Monitoraggio dei cambiamenti di polarità membrana, membrana integrità e intracellulare di ioni concentrazioni in Streptococcus pneumoniae Utilizzo di tinture fluorescenti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare coloranti fluorescenti per monitorare i cambiamenti nella dinamica della membrana e le concentrazioni di ioni intracellulari in un sistema batterico. Ciò si ottiene incubando prima i batteri durante la loro fase di crescita con il fluor di interesse fino a quando non si è equilibrato attraverso le loro membrane. Successivamente, i batteri vengono trattati con l'agente di scelta e la loro fluorescenza viene monitorata.

I risultati possono mostrare cambiamenti nella depolarizzazione della membrana, nell'integrità della membrana e nelle concentrazioni di ioni intracellulari in base ai cambiamenti osservati nella fluorescenza dei coloranti indicatori. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche di elettrofisiologia convenzionali come il patch clamping, utilizzato nei sistemi eucariotici, è che i cambiamenti nella dinamica della membrana e nelle concentrazioni di ioni intracellulari possono ora essere monitorati nei batteri utilizzando la fluorescenza. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ci vuole un certo sforzo per ottimizzare le concentrazioni di colorante.

Condizioni di caricamento e impostazioni di rilevamento Iniziare con le cellule batteriche. Appena pellettato in soluzione di lavaggio, prima risospendere il pellet in almeno un millilitro di PBS per 100 milioni di CFU per millilitro, che è sufficiente per cinque campioni. Trasferire un millilitro di cellule lavate in una provetta da microcentrifuga e aggiungere 25 microlitri di un filtro molare.

La soluzione madre sterilizzata di glucosio incuba le cellule in un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Il glucosio aggiunto può variare in base all'esperimento. Dopo 15 minuti, aggiungere cinque microlitri del dieback 50 micromolare e 10 microlitri di soluzione PI.

Mescolare accuratamente le cellule pipettandole su e giù più volte. Quindi dividere questa sospensione cellulare in cinque pozzetti di campionamento di una piastra trasparente a 96 pozzetti. Caricare la piastra in un set di lettori di piastre di preriscaldamento per il rilevamento del deperimento NP.

Ora monitora l'equilibrio del deperimento sulle membrane cellulari effettuando misurazioni una volta al minuto per 30-40 minuti fino a quando la lettura non si stabilizza al valore pre-trattamento. Quindi espellere la piastra e aggiungere l'agente sperimentale preferito. Restituire immediatamente la piastra al lettore e continuare a monitorare il deperimento e la fluorescenza PI per il periodo di tempo desiderato.

Quando si prepara il buffer di caricamento per questa procedura, assicurarsi di farlo vorticare brevemente prima di aggiungere PBS e Probenecid. Dopo aver aggiunto queste soluzioni, agitarlo di nuovo e avvolgerlo in un foglio fino a ottenere un millilitro di sospensione di due cellule. Aggiungere un millilitro di due tamponi di caricamento.

Questo è sufficiente per 10 campioni. Incubare la miscela in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 75 minuti, al riparo dalla luce durante tutti questi saggi. Potrebbe essere necessario regolare la concentrazione del colorante e il tempo di incubazione per ottimizzare il test e il livello di rilevamento della fluorescenza di base, a seconda della specifica specie batterica e di altre variabili del sistema sperimentale.

Dopo l'incubazione, lavare le celle tre volte per ogni lavaggio. Pellettare le cellule a 2.400 Gs per 10 minuti e risospenderle in due millilitri di PBS contenenti un x pronico. Dopo i tre lavaggi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per altri 30 minuti.

Ciò consente all'estro all'interno dei batteri di idrolizzare i gruppi estere del colorante, rendendo il colorante attivo all'interno della cellula. Successivamente pellet, le cellule rimuovono la snat e la sospendono in due millilitri di PBS contenenti un x Probenecid. Se necessario, il glucosio può ora essere aggiunto di nuovo per rienergizzare i batteri, caricare 200 microlitri di cellule in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per ogni campione e caricare la piastra in un lettore di preriscaldamento in un campione.

Per prima cosa, stabilisci una lettura di base alle lunghezze d'onda corrette e al ritmo di una lettura al secondo per un minuto. Quindi rimuovere la piastra e aggiungere circa cinque microlitri del trattamento scelto. A quello.

Pipettare rapidamente su e giù un paio di volte per miscelare il trattamento e restituire immediatamente la piastra al lettore. Continuare a effettuare le misurazioni per il tempo desiderato. Per analizzare i dati, calcolare il rapporto dei valori di fluorescenza per ogni punto temporale dividendo il valore, uno per il valore due, e tracciare i valori del rapporto su un grafico.

