Name: Protocollo ottimizzato per la preparazione dellintero montaggio retinico per limaging e limmunoistochimica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per la preparazione di montaggi retinici interi nel topo, che preserva l'integrità tissutale per l'immunoistochimica e l'imaging delle proteine sinaptiche. Questo metodo migliora la visualizzazione strutturale della retina.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH R01-EY020535 (B.T.S), dalla Fondazione Internazionale per la Ricerca sulla Retina e dalla Fondazione Karl Kirchgessner (B.T.S).

In tutte le procedure sperimentali, gli animali sono stati trattati secondo le norme della Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e in conformità con i protocolli approvati dal Weill Cornell Medical College. Gli animali sono stati soppressi con anidride carbonica e successiva lussazione cervicale.
1. Dissezione della retina a montaggio intero
<ol>
	<li>Dopo che il topo è stato soppresso, enucleare i suoi occhi e metterli nella soluzione di Ringer ossigenata con tampone HEPES (Tabella 1).</li>
	<li>Rimuovere la cornea tagliando in un percorso circolare lungo l'ora serrata con piccole forbici, tenendo l'occhio al limbus con una pinza. Estrarre la lente con una pinza.</li>
	<li>Rimuovere quanto più vitreo possibile, utilizzando una pinza a lama smussata. Questo passaggio è importante per le iniezioni in bolo e le registrazioni elettrofisiologiche; Non è necessario quando si esegue solo l'immunoistochimica.</li>
	<li>Staccare la retina dall'oculare posizionando una pinza tra la retina e l'oculare, muovendo lentamente la pinza lungo la circonferenza. Stabilizzare l'oculare tenendo saldamente la sclera con una seconda serie di pinze. Tagliare il nervo ottico nella posizione tra la retina e l'oculare per facilitare la separazione della retina dall'oculare.</li>
	<li>La retina può essere sezionata in pezzi (ad es. quarti) o utilizzata nel suo insieme. Per tagliare a pezzi, usa le forbici per praticare incisioni dalla periferia della retina fino al nervo ottico. In alternativa, per utilizzare l'intera retina, praticare delle incisioni dalla periferia a metà del nervo ottico. Le incisioni aiuteranno a fare una preparazione piatta.</li>
</ol>
2. Montaggio su inserto membrana in PTFE idrofilizzato
<ol>
	<li>Preparare la membrana come descritto di seguito. Quando vengono eseguite registrazioni fisiologiche o esperimenti di iniezione di colorante, accorciare il supporto utilizzando un tornio o una sega a mano in modo che l'anello rimanente abbia un'altezza di 1 mm. 
	Nota: gli inserti della piastra di coltura possono essere non modificati o modificati (Figura 1A). La scelta della configurazione è dettata dallo scopo dell'esperimento. Per l'immunocolorazione, è adatto un inserto non modificato.</li>
	<li>Lucidare le superfici ruvide con carta vetrata fine (grana 300 o superiore).</li>
	<li>(Facoltativo) Rimuovere i piedini sotto l'anello con le forbici.</li>
	<li>Per rimuovere eventuali detriti, sciacquare o sonicare la membrana in acqua distillata per 2-3 minuti.</li>
	<li>Montare il tessuto sulla membrana (Figura 1A). Posizionare il fazzoletto con un po' di soluzione sopra la membrana con una pipetta di trasferimento in plastica. Se necessario, tagliare la punta stretta della pipetta per evitare che il campione di tessuto aderisca alla pipetta durante il trasferimento.</li>
	<li>Attacca la retina con le cellule gangliari (GC) verso l'alto: sulla membrana, rimuovi gradualmente la soluzione mentre allarga la retina e dispiega le pieghe con una pinza.</li>
