Ingegneria fibrina a base di tessuto costrutti da miofibroblasti e applicazione di vincoli e la tensione per indurre Organizzazione cellulare e collagene (Re)

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare costrutti a base di fibrina che possono essere utilizzati per studiare la riorganizzazione cellulare e del collagene. Ciò si ottiene isolando prima le cellule safene venose umane dal tessuto del donatore ed espandendole in coltura. Il secondo passo consiste nell'incollare strisce di velcro su membrane flessibili.

Nella parte inferiore di sei piastre a pozzetti per creare uno spazio quadrato al centro, che conterrà il costrutto. Successivamente, una miscela di cellule di trombina di fibrinogeno e perle marcate in modo fluorescente viene aggiunta allo spazio tra le strisce di Velcro e viene lasciata polimerizzare per formare un gel. Il passaggio finale consiste nel condizionare le cellule e indurre la formazione di matrici orientate applicando una deformazione ciclica uniassiale al costrutto o rilasciando la deformazione statica.

Tagliando il gel di fibrina dai perni in Velcro in un'unica direzione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che descrivono i cambiamenti nella riorganizzazione cellulare e del collagene monitorando i costrutti nel tempo utilizzando la microscopia confocale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del rimodellamento del collagene relative alla velocità di formazione del collagene e al riorientamento da parte di diversi tipi di cellule.

Per iniziare, acquisire tessuto donatore umano dalla saana magna venosa in conformità con le linee guida per l'uso secondario del materiale. Quindi isolare le cellule safene venose umane o H VSC dal tessuto seguendo il protocollo di Schnell et al, e conservarle in azoto liquido. Se necessario, espandere le cellule inserendo una fiala contenente 250.000 VSC H a scongelamento rapido in un pallone T 75 con 15 millilitri di crescita preriscaldata.

Terreno composto da 440 millilitri di DMEM avanzato, 50 millilitri di siero fetale bovino. Cinque millilitri di 100 X penna streptococco e cinque millilitri di 200 millimolari L glut max. Cambiare il terreno di coltura ogni due o tre giorni per circa due settimane fino a quando le cellule non sono confluenti.

Una volta confluenti, raccogliere e dividere le cellule fino al passaggio. Nove. Utilizzo della tripsina fino a quando non si raggiunge un numero adeguato di cellule per l'esperimento pianificato. Sono necessari circa 1,5 milioni di celle per ogni costrutto.

Quando è stato coltivato un numero adeguato di cellule, raccoglierle al 90% di fluenza di co e quindi sospendere le cellule nei terreni di crescita a 15 milioni di cellule per millilitro. Metterli sul ghiaccio fino a quando non saranno necessari. Preparare la colla siliconica mescolando l'elastomero e l'agente indurente in un rapporto di 10 a uno.

Usa questa colla per attaccare strisce di sette millimetri per tre millimetri catturate dal lato morbido del Velcro alla membrana flessibile delle piastre cellulari flessibili. Per formare una forma a croce con un centro aperto, asciugare la colla siliconica per una notte in forno a 60 gradi Celsius per garantire un indurimento della colla. Quindi sterilizzare la piastra aggiungendo cinque millilitri di etanolo al 70% a ciascun pozzetto e incubando per 30 minuti a temperatura ambiente.

Sciacquare i pozzetti tre volte con PBS sterile. Quindi rimuovere il PBS dai pozzetti e le strisce di Velcro. Posizionare la piastra scoperta sotto la lampada UV di una cappa per coltura tissutale per 30 minuti per sterilizzare le superfici.

Una volta terminato, coprire il piatto e mantenerlo sterile fino al momento dell'uso. Successivamente, preparare il terreno di ingegneria tissutale aggiungendo 130 milligrammi di acido allico, due fosfati a 500 millilitri di terreno di crescita durante i primi sette giorni di coltura. Inoltre, aggiungere un milligrammo per millilitro di acido epsilon aminocaproico per evitare che la fibrina si degradi, sciogliere il fibrinogeno a una concentrazione di 10 milligrammi di proteine effettive per millilitro di terreno di ingegneria tissutale integrato con acido aminocaproico mescolando delicatamente.

Poi sterile. Filtrare la soluzione di fibrinogeno attraverso un filtro per siringa da 0,22 micron e conservarla in ghiaccio fino al momento dell'uso. Successivamente, preparare la soluzione di trombina diluendo la trombina madre a una concentrazione finale di 10 unità internazionali per millilitro in un terreno di ingegneria tissutale integrato con acido aminocaproico e conservarla in ghiaccio fino all'uso.

Successivamente, 100 microlitri della sospensione cellulare preparata in precedenza in una provetta da microcentrifuga per ogni costrutto di tessuto che verrà realizzato. Centrifugare le cellule a 350 volte G per sette minuti, quindi scartare il surnatante, risospendere le cellule in 50 microlitri della soluzione di trombina e aggiungere quattro microlitri, una microsfera di polistirene fluorescente blu da utilizzare come marcatori di riferimento interni. Quindi, aspirare 50 microlitri della soluzione di fibrinogeno in un puntale per pipetta.

