Name: Caratteristiche dei microgel di polietilenglicole formati per precipitazione sono controllate dal peso molecolare dei reagenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Scopri come formare microgel di polietilenglicole per precipitazione fotopolimerizzata. Questo metodo consente di controllare diametro e rigonfiamento variando il peso molecolare del PEG per applicazioni nel rilascio di farmaci e ingegneria tissutale.

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Il finanziamento di questo progetto è avvenuto attraverso l'NSF CBET Award 1061834. Gli autori ringraziano CIBA per un campione di fotoiniziatore.

1. Preparazione delle soluzioni per l'uso nella fabbricazione di microgel
<ol>
	<li>Prima di iniziare la reazione di precipitazione, preparare le soluzioni necessarie e riscaldarle a 37 °C. Le soluzioni richieste includono fotoiniziatore allo 0,5%, 1,5 M Na2SO4, soluzione tampone, 200 mg/ml di soluzione di PEG-diacrilato (PEG-DA) e 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Nota: acrilizzare tutti i precursori PEG secondo i metodi pubblicati e conservare a -20 °C sotto argon fino all'uso12.</li>
	<li>Pesare il fotoiniziatore e scioglierlo in deionizzato (DI) H2O per una soluzione allo 0,5 (p/v)%. È importante proteggere la soluzione dall'esposizione ai raggi UV.
	<ol>
		<li>Dopo la dissoluzione completa, filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Questa soluzione può essere preparata in anticipo e conservata a 4 °C al buio. NOTA: Ridurre il tempo di agitazione a circa 1 ora riscaldando la soluzione a 40 °C mentre si mescola.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per 1x PBS, aggiungere 1 compressa di PBS a 1 L DI H2O e filtrare con un filtro da 0,22 μm. Il PBS può essere preparato in anticipo e conservato a 4 °C.</li>
	<li>Misurare 39,4 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH=7,4) e aggiungere 612 μl di trietanolammina (TEOA) e 260 μl di acido cloridrico 6 M (HCl). Nota: il TEOA è molto viscoso; preriscaldare TEOA a 37 °C prima del pipettaggio.
	<ol>
		<li>Regolare il pH del tampone in modo che sia circa 7,7 e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm (pH finale ~7,8). La soluzione tampone può essere ingrandita, preparata in anticipo e conservata a 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparare la soluzione di PEG-DA prima di iniziare la reazione ogni volta; è stata osservata una diminuzione della reattività se la soluzione è conservata. Pesare il PEG-DA e aggiungere il tampone PBS/TEOA/HCl alla concentrazione finale di 200 mg/ml. Nota: Aggiungere il tampone lentamente per controllare attentamente la concentrazione di PEG perché il PEG si gonfia in soluzione. 
	Nota: questa soluzione è altamente personalizzabile. Le opzioni per la personalizzazione dei microgel includono: la modifica del peso molecolare iniziale del PEG per alterare le proprietà del microgel, l'utilizzo di un precursore PEG degradabile per fabbricare microgel degradabili, il filtraggio sterile di tutte le soluzioni per microgel biologicamente sterili, il completamento del processo di formazione in una cappa a flusso laminare e infine l'aggiunta di gruppi funzionali alla superficie incorporandoli nella soluzione PEG.</li>
	<li>Pesare Na2SO4 e sciogliere in DI H2O per una soluzione 1,5 M. Per ottenere i migliori risultati, anche la soluzione di solfato di sodio deve essere preparata appena prima di iniziare la reazione.
	<ol>
		<li>Riscaldare e agitare la soluzione fino a quando Na2SO4 è completamente sciolto. Filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm se necessario.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Fabbricazione di microgel
<ol>
	<li>Inserire 127,5 μl di tampone PBS/TEOA/HCl, 10 μl di fotoiniziatore allo 0,5% e 25 μl di soluzione PEG da 200 mg/ml nelle provette in cui si formeranno i microgel; in genere provette per microcentrifuga da 2 ml.
	<ol>
		<li>Riscaldare questi tubi insieme alla soluzione 1,5 M Na2SO4 a 37 °C.</li>
		<li>Mescolare i tubi durante il riscaldamento. Nota: questo protocollo microgel può essere ampliato.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per incapsulare le molecole nei microgel, aggiungere la molecola desiderata (ad es. ovoalbumina) al tampone PBS/TEOA/HCl, al fotoiniziatore e alla soluzione PEG. Dopo la reticolazione, la molecola verrà intrappolata nella rete di microgel.</li>
	<li>Completa ogni reazione con microgel una alla volta. Prendere la prima provetta e aggiungere 87,5 μl di 1,5 M Na2SO4.</li>
