Monitoraggio dei cambiamenti di polarità membrana, membrana integrità e intracellulare di ioni concentrazioni in

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare coloranti fluorescenti per monitorare i cambiamenti nella dinamica della membrana e nelle concentrazioni intracellulari di ioni in un sistema batterico. Questo viene ottenuto innanzitutto incubando i batteri durante la loro fase di crescita con il fluorocromo di interesse, fino al raggiungimento dell'equilibrio attraverso le loro membrane. Successivamente, i batteri vengono trattati con l'agente prescelto e la loro fluorescenza viene monitorata.

I risultati possono mostrare variazioni nella depolarizzazione della membrana, nell'integrità della membrana e nelle concentrazioni intracellulari di ioni in base alle modifiche osservate nella fluorescenza dei coloranti indicatori. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi convenzionali di elettrofisiologia, come il patch clamping utilizzato nei sistemi eucariotici, è che ora è possibile monitorare le variazioni della dinamica della membrana e delle concentrazioni intracellulari di ioni nei batteri mediante l'uso di fluorescenza. In genere, le persone alle prime armi con questo metodo incontrano difficoltà perché richiede un certo sforzo ottimizzare le concentrazioni dei coloranti.

Condizioni di carico e impostazioni di rilevamento Iniziare con cellule batteriche. Dopo averle centrifugate, risospendere prima il pellet in almeno un millilitro di PBS per ottenere 100 milioni di UFC per millilitro, una quantità sufficiente per cinque campioni. Trasferire un millilitro delle cellule lavate in una provetta da microcentrifuga e aggiungere 25 microlitri di un filtro uno molare.

Soluzione madre sterile di glucosio, quindi incubare le cellule in un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius per 15 minuti. La quantità di glucosio aggiunta può variare in base all'esperimento. Dopo 15 minuti, aggiungere cinque microlitri di dieback 50 micromolare e 10 microlitri di soluzione di PI.

Mescolare accuratamente le cellule aspirando e dispensando più volte con una pipetta. Successivamente, dividere questa sospensione cellulare in cinque pozzetti campione di una piastra trasparente a 96 pozzetti. Inserire la piastra in un lettore di piastre preriscaldato impostato per la rilevazione di dieback NP.

Ora monitorare l'equilibrazione del segnale di morte cellulare attraverso le membrane cellulari effettuando misurazioni ogni minuto per 30-40 minuti, fino a quando la lettura non si stabilizza al valore precedente al trattamento. Successivamente, espellere la piastra e aggiungere l'agente sperimentale scelto. Rimettere immediatamente la piastra nel lettore e continuare a monitorare il segnale di morte cellulare e la fluorescenza del PI per il periodo di tempo desiderato.

Quando si prepara il buffer di carico per questa procedura, assicurarsi di agitare brevemente il vortice prima di aggiungere PBS e probenecide. Dopo aver aggiunto queste soluzioni, agitare nuovamente il vortice e avvolgere il tutto in alluminio per un millilitro di sospensione cellulare 2x. Aggiungere un millilitro di buffer di carico 2x.

Questo è sufficiente per 10 campioni. Incubare la miscela in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 75 minuti, al riparo dalla luce durante tutti questi saggi. La concentrazione del colorante e il tempo di incubazione potrebbero necessitare di essere adattati per ottimizzare il saggio e il livello di rilevamento della fluorescenza di base, a seconda della specifica specie batterica e di altre variabili del sistema sperimentale.

Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte, ogni lavaggio. Raccogliere le cellule a 2.400 G per 10 minuti e risospendere in due millilitri di PBS contenente una x pronic. Dopo i tre lavaggi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per altri 30 minuti.

Questo consente all'esterasi all'interno dei batteri di idrolizzare i gruppi esteri del colorante, rendendo attivo il colorante all'interno della cellula. Successivamente, centrifugare le cellule, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in due millilitri di PBS contenente Probenecid 1x. Se necessario, il glucosio può essere aggiunto nuovamente per re-energizzare i batteri. Caricare 200 microlitri delle cellule in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per ogni campione e inserire la piastra in un lettore pre-riscaldato per un campione.

Prima di tutto, stabilire una lettura di base alle lunghezze d'onda appropriate e a una frequenza di una lettura al secondo per un minuto. Successivamente, rimuovere la piastra e aggiungere circa cinque microlitri del trattamento scelto. A questo.

Pipettare rapidamente su e giù alcune volte nel pozzetto per mescolare il trattamento e reinserire immediatamente la piastra nel lettore. Continuare a effettuare le misurazioni per il tempo desiderato. Per analizzare i dati, calcolare il rapporto tra i valori di fluorescenza per ciascun punto temporale dividendo il valore uno per il valore due, e riportare i valori del rapporto su un grafico.

