Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati
January 30th, 2014
Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare la microglia corticale dai neonati murini. Ciò si ottiene sezionando per la prima volta il tessuto cerebrale corticale dai neonati di Muren. Il secondo passo consiste nel coltivare colture cellulari gliali miste per 17-21 giorni in vitro.
Successivamente, le microglia vengono isolate da queste colture gliali miste. Il passaggio finale consiste nel preparare le cellule microgliali in piastre di coltura cellulare per ulteriori sperimentazioni. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza ed Eliza sono state utilizzate per dimostrare che questo protocollo di isolamento preserva il fenotipo e la funzionalità dell'immuno microgliale.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i SEP coinvolti nella microdissezione sono difficili da eseguire. L'esecuzione corretta di questa procedura richiede velocità e precisione. Cioè, essere troppo lenti ridurrà la resa cellulare, mentre la rimozione incompleta delle meningi contaminerà la coltura gliale e impedirà la crescita gliale.
Iniziare preparando il terreno completo per la microglia denominato MCM di seguito. Prepara una fiaschetta per cucciolo e incubali per almeno un'ora. Questa fase di equilibrio è essenziale per il successo.
Quindi, preparare l'aliquota e raffreddare con ghiaccio. Tutti i terreni necessari aliquotano sei millilitri di MCM per ogni cucciolo e li scaldano in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius prima della dissezione. Pulire la stazione di lavoro orizzontale per il flusso d'aria e il microscopio di dissezione con etanolo al 70%.
Successivamente, posizionare gli strumenti chirurgici sterilizzati necessari per la procedura nell'area di lavoro. Preparare un piatto sterile con mezzi di dissezione per catturare la testa e un altro per la dissezione. Erogare il mezzo di macinazione nel proprio piatto per tritare il tessuto cerebrale.
Dopo la decapitazione e l'estrazione del cervello, metti il cervello appena isolato sotto un microscopio da dissezione per visualizzare le cortesie, assicurandoti di mantenere il lato dorsale rivolto verso l'alto e asciutto. Metti in sicurezza il cervello inserendo le punte delle pinze nell'intersezione tra il mesencefalo e la corteccia. Una volta in posizione, rimuovere completamente le meningi corticali dorsali.
Successivamente, rimuovere le meningi ventrali per massimizzare la purezza e la resa della microglia. È essenziale rimuovere completamente tutto il tessuto meningeo. Separa le cortecce dal resto del cervello.
Assicurati di rimuovere eventuali meningi corticali residue che potrebbero essere presenti sul lato ventrale o mediale delle cortecce. Con il tessuto meningeo rimosso, mettere le cortecce nella teglia preparata in precedenza. Lavorando in un armadio di sicurezza biologica di seconda classe, usa le forbici per tritare il tessuto cerebrale.
Trasferire il tessuto tritato in un tubo conico da 15 millimetri. Sciacquare sia le forbici che la pirofila con un millilitro di liquido di macinazione ciascuno per massimizzare i raccolti. Raccogliere ed erogare questi risciacqui nel tubo conico da 15 millilitri contenente il fazzoletto tritato.
Lasciare la sospensione tissutale indisturbata per uno o due minuti, lasciando che il tessuto tritato si depositi sul fondo della provetta. Trascorso questo tempo, rimuovere e scartare con cura due millilitri di surnatante, facendo attenzione a non interrompere il tessuto tritato depositato. Aggiungere tre millilitri di MCM precedentemente riscaldato al tessuto tritato, quindi tri il tessuto con forza.
Al termine del trier, non deve rimanere tessuto solido distinguibile. Aggiungere altri tre millilitri di MCM utilizzando lo stesso puntale della pipetta per raccogliere il campione triturato residuo dal puntale. Una volta raccolto, centrifugare il tessuto tritato per pellettare le cellule.
Al termine, rimettere le cellule pellettate nella cabina di sicurezza biologica. Rimuovere con cautela e gettare il surnatante. Rinvigorire delicatamente.