	<li>Sul lato opposto della membrana, posizionare una siringa vuota (1 ml) direttamente sotto il tessuto. Applicare l'aspirazione tirando indietro lo stantuffo fino a un volume di 0,2-0,3 ml. Aumentare la superficie di aspirazione tagliando la punta di tenuta della siringa prima dell'uso. Il tessuto non richiede ulteriori trattamenti per l'adesione, poiché è fisicamente invischiato all'interno della membrana.</li>
</ol>
3. Iniezione in bolo di isolectina Alexa 488
<ol>
	<li>Preparare le pipette per cerotti e la soluzione colorante. Estrarre le pipette patch dal vetro capillare borosilicato con un estrattore Flaming/Brown, con una resistenza di ~1 MΩ. Rompere delicatamente la punta della pipetta.</li>
	<li>Preparare la soluzione colorante aggiungendo 0,3 μl di soluzione madre di isolectina Alexa 488 a 10 μl della soluzione di Ringer tamponata HEPES descritta al punto 1.2.</li>
	<li>Trasferire il campione nella configurazione del patch-clamp per l'iniezione (Figura 1C). Posizionare la membrana con il tessuto attaccato nella camera di registrazione perfusa con la soluzione di Ringer riscaldata (37 °C) e ossigenata tamponata con HEPES.</li>
	<li>Posizionare la pipetta contenente il colorante contro la membrana limitante interna (ILM, Figura 2A). Utilizzando il micromanipolatore, far avanzare ulteriormente la pipetta contro l'ILM fino a quando non penetra in essa. Iniettare la soluzione colorante con una pressione di 10-20 psi per 1 sec utilizzando un picospritzer. Una o più sedi possono essere prese di mira per l'iniezione (Figura 2B). Se non è disponibile un picospritzer, è possibile utilizzare una siringa da 10 ml per erogare una pressione positiva dell'aria per l'iniezione.</li>
	<li>Incubare il tessuto iniettato per 10 minuti. Durante l'incubazione, il tessuto iniettato può essere visualizzato sotto l'illuminazione dell'epifluorescenza.</li>
	<li>Dopo l'etichettatura, il preparato può essere portato al microscopio per l'imaging. Trasferire l'inserto in una piastra di coltura con fondo di vetro, posizionando la retina con la retina rivolta verso il basso (Figura 1C).</li>
	<li>Aggiungere una goccia di soluzione HEPES per mantenere umido il campione.</li>
	<li>Posizionare 2-3 punti di grasso sottovuoto attorno al perimetro dell'anello di plastica per fissare saldamente l'inserto al fondo della piastra di coltura.</li>
	<li>Trasferire il piatto sul tavolino del microscopio.</li>
</ol>
4. Fissazione di paraformaldeide e carbodiimmide
<ol>
	<li>Fissare il campione trasferendo l'inserto nel fissativo per 15 minuti. Possono essere utilizzati tempi di fissazione più lunghi o più brevi, a seconda dell'applicazione. Entrambi i fissativi possono essere efficacemente utilizzati per fissare GFP, isolectina o idrazidi fluorescenti di Alexa (ad esempio utilizzati per riempire le cellule nelle registrazioni patch-clamp). 
	Nota: Per il fissaggio, possono essere utilizzate soluzioni di carbodiimmide al 4% o paraformaldeide al 4%. Per mantenere l'aderenza, la fissazione deve essere eseguita dopo che il tessuto è già stato attaccato alla membrana. Il tessuto può essere fissato immediatamente dopo il montaggio o dopo la registrazione fisiologica e/o l'iniezione in bolo.</li>
	<li>Sciacquare il fazzoletto in tampone fosfato (PB) per 30 minuti. Successivamente, il tessuto può essere lavorato come montatura intera (passaggio 5) o tagliato in sezioni verticali e quindi lavorato (passaggi 6 e 7).</li>
</ol>
5. Immunocolorazione di Wholemounts retinici
<ol>
	<li>In una capsula a 24 pozzetti (Figura 1D) bloccare i pezzi di retina sulla membrana per 1 ora in una soluzione colorante.</li>
	<li>Diluire gli anticorpi primari di topo anti-PSD-95 1:300 nella soluzione colorante e applicare per 48 ore a temperatura ambiente al buio. Aggiungere ~100-150 μl di soluzione di anticorpi in ciascun pozzetto con il tessuto. Per evitare che si secchino, riempire i pozzetti inutilizzati con acqua distillata.</li>