	<li>Miscelare la provetta pipettandola 3-5 volte; in alternativa attendere 30 sec. Dopo la miscelazione, la concentrazione di sale sarà distribuita uniformemente e la soluzione dovrebbe essere limpida.</li>
	<li>Posizionare il tubo sotto la luce UV e reticolare per 30 secondi. Dopo la reticolazione dovrebbe esserci uno strato torbido sopra la soluzione, questo strato contiene i microgel. Vedere la Figura 1 per lo schema di reazione.</li>
	<li>Aggiungere 750 μl di PBS per formare un pellet dopo la centrifugazione e mescolare bene.</li>
	<li>Lavare i microgel 5 volte centrifugando per 2 minuti a 4.000 x g per formare un pellet e scambiando il surnatante con PBS. Nota: non disturbare il pellet di microgel durante lo scambio del tampone, potrebbe non essere possibile rimuovere tutto il surnatante.</li>
</ol>
3. Dimensione del microgel e polidispersione
<ol>
	<li>Pipettare 30 μl di microgel dal pellet formato dalla centrifugazione in 1 ml di DI H2O. Per ottenere i migliori risultati, sonicare la soluzione di microgel in un sonicatore a bagnomaria per 1 ora (50-60 Hz e 1,4 A) o mescolare energicamente per sospendere i microgel.</li>
	<li>Pipettare 15 μl della soluzione di microgel su un vetrino pulito e applicare sopra il vetrino coprioggetti #1,5. Capovolgere il vetrino e il vetrino coprioggetto su un fazzoletto da laboratorio e spingere verso il basso il vetrino per rimuovere la soluzione in eccesso e assicurarsi che i microgel siano in un unico strato.</li>
	<li>Cattura diverse immagini dei microgel utilizzando un obiettivo per olio DIC 100X. In genere vengono scattate 5 immagini per campione e si consigliano 3 campioni per batch per un totale di 15 immagini. Nota: finora non è stata osservata alcuna variazione da lotto a lotto.</li>
	<li>Misurare i microgel per ottenere un diametro rappresentativo.</li>
	<li>Calcola la PDI utilizzando la seguente equazione basata sul volume in cui N è il numero totale di microgel e Vi è il volume di microgel i.</li>
</ol>
4. Densità del microgel
<ol>
	<li>Preparare soluzioni di destrano al 7, 6, 5, 4, 3 e 1 (p/v)% in DI H2O per determinare la densità del microgel. Queste densità sono state calcolate rispettivamente in 1,022, 1,020, 1,018, 1,016, 1,014 e 1,010 g/cm3.</li>
	<li>Aggiungere 1 ml di soluzione di destrano al 7% in una provetta da centrifuga da 15 ml.
	<ol>
		<li>Pipettare lentamente 1 ml di soluzione di destrano al 6% per formare uno strato distinto sopra il destrano al 7%.</li>
		<li>Attendere 5 minuti, quindi aggiungere 1 ml della soluzione al 5%.</li>
		<li>Continuare fino a quando tutte le soluzioni di destrano sono stratificate in ordine decrescente di concentrazione di destrano.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sovrapporre accuratamente i microgel sopra la soluzione di destrano all'1%.</li>
	<li>Centrifugare il gradiente per 10 minuti a 4.000 x g e 5 °C. La posizione del microgel dopo la centrifugazione ha permesso di calcolare facilmente la densità13.</li>
</ol>
5. Gonfiore dell'equilibrio del microgel
<ol>
	<li>Per misurare la massa gonfia (Ms) dei microgel, definita come la massa dopo il rigonfiamento dell'equilibrio (48 ore), lavare prima i microgel 5 volte in DI H2O e gonfiarli per un minimo di 48 ore in provette da microcentrifuga prepesate.</li>
	<li>Centrifugare i microgel per 10 minuti a 4.000 x g.</li>
	<li>Rimuovere tutto il surnatante e registrare la massa umida. Utilizzare metodi di filtraggio per garantire che tutta l'acqua in eccesso venga rimossa per ottenere risultati più accurati.</li>
	<li>Congelare i microgel a -80 °C, quindi liofilizzare a massa costante per ottenere la massa secca (Md).</li>
	<li>Calcola il contenuto d'acqua nei microgel con Acqua% = (Ms - Md) / Md x 100.</li>
	<li>Determinare il contenuto di polimero con Polimero% = 100 - Acqua% .</li>
	<li>Esegui analisi statistiche su tutti i dati utilizzando SAS con ANOVA a n-vie e test post-hoc Tukey. Le differenze si notano quando p<0,05.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le proprietà fisiche dei microgel PEG sono state esaminate per verificare la presenza di variazioni delle condizioni di polimerizzazione. Per questa reazione di precipitazione, una soluzione tampone, una soluzione di diacrilato PEG al 20% (p/v) (MW 3.000, 4.600 o 6.000 Da) e un fotoiniziatore sono stati miscelati e riscaldati a 37 °C. L'aggiunta di 1,5 M Na2SO4, un sale kosmotrofico che aumenta le interazioni tra le molecole d'acqua, ha causato la precipitazione momentanea del PEG dopo la sua aggiun...