Aumentare il volume della pipetta a 100 microlitri, quindi pipettare la soluzione da 50 microlitri di fibrinogeno nella provetta da centrifuga. Con la miscela di trombina e cellule, mescolare delicatamente la trombina e il fibrinogeno aspirando la miscela da 100 microlitri per prevenire la formazione di bolle. Una volta che la soluzione è completamente miscelata, pipettare la miscela di gel dentro e tra le strisce di Velcro siamo rapidamente come il tempo tipico del geliano per i gel di fibrina, una volta miscelati è dell'ordine di 20 secondi, incubare i costrutti per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato tamponato con anidride carbonica al 5% per consentire loro di gelificare.

Quindi aggiungere sei millilitri di terreno di coltura tissutale con acido aminocaproico a ciascun pozzetto e riposizionare la piastra nell'incubatore. Sostituire il supporto ogni due o tre giorni per i primi sette giorni. Dopo una settimana, rimuovere l'integratore di acido aminocaproico dal terreno e continuare a coltivare i gel con i terreni di ingegneria tissutale.

Continuando a scambiarlo ogni due o tre giorni nei primi cinque giorni di coltura, consente ai costrutti di compattarsi e riorganizzarsi sotto sforzo statico formando fibre di collagene, biassialmente a causa dei vincoli delle fibre per indurre la riorganizzazione del collagene in un'unica direzione in condizioni statiche. Per prima cosa, coltivare le cellule per un'altra settimana al giorno 12, tagliare il costrutto di tessuto da due strisce di velcro in un'unica direzione. Ciò causerà una tensione nella direzione opposta quando la fibrina si compatta.

In alternativa, per il caricamento ciclico, posizionare le piastre sopra una serie di pali di carico in una piastra di base a celle flessibili, dotata di una guarnizione il sesto giorno, i pali di carico sosterranno la membrana flessibile dei pozzetti e consentiranno alla base dei perni di essere tirata verso il basso per creare deformazione in un'unica direzione. Quindi, impostare il protocollo software per applicare una deformazione ciclica al costrutto. Il programma mostrato qui è per una deformazione intermittente simile a un'onda sinusoidale, che tende il costrutto da zero al 5% di deformazione a un hertz per periodi di tre ore, alternati a tre ore di riposo.

Con il programma preparato, accendere la pompa del vuoto e avviare il programma. Il controller regolerà la forza del vuoto nel sistema, che tira verso il basso le membrane attorno ai montanti di supporto per applicare una deformazione ciclica ai costrutti in conformità con il programma. Esegui il programma per una settimana, avendo cura di scambiare i terreni ogni due o tre giorni dopo una settimana di condizionamento, induci la riorganizzazione del collagene ruotando il perno rettangolare di 90 gradi per cambiare la direzione del deformazione per tre giorni.

Per visualizzare il rimodellamento attivo del collagene in tempo reale, aggiungi cell tracker orange. Aggiungere una concentrazione di quattro micromolari per colorare il citoplasma e CNA 35 OG 4 88. Aggiungere una concentrazione di un micromolare per visualizzare le fibre di collagene.

Queste sonde non interferiscono con la vitalità cellulare o la formazione del collagene. Quindi incubare le cellule per un'ora in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra di coltura dall'incubatore e trasportarla in un microscopio a scansione laser confocale per visualizzare le cellule e il collagene.

Scatta immagini dei gel in superficie e fino a circa 60 micron nell'impalcatura per visualizzare i cambiamenti nell'organizzazione a questi livelli nel tempo. Quindi riportare la piastra nella configurazione di condizionamento meccanico all'interno dell'incubatrice. Ripetere questa procedura ogni pochi giorni per monitorare i progressi della riorganizzazione cellulare in risposta agli stimoli.

Le microsfere fluorescenti aggiunte alla miscela di fibrinogeno prima della polimerizzazione rimangono intrappolate nella rete di fibrina e funzionano bene come marcatori di riferimento per garantire la visualizzazione della stessa area in diversi punti temporali quando coltivate in condizioni statiche e si attaccano a tutti e quattro i perni. Non è possibile vedere un vero orientamento della fibra o cellulare tre giorni dopo il taglio di due delle connessioni dei perni della fibra. La deformazione uniassiale causata dalla contrazione ha allineato le fibre di collagene mostrate in verde.

cellule safene venose umane che sono state ciclicamente tese in un'unica direzione per una settimana sono mostrate qui sulla superficie del costrutto e a 60 micron nel gel. Quando la direzione della deformazione è stata ruotata di 90 gradi, la risposta cellulare dopo tre giorni è risultata essere più rapida in superficie che nel nucleo del tessuto. Una volta padroneggiati l'ingegneria, questi costrutti tissutali basati su FI possono essere eseguiti in circa due ore.