	<li>Risciacquare per 20 minuti in PB, 3 volte.</li>
	<li>Incubare per 24 ore nell'anticorpo secondario Alexa 568 anti-topo d'asino disciolto 1:500 nella soluzione colorante.</li>
	<li>Risciacquare per 20 minuti in PB, 3 volte.</li>
	<li>Posizionare l'inserto con il fazzoletto colorato in una capsula di Petri standard da 3 cm riempita con soluzione di PB. Con piccole forbici, ritaglia la parte della membrana contenente la retina dall'anello.</li>
	<li>Trasferire la retina sulla membrana su un vetrino retina verso l'alto. Rimuovere il PB, aggiungere il supporto di montaggio. Posizionare piccoli pezzi di un vetrino coprioggetti rotto tra il vetrino e i vetrini coprioggetti per evitare schiacciamenti prolungati e danni alla retina. Posizionare il vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Sigillare il vetrino coprioggetti in posizione con lo smalto per unghie. Conservare i vetrini al buio, in frigorifero.</li>
</ol>
6. Sezionamento verticale di tessuto montato su membrana
<ol>
	<li>Dopo la fissazione, immergere il tessuto sulla membrana nelle soluzioni di gradiente di saccarosio al 10%, 20% e 30% di saccarosio rispettivamente per 30 minuti, 1 ora e durante la notte. La fase notturna viene eseguita a 4 °C in frigorifero, tutte le altre fasi a temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando le forbici, rimuovere la membrana con il fazzoletto dall'anello di inserimento in plastica.</li>
	<li>Posizionare la membrana tagliata su Parafilm con la retina rivolta verso l'alto e rimuovere quanta più soluzione possibile con Kimwipes.</li>
	<li>Mettere il Parafilm con il fazzoletto nella camera del criostato e aggiungere una goccia di terreno OCT. Utilizzare il dispositivo di congelamento rapido per accelerare il congelamento.</li>
	<li>Staccare il campione congelato e capovolgerlo.</li>
	<li>Tagliare l'OCT congelato in eccesso. Lasciare circa 2 mm intorno al campione su tre lati e lasciare 5-6 mm dal lato che verrà attaccato al supporto.</li>
	<li>Coprire il lato retinico esposto (lato membrana) con una goccia di OCT. Lasciare libera l'area di fissaggio.</li>
	<li>Congelare la membrana con tessuto retinico. Ora il campione è pronto per essere posizionato su un supporto di taglio.</li>
	<li>Posizionare una goccia di OCT su un anello porta freddo. Inserire immediatamente il campione congelato nella goccia.</li>
	<li>Tagliare sezioni di 10-20 μm di spessore, impostando la temperatura del criostato a -19 °C. Utilizzare vetrini di adesione polisinica caldi (temperatura ambiente). Lasciare i vetrini con le sezioni attaccate su una piattaforma riscaldante per ~2-3 minuti (41 °C) al buio per garantire una salda adesione delle sezioni.</li>
	<li>Mettere i vetrini in una scatola di immagazzinaggio e conservarli a -20 °C fino al momento dell'uso.</li>
</ol>
7. Immunocolorazione delle sezioni retiniche
<ol>
	<li>Togli i vetrini con le sezioni dal congelatore. Lasciarli a temperatura ambiente per 1 minuto per eliminare la condensa.</li>
	<li>Circonda le sezioni con un bloccante liquido per creare una barriera per un'ulteriore incubazione.</li>
	<li>Posizionare i vetrini nella scatola di incubazione. Coprire il fondo della scatola con acqua per evitare l'evaporazione della soluzione anticorpale.</li>
	<li>Risciacquare con PB per 5 min.</li>
	<li>Preparare le stesse soluzioni coloranti e seguire i passaggi del passaggio 5. L'incubazione con l'anticorpo primario avviene durante la notte e con il secondario di 1 ora. Non utilizzare vetri rotti tra il vetrino coprioggetti e il vetrino.</li>
</ol>