Per definizione, i microgel sono idrogel di qualsiasi forma con un diametro equivalente di circa 0,1-100 μm1. A causa delle loro dimensioni e caratteristiche, i microgel polimerici rappresentano uno strumento versatile per far progredire la somministrazione di farmaci e i sistemi di ingegneria tissutale. Mentre gli idrogel sfusi sono ampiamente utilizzati come scaffold per l'ingegneria tissutale e veicoli per la somministrazione di farmaci con grande successo2-4, un recente passaggio al controllo su microscala degli scaffold offre un'opportunità unica per i microgel da utilizzare come materiali di base per la costruzione di scaffold. Inoltre, i microgel hanno un elevato rapporto superficie/volume per le interazioni cellulari e in soluzione hanno una bassa viscosità che li rende ideali per le iniezioni. Infine, i microgel possono essere formati utilizzando numerosi polimeri con una varietà di metodi a seconda delle caratteristiche del microgel desiderate, rendendoli altamente personalizzabili per una varietà di applicazioni.
Le tecniche per produrre microgel includono polimerizzazioni in sospensione, emulsione, dispersione o precipitazione. Le polimerizzazioni in emulsione e sospensione richiedono tipicamente solventi organici e tensioattivi o stabilizzanti per formare i microgel. La natura di questi metodi produce una distribuzione granulometrica altamente dispersa5. Le reazioni di dispersione e precipitazione rendono le particelle con una polidispersione inferiore6; Tuttavia, le particelle formate dalla polimerizzazione per dispersione richiedono ancora l'uso di agenti stabilizzanti6. I microgel formati dalle reazioni di precipitazione sono unici in quanto formano particelle di dimensioni e forma uniformi senza l'uso di stabilizzanti o tensioattivi. La formazione di microgel si ottiene quando le catene polimeriche in crescita si separano dalla fase continua mediante precipitazione entalpica o entropica7. La polimerizzazione per precipitazione avviene spesso ad alte temperature che possono essere abbassate dall'uso di sali kosmotrofici, che diminuiscono la solubilità del polimero nel solvente8. Questo lavoro si concentra sui microgel formati da poli(glicole etilenico) (PEG) mediante una reazione di precipitazione fotopolimerizzata in condizioni biologicamente compatibili, con variazioni per alterare le proprietà del microgel e incapsulare molecole per applicazioni di somministrazione di farmaci.
Precedenti studi con idrogel PEG mostrano che le condizioni di polimerizzazione influenzano notevolmente le proprietà fisiche e meccaniche degli idrogel, vale a dire il contenuto di acqua dell'idrogel e il modulo di compressione3,9. Questi materiali reticolati sono interessanti perché la relazione tra le proprietà strutturali e fisiche descritte da Flory10 può essere utilizzata per personalizzare l'idrogel reticolato per applicazioni specifiche. Questi principi sono simili per i microgel. È stato dimostrato che i microgel PEG formati per precipitazione hanno un potenziale per la medicina rigenerativa11, tuttavia sono state necessarie ulteriori indagini sulle proprietà dei microgel per migliorare il loro repertorio per future applicazioni biomediche. Questo rapporto descrive la procedura per fabbricare microgel mediante reazione di precipitazione e alterare le caratteristiche, come il diametro delle microparticelle, l'indice di polidispersione (PDI), la densità e il rigonfiamento, che sarebbero importanti per sviluppare ulteriormente questi materiali per la somministrazione di farmaci o la medicina rigenerativa.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>MP Biomedical</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>trietanolammina (TEOA)</td><td>J.T. Baker</td><td>9468-01</td><td>Preriscaldare a 37 gradi; C prima del pipettaggio</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>BDH Aristar</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di sodio</td><td>J.T. Baker</td><td>3891-01</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba</td><td>029891301PS04</td><td></td></tr><tr><td>Ovoalbumina (OVA)</td><td>Invitrogen</td><td>34782</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1.500</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16241</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3.000</td><td>Fluka</td><td>03997-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4.000</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4.600</td><td>Sigma</td><td>373001-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6.000</td><td>Fluka</td><td>03394-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PEG 10.000</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21955</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 70</td><td>TCI</td><td>D1449</td><td></td></tr></tbody></table>

caratteristiche dei microgel di polietilenglicole formati per precipitazione sono controllate dal peso molecolare dei reagenti