Sospendere il pellet di cella con due millilitri di MCM caldo, quindi aggiungere la sospensione di reus cellulare al pallone preparato in precedenza. Incubare le cellule per 24 ore. Dopo 24 ore, picchiettare delicatamente il pallone contro il palmo della mano per rompere i detriti tissutali.
Controllare le celle prima e dopo la picchiettatura per assicurarsi che i detriti siano completamente rimossi. Quindi, sostituire il terreno con MCM nuovo e rimettere il pallone nell'incubatore. Controllare le cellule ogni giorno per monitorare la crescita e la contaminazione.
Dopo circa 17-21 giorni, le cellule microgliali saranno pronte per il prelievo per determinare se le cellule sono pronte, esaminarle al microscopio a contrasto di fase invertito. Le microglia sono pronte per il raccolto. Quando hanno raggiunto circa il 40% di fluenza, appaiono come piccole cellule sferiche luminose che crescono come un monostrato sopra l'altro.
Per isolare, le microglia battono energicamente il pallone contro il banco del laboratorio. Questa agitazione aiuta a separare la microglia dalle altre cellule gliali a causa delle proprietà di bassa aderenza della microglia. Sigillare i tappi del pallone con paraforma e ruotare le colture gliali miste utilizzando un agitatore rotante non umidificato a temperatura controllata per cinque ore.
Trascorso questo tempo, controllare visivamente che le microglia si siano sollevate dalla superficie del pallone. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito, le microglia sono cellule luminose e sferiche fluttuanti. Ci sarà uno strato residuo di astrociti e oligodendrociti aderenti al fondo del pallone.
Successivamente, raccogliere il surnatante contenente la microglia in una provetta da centrifuga conica sterile e nel palato. Resus. Sospendere il pellet microgliale in un terreno di coltura microgliale caldo e determinare la concentrazione cellulare utilizzando una piastra emocitometrica. Le celle su un formato di piastra a 24 pozzetti su plastica o vetro sterile scivolano 24 ore dopo.
Sostituire il terreno con MGM fresco e caldo per rimuovere le celle galleggianti e i detriti. Questa fase è fondamentale per la sopravvivenza cellulare e per mantenere la microglia quiescente, le cellule della microglia sono pronte per la sperimentazione immediatamente dopo questa fase di rialimentazione per valutare la purezza della microglia. Le colture cellulari derivate da microglia che esprimono GFP endogenamente sono state colorate per l'antigene macrofagico IBA e controcolorate con dapi.
Per visualizzare il nucleo cellulare, più del 95% delle cellule ha mostrato colocalizzazione di GFP IBA uno e dpi. Dopo aver sfidato le cellule con LPS, la microglia ha adottato un netto cambiamento morfologico da un piccolo fenotipo bi a una forma simile ad un ameboide. La colorazione immunofitochimica per P 65 evidenzia che in condizioni normali P 65 è diffusa localizzata in tutto il citoplasma.
Mentre dopo un'esposizione di due ore a Pam P 65, l'immunoreattività ha spostato drasticamente la localizzazione al nucleo cellulare per confermare che le microglia isolate mantenevano la loro funzionalità immunologica biochimica. La secrezione della citochina pro-infiammatoria TNF alfa è stata determinata dopo l'esposizione a PAM o LPS. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare la microglia corticale dai neonati specchianti per ottenere i migliori risultati.
È importante mantenere la tecnica sterile e rimuovere completamente il tessuto meningeo dalla regione corticale sezionata.
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Panoramica
Questo articolo descrive una procedura per isolare la microglia corticale da neonati murini, enfatizzando l'importanza di preservare l'immunofunzione microgliale durante il processo. Il metodo di isolamento prevede la dissezione microscopica del tessuto cerebrale, la coltura di cellule gliali miste e successivamente l'isolamento della microglia per la sperimentazione.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Immunologia
Contesto
- La microglia svolge un ruolo cruciale nel sistema nervoso centrale (SNC).
- I metodi di isolamento possono influenzare la funzionalità delle cellule microgliali.