<ol><li>Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC+fixation+increases+the+demonstrability+of+biogenic+amines+in+the+unicellular+Tetrahymena%3A+a+flow+cytometric+and+confocal+microscopic+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis.</a> Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
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<li>Tymianski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+use+for+a+carbodiimide+compound+for+the+fixation+of+fluorescent+and+non-fluorescent+calcium+indicators+in+situ+following+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments.</a> Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).</li>
<li>Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+interactions+between+excitatory+and+inhibitory+retinal+synapses+control+visual+output%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output.</a> J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).</li>
<li>Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+and+cost+efficient+approach+to+functional+and+structural+assessment+of+living+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).</li>
<li>Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+deficiency+exacerbates+impairment+in+a+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration.</a> Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).</li>
<li>Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+glycinergic+input+to+bipolar+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).</li>
<li>Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+alpha+7+nicotinic+acetylcholine+receptors+by+bipolar%2C+amacrine%2C+and+ganglion+cells+of+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina.</a> J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

L'elevata biocompatibilità e trasparenza delle soluzioni della membrana in PTFE idrofilizzata è vantaggiosa quando si lavora con tessuti viventi. Questa preparazione è stata utilizzata con successo in lavori precedenti per registrazioni patch-clamp delle risposte alla luce8-10. Qui, mostriamo come questo approccio può essere adottato per l'analisi strutturale della retina dell'intero mount.
La tecnica di caricamento in bolo può essere utilizzata efficacemente per l'etichettatura di ...

L'esecuzione dell'immunoistochimica in tessuti delicati e intatti comporta il rischio di danni durante la manipolazione e il trasferimento. Questo può verificarsi sia nelle fette di cervello che in altri tessuti sottili, come la retina degenerata. Inoltre, esistono alcuni metodi di fissazione dei tessuti che possono essere vantaggiosi per l'immunocolorazione delle strutture neuronali, ma che comportano una stabilità strutturale compromessa, precludendone l'uso. Un esempio particolare di ciò è la fissazione a base di carbodiimmide, che è superiore per colorare i recettori e gli ormoni1-7, ma è comunemente evitata a causa dell'instabilità del tessuto fissato.
Qui, descriviamo una procedura che utilizza una membrana in PTFE idrofilizzata per sostenere strutturalmente tessuti delicati, fissi o non fissati, per una varietà di tecniche di colorazione. La membrana di supporto consente la manipolazione di tessuti delicati prima e dopo la fissazione, consentendo diverse fasi di lavorazione e riducendo al minimo il rischio di danni ai tessuti. Nel complesso, questo semplice metodo per preservare l'integrità dei tessuti offre l'opportunità di utilizzare tecniche che altrimenti potrebbero essere evitate. In quanto tale, questo approccio potrebbe essere utilizzato con successo anche per la preparazione di un'ampia varietà di tessuti, come le fette di cervello che diventano fragili in seguito alle procedure di affettatura.

<table><tbody><tr><td>Millicell Inserto per Colture Cellulari, 12 mm, PTFE idrofilo (Biopore), 0.4 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina, 1 ml</td><td>Beckton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>pinza per dissezione</td></tr><tr><td>, Dumont #55, inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>dissezione</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>sistemi di microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td>vari</td><td></td></tr><tr>Strumenti di <td>precisione del mondo</td> in<td>vetro capillare</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture con fondo in vetro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Pipette</td> a trasferimento graduato monouso Falcon <td>1008</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>16001-180</td><td></td></tr><tr><td>Piastre multipozzetto, 24 pozzetti</td><td>Beckton Dickinson</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura, #1</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72200-30</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di adesione polisinica Microscopia</td><td>elettronica</td><td>Scienze 63412-01</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Globe</td><td>1301</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 71312</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio VECTASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT medio</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm film film da laboratorio</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning grasso per alto vuoto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-PSD95</td><td>Millipore</td><td>MABN68</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Asino anti-topo Alexa 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Isolectin Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Chemicon</td><td>2170S</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341738</td><td></td></tr><tr><td>Carbodiimmide</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

protocollo ottimizzato per la preparazione dell'intero montaggio retinico per l'imaging e l'immunoistochimica