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

Questo lavoro descrive la formazione di microgel di poli(glicole etilenico) (PEG) tramite una reazione di precipitazione fotopolimerizzata. Le reazioni di precipitazione offrono diversi vantaggi rispetto alle tradizionali tecniche di fabbricazione di microsfere. Contrariamente alle tecniche di emulsione, sospensione e dispersione, i microgel formati per precipitazione sono di forma e dimensioni uniformi, cioè a basso indice di polidispersione, senza l'uso di solventi organici o stabilizzanti. Le condizioni lievi della reazione di precipitazione, le proprietà personalizzabili dei microgel e la bassa viscosità per le iniezioni li rendono applicabili per scopi in vivo. A differenza di altre tecniche di fabbricazione, le caratteristiche del microgel possono essere modificate modificando il peso molecolare del polimero di partenza. L'aumento del peso molecolare del PEG iniziale ha aumentato il diametro del microgel e il rapporto di rigonfiamento. Si suggeriscono ulteriori modifiche, come l'incapsulamento di molecole durante la reticolazione del microgel. Semplici adattamenti agli elementi costitutivi del microgel PEG vengono esplorati per future applicazioni di microgel come veicoli per la somministrazione di farmaci e scaffold per l'ingegneria tissutale.

La dimensione dei microgel dipende dalle condizioni di polimerizzazione. Figura 2A illustra come il diametro dei microgel aumenti all'aumentare del peso molecolare iniziale del PEG e del tempo di reticolazione. Immagini rappresentative di microgel utilizzati per la misurazione delle dimensioni, con diversi pesi molecolari e reticolati per 30 secondi, sono mostrate nelle Figure 2C-G. Per il PEG con un peso molecolare di 3.000 Da, il diametro medio del microgel è aumentato da 1,65±0,26 a 2...

Questo lavoro descrive la formazione di microgel di poli(glicole etilenico) (PEG) tramite una reazione di precipitazione fotopolimerizzata. L'aumento del peso molecolare del PEG ha aumentato il diametro del microgel e il rapporto di rigonfiamento. Semplici adattamenti alla reazione di precipitazione del microgel PEG sono stati esplorati per future applicazioni di microgel come veicoli di somministrazione di farmaci e scaffold di ingegneria tissutale.

Caratteristiche dei microgel di polietilenglicole formati per precipitazione sono controllate dal peso molecolare dei reagenti

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

L'obiettivo generale di questa procedura è formare microgel di polietilene glicole mediante una reazione di precipitazione fotopolimerizzata da utilizzare come veicoli per il rilascio di farmaci e come impalcature per l'ingegneria tissutale. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando i reagenti, tra cui un iniziatore fotochimico, tamponi, trietilammina e soluzione di PEG DL, e riscaldandoli a 37 gradi Celsius. Il secondo passaggio consiste nel trasferire i reagenti in una provetta per microcentrifuga e vortecchiarli mantenendo una temperatura di 37 gradi Celsius.Successivamente, viene aggiunto il solfato di sodio e la soluzione viene esposta alla luce UV per 30 secondi al fine di indurre il reticolaggio. Al termine del reticolaggio, si formerà uno strato torbido sulla superficie della soluzione, contenente i microgel. L'ultimo passaggio prevede l'aggiunta di PBS alla miscela e la centrifugazione per formare un pellet.Infine, la microscopia e la diffusione dinamica della luce vengono utilizzate per misurare la dimensione dei microgel, mentre la densità viene determinata mediante un gradiente di densità di destrina. Inoltre, il grado di rigonfiamento viene calcolato misurand

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Le caratteristiche dei microgel di polietilenglicole formati da precipitazione sono controllate dal peso molecolare dei reagenti

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Scopri come formare microgel di polietilenglicole per precipitazione fotopolimerizzata. Questo metodo consente di controllare diametro e rigonfiamento variando il peso molecolare del PEG per applicazioni nel rilascio di farmaci e ingegneria tissutale.

Caratteristiche dei microgel di polietilenglicole formati per precipitazione sono controllate dal peso molecolare dei reagenti

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