Protocollo ottimizzato per la preparazione dell'intero montaggio retinico per l'imaging e l'immunoistochimica

Questa procedura utilizza il tessuto retinico di topo per dimostrare come stabilizzare il delicato tessuto neurale per preservare l'integrità strutturale. Durante le diverse fasi della colorazione immunoistochimica, prima nucleare l'occhio, rimuovere la cornea e separare la retina dalla sclera. Praticare delle incisioni nella conchiglia oculare retinica per appiattire il tessuto.

Quindi collegare la retina a una membrana rinforzata con un anello utilizzando un trasferimento di aspirazione senza manipolazione diretta per preservare l'integrità del tessuto. Ora trasferisci l'anello su una piastra a più pozzetti per la colorazione. I nostri risultati mostrano che questa tecnica può essere utilizzata efficacemente nei tessuti vivi e fornisce un substrato superiore per l'imaging delle proteine sinaptiche rispetto ai metalli esistenti per la manipolazione della retina sezionata.

Queste tecniche consentono il trasferimento di tessuti delicati con una manipolazione fisica minima. Ciò ridurrà la possibilità di distorsioni e danni. Abbiamo avuto questa idea per la prima volta quando abbiamo avuto bisogno di registrare da un tessuto montato piatto in RD un topo, un modello di degenerazione retinica, e questa retina di topo sono estremamente sottili e fragili a causa dell'estesa perdita di cellule causata dalla mutazione Chief.

Un postdoc nel nostro laboratorio si unirà a me per dimostrare la procedura. Innanzitutto, nucleare gli occhi di un topo anestetizzato e trasferire gli occhi in cumuli ossigenati di soluzione ringer tamponata. Per rimuovere la cornea, tenere l'occhio al limbus con una pinza, quindi tagliare un percorso circolare lungo l'ora serrata.

Estrarre la lente con una pinza per iniezioni in bolo e registrazioni elettrofisiologiche. Usa una pinza per bordi sfumati per rimuovere quanto più vitreo possibile. Ora stabilizza la conchiglia oculare tenendo saldamente la sclera con una pinza.

Posizionare una seconda serie di pinze tra la retina e l'oculare. Muovi lentamente la pinza lungo la circonferenza. Taglia il nervo ottico tra la retina e l'oculare e rimuovi l'oculare con le forbici.

Praticare incisioni dalla periferia della retina fino al nervo ottico. In alternativa, per utilizzare l'intera retina, praticare delle incisioni dalla periferia a metà del nervo ottico per accorciare il supporto. Rimuovere la parte in eccesso con un tornio.

Quindi lucidare le superfici ruvide con carta vetrata fine. Rimuovere i piedini da sotto l'anello. Tagliare la punta stretta di una pipetta di plastica.

Quindi trasferire il tessuto con un po' di soluzione sulla membrana. Rimuovere gradualmente la soluzione mentre si allarga la retina e aprire il tessuto. Ora attacca la retina alla membrana con le cellule gangliari rivolte verso l'alto.

Tagliare la punta di tenuta di una siringa da un millilitro e posizionarla direttamente sotto il fazzoletto. Tirare indietro lo stantuffo fino a un volume di circa 0,3 millilitri per ingranare fisicamente il tessuto all'interno della membrana. Estrarre alcune pipette capillari di silicato di boro utilizzando una resistenza di circa un mega.

Quindi rompere delicatamente la punta di ogni pipetta per cerotto. Quindi, aggiungere 0,3 microlitri di soluzione di colorante stock is selectin a 10 microlitri della soluzione di ringer tamponato a cumuli. Posizionare ora la membrana nella camera di registrazione perfusa con una soluzione calda ossigenata di ringer tamponato.

Posizionare la pipetta contenente il colorante contro la membrana limitante interna utilizzando un manipolatore microm. Far avanzare ulteriormente la pipetta per penetrare nella membrana limitante interna. Quindi iniettare la soluzione colorante in una o più posizioni mirate.

Ora attendi 10 minuti affinché il tessuto si riprenda dall'iniezione mentre lo osservi sotto l'illuminazione a epifluorescenza. Se lo si desidera, trasferire l'inserto in una piastra di coltura con fondo di vetro, posizionandolo con la retina rivolta verso il basso. Aggiungere una goccia di soluzione cumulativa per mantenere umido il campione.

Inoltre, posizionare tre punti di grasso sottovuoto attorno al perimetro dell'anello di plastica per fissare saldamente l'inserto al piatto di coltura. Trasferire la capsula al microscopio dopo la fissazione, immergere la membrana nelle soluzioni a gradiente di saccarosio. Accidere la membrana dall'anello di inserimento in plastica.

Rimuovere quanta più soluzione possibile con le salviette Kim e posizionarla sul param con la retina rivolta verso l'alto. Trasferire la paraforma con il tessuto nella camera del criostato e aggiungere una goccia di terreno OCT. Utilizzare il dispositivo di congelamento rapido per accelerare il congelamento.

Staccare il campione congelato e capovolgerlo. A questo punto, tagliare l'OCT congelato in eccesso. Lasciare circa due millimetri intorno al campione su tre lati e a pochi millimetri dal lato, che verrà attaccato al supporto.

Coprire il lato retinico esposto con una goccia di OCT lasciando libera l'area attaccata. Congelare la membrana contenente il tessuto retinico. Posizionare una goccia di OCT su un anello porta freddo.

Inserire immediatamente il campione congelato nella goccia. Tagliare sezioni da 10 a 20 micron a una temperatura negativa di 19 gradi Celsius e posizionarle su vetrini di adesione caldi in polilisina. Posizionare i vetrini con le sezioni attaccate su una piattaforma riscaldante a 41 gradi Celsius per due o tre minuti al buio.

Quindi conservare i campioni a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Questo esperimento illustra una caratterizzazione rapida e semplice del sistema vascolare retinico come un'elaborata rete di vasi sanguigni che si estendono su più strati retinici. Combinando un carico in bolo di isoselectina con l'etichettatura ad immersione in sulfamidico rumina, il tessuto vivente può essere visualizzato e scansionato quasi immediatamente nella retina, i vasi sanguigni possono essere etichettati dallo strato superficiale a quello profondo.

A differenza di una diffusione relativamente buona, la SRH è la selectina che non permea bene attraverso la membrana limitante interna. Ci sono diversi vantaggi della fissazione con carbimmide rispetto alla fissazione convenzionale con para formaldeide quando si marcano le proteine sinaptiche, ad esempio, dopo un breve periodo di fissazione con colorazione immunofluorescente con carbimmide per il marcatore sinaptico. La PSD 95 nell'IPL aveva un aspetto punteggiato brillante coerente con la distinzione delle singole sinapsi.

Al contrario, quando si utilizza il fissativo convenzionale dell'aldeide paraformale, l'identificazione delle componenti sinaptiche è meno chiara. Risultati simili sono stati ottenuti nelle sezioni del criostato retinico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come montare un tessuto delicato su questa membrana e come applicare la colorazione citochimica alla preparazione un master.

Ci vorranno 15 minuti per collegare la retina al filtro.