In preparazione, creare una serie di cinque o sei tamponi ad alto contenuto di potassio con valori di pH compresi tra 6,5 e 8,0. Come nella procedura precedente, utilizzare un vortice per preparare il tampone di caricamento 2x a partire dal lavato di una coltura in fase logaritmica media e concentrare le cellule. Quindi sostituire il SNAT con due millilitri di BS per ottenere una sospensione cellulare 4x.

Combinare un millilitro della sospensione cellulare 4x con un millilitro del buffer di caricamento 2x. Incubare ora le cellule in un bagnomaria a 30 °C per 40 minuti. Proteggere dalla luce.

Ora lavare le cellule tre volte. Raccogliere le cellule come mostrato in precedenza. Aggiungere nuovamente quattro millilitri di PBS contenente due x prop Benin e una millimolare di glucosio ed eseguire nuovamente la centrifugazione dopo i tre lavaggi.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per altri cinque minuti. Per determinare il filtro della fluorescenza di fondo, sterilizzare circa 500 microlitri della sospensione batterica attivata per rimuovere i batteri. Successivamente, trasferire 200 microlitri del filtrato in una piastra a 96 pozzetti e misurare l'assorbanza da quel pozzetto per un minuto.

Per ottenere una curva di calibrazione in vivo, centrifugare 500 microlitri di ALI watts di cellule caricate ed attivate e risospendere. Sospendere le cellule in una serie di tamponi ad alto contenuto di potassio a diverso pH; in ogni campione aggiungere 20 micromolari di risina. Questo permette di equilibrare il pH intracellulare delle cellule al pH del tampone circostante.

Quindi incubare i campioni a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire i campioni nella piastra a 96 pozzetti presente nel lettore di piastre. Misurare la fluorescenza di ciascun campione per alcuni minuti al fine di stabilire una lettura iniziale per ogni pozzetto.

Per analizzare questi dati, sottrarre i valori di fluorescenza di fondo, quindi calcolare il rapporto tra i valori di fluorescenza dividendo il valore uno per il valore due. Riportare i valori del rapporto per ciascun tampone a diverso pH per creare la curva di calibrazione necessaria per misurare le variazioni del pH intracellulare. Caricare campioni da 200 microlitri di cellule energizzate in una piastra e misurare la fluorescenza ogni cinque secondi per cinque minuti.

Aggiungere contemporaneamente 10 micromolari di CCCP a un campione, mentre si aggiungono gli agenti di interesse agli altri campioni. Il CCCP rappresenta un controllo positivo sincronizzato nel tempo per la riduzione del pH intracellulare. Rimettere immediatamente la piastra nel lettore e continuare a misurare la fluorescenza ogni cinque secondi per 10 minuti.

Come controllo aggiuntivo, aggiungere 20 micromolari di NI garrison a tutti i campioni per equilibrare il pH dei batteri a quello del tampone per altri cinque minuti. Quando si studia la polarità della membrana, i batteri devono essere incubati con il colorante per circa 40 minuti, in modo da permettere al colorante di equilibrarsi sulla membrana. Questo è indicato dalla diminuzione costante della fluorescenza che poi si stabilizza.

Il PI non richiede un'equilibratura, ma insieme al dieback è utile per monitorare la rottura della membrana. Contemporaneamente alla polarità, la depolarizzazione e la rottura dei batteri sono indicate da un aumento dell'intensità fluorescente di entrambi i coloranti per meno di 2:00 AM; il rapporto tra i due segnali fluorescenti viene calcolato e un aumento o una diminuzione di questo rapporto corrisponde al calcio intracellulare. Per PBFI, il potassio intracellulare viene misurato mediante rapporti di fluorescenza.

L'idrogeno intracellulare viene misurato utilizzando i rapporti di fluorescenza di B-C-E-C-F am. Dopo l'aggiunta dell'ionoforo per ioni calcio, la calcio ionomicina permette al calcio di entrare nella cellula, causando un aumento del rapporto di fluorescenza. L'aggiunta di valinomicina ha l'effetto opposto, inducendo il potassio a uscire dalla cellula, fenomeno indicato da una diminuzione del rapporto di fluorescenza.

B-C-E-C-F consente la misurazione del pH intracellulare; inizialmente vengono costruite curve di calibrazione in diversi tamponi di pH noto. Una diminuzione del rapporto di fluorescenza del colorante corrisponde a una diminuzione del pH. Questo fenomeno è osservabile con l'aggiunta di protoni o del composto CCCP, rappresentato dalla linea nera, e dopo l'aggiunta di un dissipatore della forza protonomotrice, indicato dalla linea blu.

La seconda freccia mostra l'aggiunta di nisina, che equilibra le concentrazioni di ioni idrogeno intracellulari ed extracellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la depolarizzazione della membrana, l'integrità della membrana e le concentrazioni intracellulari di ioni nelle cellule batteriche. Dovresti inoltre essere in grado di utilizzare questo protocollo come punto di partenza per studiare altre proprietà delle cellule batteriche.