- Preservare l'immunofunzione è essenziale per risultati sperimentali accurati.
- Gli stimoli proinfiammatori sono utilizzati per valutare l'attivazione microgliale.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per isolare la microglia da neonati murini.
- Assicurarsi che la microglia isolata mantenga il proprio immunofenotipo e la funzionalità.
- Facilitare ulteriori sperimentazioni sulla biologia microgliale.
Metodi utilizzati
- Dissezzione microscopica del tessuto cerebrale corticale da neonati murini.
- Coltura di cellule gliali miste per 17-21 giorni in vitro.
- Isolamento della microglia da colture gliali miste.
- Uso di microscopia immunofluorescente ed ELISA per valutare la funzionalità microgliale.
Risultati principali
- Il protocollo di isolamento produce colture microgliali altamente pure.
- La microglia mantiene caratteristiche immunofunzionali dopo l'isolamento.
- L'attivazione con LPS e Pam 3 CSK 4 dimostra una funzionalità preservata.
- L'imaging fluorescente e l'immunocitochimica confermano i risultati.
Conclusioni
- Il metodo di isolamento descritto è efficace per ottenere microglia funzionale.
- La preservazione dell'immunofunzione è critica per studiare la biologia microgliale.
- Questo protocollo può essere applicato a vari setup sperimentali che coinvolgono la microglia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolation of functional microglia from murine neonates enables mechanistic de-risking in neuroimmunology target validation by preserving immunophenotype and responsiveness to inflammatory stimuli. This ex vivo model supports predictive confidence in early discovery by maintaining quiescent and activated states relevant to CNS disease pathways. The method provides a disease-relevant system for screening immunomodulatory compounds and assessing target engagement in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial activation pathways through LPS and Pam3CSK4 challenge assays.
- Operational Value: Yields highly pure cortical microglia with preserved NF-κB p65 nuclear translocation and TNF-α secretion functionality.
- Predictive Value: Supports target hypothesis testing by maintaining immunophenotypic fidelity from quiescent to proinflammatory states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized microglial monolayer system for compound screening after 17–21 days of glial culture maturation.
- Operational Value: Allows quantification of microglial purity via IBA-1/GFP colocalization (>95%) and functional readouts like cytokine release.
- Assay Readiness: Isolated microglia exhibit morphological and functional responses to stimuli, enabling reliable dose-response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains microglial functionality ex vivo, supporting continuity from discovery to preclinical validation of neuroinflammatory targets.
- Mechanistic De-risking: Preserves biochemical functionality (NF-κB signaling, TNF-α release) critical for assessing target-mediated pathway modulation.
- Disease Relevance: Models quiescent and activated microglia states applicable to neurodegenerative and neuroinflammatory disease research.
Pipeline & Workflow Integration
The isolation method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification by providing a reproducible microglial platform for mechanism-of-action studies and phenotypic screening in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification via NF-κB translocation and cytokine secretion assays following immune challenge.
- Screening: Enables assay standardization through consistent microglial yield, purity, and functional responsiveness after rotary shaker isolation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables including TNF-α secretion levels and p65 nuclear localization for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects ex vivo microglial function to in vivo relevance through preserved immunophenotype and activation kinetics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microglial isolation workflow applicable across multiple CNS target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preserved microglial immunophenotype and stimulus-responsive functionality.
- Operational Value: Standardized isolation via mechanical agitation yields reproducible microglial cultures with >95% purity and functional integrity.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuroimmunology screening by maintaining ex vivo microglial behavior indicative of in vivo states.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory targets based on validated target engagement in functional microglial assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal murine tissue dissection and sterile glial culture techniques.
- Dependent on temperature-controlled rotary shaker and inverted phase contrast microscopy for microglia isolation and verification.
- Necessitates standardization of meninges removal and culture duration (17–21 days) across teams to ensure microglial yield and purity.
- Adaptation to other model systems may require optimization of dissociation timing and microglial adhesion properties.
- Practical limitation: Microglial yield is contingent on complete meningeal tissue removal to prevent glial culture contamination.