In preparazione, creare un intervallo di cinque o sei tamponi ad alto contenuto di potassio con valori di pH da 6,5 a 8,0. Come nella procedura precedente, utilizzare un vortice per preparare i due tamponi di carico x da un lavaggio di coltura in fase di log intermedio e concentrare le cellule. Quindi sostituire lo SNAT con due millilitri di BS Per fare una sospensione a quattro celle.

Combinare un millilitro della sospensione a quattro celle con un millilitro del tampone di carico a due x. Ora incubare le cellule in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius per 40 minuti. Proteggilo dalla luce.

Ora lava le celle tre volte. Pellettare le celle come mostrato in precedenza. Aggiungere quattro millilitri di PBS contenenti due x prop Benin e un millimolare di glucosio e ripetere la centrifugazione dopo i tre lavaggi.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per altri cinque minuti. Per determinare il filtro a fluorescenza di fondo, sterilizzare circa 500 microlitri della sospensione batterica energizzata per rimuovere i batteri. Quindi trasferire 200 microlitri di filtrato in una piastra a 96 pozzetti e misurare l'assorbimento da quel pozzetto per un minuto.

Per ottenere una curva di calibrazione in vivo, ridurre 500 microlitri di watt ALI delle celle caricate ed energizzate e riprodurle. Sospenderli in una serie di tamponi ad alto contenuto di potassio di pH diverso per ogni campione, aggiungere 20 micromolari di risin. Questo equilibra il pH intracellulare delle cellule al pH del tampone circostante.

Quindi incubare i campioni a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, trasferire i campioni nella piastra a 96 pozzetti nel lettore di piastre. Misurare la fluorescenza di ciascun campione per alcuni minuti per stabilire una lettura di studio per ciascuno. Bene.

Per analizzare questi dati, sottrarre i valori di fluorescenza di fondo, quindi calcolare il rapporto dei valori di fluorescenza dividendo il valore. Tracciare uno per valore due, tracciare i valori del rapporto per ciascun tampone pH per creare la curva di calibrazione per misurare le variazioni del pH intracellulare. Caricare campioni da 200 microlitri delle celle eccitate in una piastra e misurare la fluorescenza ogni cinque secondi per cinque minuti.

Contemporaneamente, aggiungere 10 CCCP micromolari a un campione aggiungendo gli agenti di interesse agli altri campioni. Il CCCP è un controllo positivo allineato nel tempo per diminuire il pH intracellulare. Rimettere immediatamente la piastra nel lettore e continuare a misurare la fluorescenza ogni cinque secondi per 10 minuti.

Come ulteriore controllo, aggiungere 20 micromolari NI garrison a tutti i campioni per bilanciare il pH dei batteri a quello del tampone per altri cinque minuti. Quando si esplora la polarità della membrana, i batteri devono essere incubati con die back per circa 40 minuti per consentire al colorante di equilibrarsi sulla membrana. Ciò è indicato dalla costante diminuzione della fluorescenza che si stabilizza.

Il PI non richiede equilibratura, ma insieme al deperimento è utile per monitorare la rottura della membrana. In concomitanza con la polarità, la depolarizzazione e la rottura dei batteri è indicata da un aumento dell'intensità fluorescente di entrambi i coloranti per meno 2:00 AM viene calcolato il rapporto di due segnali fluorescenti e un aumento o una diminuzione di questo rapporto corrisponde al calcio intracellulare. Per PBFI am il potassio intracellulare viene misurato mediante rapporti di fluorescenza.

L'idrogeno intracellulare viene misurato utilizzando i rapporti di fluorescenza di B-C-E-C-F am. Dopo l'aggiunta dello iono a quattro ioni di calcio, il calcio fluisce nella cellula causando un aumento del rapporto di fluorescenza. L'aggiunta di valma ha l'effetto opposto di far fuoriuscire il potassio dalla cellula, il che è indicato da una diminuzione del rapporto di fluorescenza.

B-C-E-C-F consente la misurazione del pH intracellulare, le prime curve di calibrazione vengono effettuate in vari tamponi di pH noto. Una diminuzione del rapporto di fluorescenza del colorante corrisponde a una diminuzione del pH. Questo si vede con l'aggiunta del protone di forza CCCP, la linea nera, e dopo l'aggiunta di un dissipatore di forza motrice del protone la linea blu.

La seconda freccia mostra l'aggiunta di nissina, che equilibra le concentrazioni di idrogeno intracellulare ed extracellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la depolarizzazione della membrana, l'integrità della membrana e le concentrazioni intracellulari di ioni nelle cellule batteriche. Dovresti anche essere in grado di utilizzare questo protocollo come punto di partenza per studiare altre proprietà e cellule batteriche.