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Lavorare con tessuti delicati può essere un fattore complicante quando si esegue la valutazione immunoistochimica. Qui, presentiamo un metodo che utilizza una membrana in PTFE idrofilizzata supportata da anello per fornire supporto strutturale sia al tessuto vivente che a quello fissato durante il processo immunoistochimico, che consente l'uso di una varietà di protocolli che altrimenti causerebbero danni al tessuto. In primo luogo, ciò è dimostrato con il caricamento in bolo di marcatori fluorescenti nel tessuto retinico vivente. Questo metodo consente una rapida visualizzazione delle strutture mirate, mentre il supporto della membrana mantiene l'integrità del tessuto durante l'iniezione e consente un facile trasferimento della preparazione per ulteriori immagini o elaborazioni.
Secondo, viene descritta una procedura per la colorazione degli anticorpi nel tessuto fissato con carbodiimmide. Sebbene la fissazione della paraformaldeide sia più comune, la fissazione della carbodiimmide fornisce un substrato superiore per la visualizzazione delle proteine sinaptiche. Una limitazione della carbodiimmide è che il tessuto fisso risultante è relativamente fragile; Tuttavia, questo problema viene superato con l'uso della membrana di supporto. Il tessuto retinico viene utilizzato per dimostrare queste tecniche, ma possono essere applicate a qualsiasi tessuto fragile.

Qui vengono illustrati due esperimenti rappresentativi che traggono vantaggio dall'uso di una membrana in PTFE idrofilizzata per sostenere la retina in toto durante le procedure di colorazione. Il primo esperimento mostra il metodo per la caratterizzazione rapida e semplice della vascolarizzazione retinica, una rete complessa di vasi sanguigni che si estende attraverso diversi strati retinici (Figura 2). Questo approccio combina il caricamento in bolo di isotetina con l'etichettatura per immersione media...

Il protocollo qui descritto è per la valutazione strutturale di una preparazione retinica a montaggio intero. Ciò include le descrizioni della dissezione tissutale, il montaggio su un inserto di membrana in politetrafluoroetilene idrofilizzato (PTFE), il caricamento del bolo con marcatori fluorescenti e un confronto della fissazione con carbodiimmide e paraformaldeide per l'analisi immunoistochimica dei componenti cellulari e sinaptici.

Protocollo ottimizzato per la preparazione dell'intero montaggio retinico per l'imaging e l'immunoistochimica

