dispensando la soluzione da tre a cinque volte con una pipetta. Dopo il mescolamento, la concentrazione del sale sarà uniformemente distribuita e la soluzione dovrà diventare limpida.

Posizionare il tubo sotto la luce UV e incrociare per 30 secondi dopo il legame incrociato. Dovrebbe formarsi uno strato torbido sulla superficie della soluzione contenente i microgel. Successivamente, aggiungere 750 microlitri di PBS al tubo e mescolare bene la soluzione mediante vortex.

Quindi centrifugare la miscela a 4.000 ×g per due minuti per formare un pellet. Una volta formato il pellet, rimuovere il sopranatante avendo cura di non disturbare il pellet e sospendere i microgel in PBS fresco. Lavare i microgel un totale di cinque volte con PBS fresco, centrifugandoli tra un lavaggio e l'altro.

Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il soprannatante e pipettare 30 microlitri di microgel dal pellet in un millilitro di acqua deionizzata. Successivamente, sottoporre a sonica la soluzione di microgel in un bagno a ultrasuoni per un'ora a una frequenza di 50-60 hertz e una potenza di 1,4 ampere. Poi pipettare 15 microlitri della soluzione di microgel su un vetrino pulito inciso con acido e posizionare sopra un coprioggetto numero 1,5 inciso con acido.

Rovesciare il vetrino su un fazzoletto da laboratorio e premere delicatamente per rimuovere la soluzione in eccesso e assicurarsi che i microgel siano disposti in un singolo strato. Quindi, utilizzando un microscopio ottico, acquisire diverse immagini dei microgel mediante un obiettivo ad immersione in olio DIC 100x. Misurare i microgel per ottenere un diametro rappresentativo.

Calcolare l'indice di polidispersione utilizzando l'equazione basata sul volume mostrata qui, in cui N è il numero totale di microgel e VI è il volume del microgel. Per misurare la densità media dei microgel, preparare innanzitutto soluzioni di destrina al 7, 6, 5, 4, 3 e 1% in acqua deionizzata; le densità delle soluzioni di destrina sono mostrate qui. Successivamente, aggiungere due millilitri della soluzione di destrina al 7% in un tubo da centrifuga da 15 millilitri.

Quindi pipettare lentamente due millilitri della soluzione di destrina al 6% per formare uno strato distinto sopra la destrina al 7%. Dopo cinque minuti, aggiungere due millilitri dello strato successivo costituito da destrina al 5% e continuare in questo modo fino a quando ogni concentrazione di destrina sarà stata stratificata in ordine decrescente di concentrazione. Successivamente, stratificare con attenzione i microgel sopra la soluzione di destrina all'1%, quindi centrifugare il gradiente a cinque gradi Celsius a 4.000 volte la forza di gravità per 10 minuti.

Quindi visualizzare la posizione dei microgel e calcolare la densità dei microgel in base alla loro posizione tra gli strati. Per misurare la massa rigonfiata dei microgel, pesare innanzitutto un tubo da microcentrifuga e aggiungere successivamente un millilitro di microgel. Lavare i microgel cinque volte con acqua deionizzata, eseguendo un lavaggio intermedio ogni volta.

Centrifugare il campione per 10 minuti a 4.000 × g per formare il pellet dei microgel dopo l'ultimo lavaggio. Sospendere nuovamente i microgel in acqua deionizzata e lasciarli gonfiare per un periodo minimo di 48 ore. Dopo 48 ore, centrifugare i microgel gonfiati per 10 minuti a 4.000 × g, quindi rimuovere tutto il soprannatante.

Quindi pesare il campione e registrare la massa umida. Dopo aver ottenuto un peso umido accurato, congelare i microgel a meno 80 gradi Celsius, quindi liofilizzarli per rimuovere l'acqua e ottenere la massa secca. Una volta che tutta l'acqua è sublimata, calcolare il contenuto di acqua e polimero nei microgel utilizzando le equazioni mostrate qui, dove MS è il peso umido dei microgel e MD è il peso secco.

Qui vengono mostrati i diametri medi dei microgel di PEG formati utilizzando diversi pesi molecolari di PEG al 20%. L'aumento del tempo di esposizione ai raggi UV ha avuto inoltre un effetto sul diametro dei microgel. All'aumentare del tempo di esposizione ai raggi UV, sono aumentati anche i diametri delle tre formulazioni qui mostrate.

La densità, misurata mediante gradienti di destrina, diminuisce all'aumentare del peso molecolare delle molecole precursori di peg. Questo è confermato anche nel grafico della percentuale di contenuto di acqua, in cui si è osservato che il peg con peso molecolare più elevato presenta una maggiore quantità di acqua per grammo di polimero. Infine, al fine di dimostrare che i microgel possono essere caricati con proteine coniugate fluorescentemente, un albumina è stata aggiunta alla miscela prima della polimerizzazione ed è risultata intrappolata all'interno delle sferette.

Concentrazioni crescenti della proteina marcate con fluorescenza hanno aumentato l'indice di polidispersione delle sferette, ma la dimensione media è rimasta costante. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di riscaldare tutte le soluzioni a 37 gradi Celsius e di vortexare e microgirare accuratamente i gel al fine di rompere eventuali aggregati durante il lavaggio e la preparazione dei vetrini per l'acquisizione delle immagini. A seguito di questa procedura, possono essere eseguiti metodi aggiuntivi per l'incapsulamento del farmaco al fine di rispondere a ulteriori domande riguardo l'effetto del rilascio del farmaco.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare microgel di peg DA in condizioni blande mediante reazioni di precipitazione.