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Questa procedura utilizza tessuto retinico di topo per dimostrare come stabilizzare tessuti neurali delicati al fine di preservarne l'integrità strutturale. Durante diverse fasi della colorazione immunohistochimica, enucleare innanzitutto l'occhio, rimuovere la cornea e separare la retina dalla sclera. Praticare incisioni nella coppa oculare retinica per appiattire il tessuto.Quindi, attaccare la retina a una membrana rinforzata con anello utilizzando un trasferimento a sifone senza manipolazione diretta, al fine di preservare l'integrità del tessuto. Trasferire ora l'anello in una piastra multi-pozzetto per la colorazione. I nostri risultati dimostrano che questa tecnica può essere utilizzata efficacemente su tessuto vitale e fornisce un substrato superiore per l'imaging delle proteine sinaptiche rispetto ai metodi esistenti di manipolazione della retina dissezionata.Queste tecniche permettono il trasferimento di tessuti delicati con una manipolazione fisica minima. Ciò ridurrà la probabilità di distorsione e danni. Abbiamo avuto questa idea per la prima volta quando abbiamo dovuto effettuare registrazioni da tessuti montati in piano in un topo RD1, un modello di degenerazione retinica, e la retina di questo topo è estremamente sottile e fragile a causa della notevole perdita cellulare causata dalla mutazione Chief.Un ricercatore postdottorato del nostro laboratorio mi affiancherà nella dimostrazione della procedura. Innanzitutto, enucleare gli occhi di un topo anestetizzato e trasferire gli occhi in una soluzione di Ringer tamponata e ossigenata. Per rimuovere la cornea, tenere l'occhio al livello del limbo con una pinzetta ed effettuare un taglio circolare lungo l'ora serrata.Estragga la lente con pinze per iniezioni in bolo e registrazioni elettrofisiologiche. Utilizzi pinze a bordo smussato per rimuovere la maggior quantità possibile di umore vitreo. Ora stabilizzi la coppa oculare tenendo saldamente la sclera con le pinze.Posizionare un secondo paio di pinze tra la retina e la coppa oculare. Muovere lentamente le pinze lungo la circonferenza. Tagliare il nervo ottico tra la retina e la coppa oculare, quindi rimuovere la coppa oculare con le forbici.Eseguire incisioni dalla periferia retinica fino al nervo ottico. In alternativa, per utilizzare l'intera retina, effettuare incisioni dalla periferia fino a metà strada verso il nervo ottico per accorciare il supporto. Rimuovere la parte in eccesso con un tornio.Quindi levigare le superfici irregolari con carta vetrata fine. Rimuovere i piedini da sotto l'anello. Tagliare la punta stretta di una pipetta di plastica.Quindi trasferire il tessuto con un po' di soluzione sulla membrana. Rimuovere gradualmente la soluzione mentre si espande la retina e si dispiega il tessuto. Ora fissare la retina alla membrana con le cellule gangliari rivolte verso l'alto.Tagliare la punta di mantenimento di una siringa da un millilitro e posizionarla direttamente sotto il tessuto. Tirare indietro lo stantuffo fino a un volume di circa 0,3 millilitri per intrappolare fisicamente il tessuto all'interno della membrana. Prelevare alcune pipette capillari in borosilicato utilizzando una resistenza di circa un megaohm.Quindi rompere delicatamente la punta di ogni pipetta per il patch. Successivamente, aggiungere 0,3 microlitri di soluzione madre del colorante is-selectina a 10 microlitri della soluzione tampone Ringer di Heaps. Ora posizionare la membrana nella camera di registrazione perfusa con soluzione tampone Ringer di Heaps riscaldata e ossigenata.Posizionare la pipetta contenente il colorante contro la membrana limitante interna utilizzando un micromanipolatore. Procedere ulteriormente con la pipetta per penetrare la membrana limitante interna. Quindi iniettare la soluzione di colorazione in una o più posizioni mirate.Ora attendere 10 minuti per consentire al tessuto di riprendersi dall'iniezione, osservandolo in illuminazione a fluorescenza epiluminescente. Se desiderato, trasferire l'inserto in una piastra per colture con fondo in vetro, posizionandolo con la retina rivolta verso il basso. Aggiungere una goccia di soluzione heap per mantenere il campione umido.Inoltre, applicare tre punti di grasso da vuoto lungo il perimetro dell'anello di plastica per fissare saldamente l'inserzione alla piastra di coltura. Trasferire la piastra sul palco del microscopio dopo la fissazione, immergere la membrana nelle soluzioni del gradiente di saccarosio. Asportare la membrana dall'anello di plastica dell'inserzione.Rimuovere con le salviette Kim la maggior quantità possibile di soluzione e posizionare il campione sul para con la retina rivolta verso l'alto. Trasferire il paraform con il tessuto nella camera del criostato e aggiungere una goccia di mezzo OCT. Utilizzare il dispositivo per congelamento rapido per accelerare la congelazione.Staccare il campione congelato e capovolgerlo. Ora rimuovere l'eccesso di OCT congelato. Lasciare circa due millimetri intorno al campione su tre lati e millimetri dal lato che verrà fissato al supporto.Coprire il lato retinico esposto con una goccia di OCT, lasciando libera l'area attaccata. Congelare la membrana contenente il tessuto retinico. Applicare una goccia di OCT su un anello portacampione freddo.Inserire immediatamente il campione congelato nella goccia. Tagliare sezioni di 10-20 micron a meno 19 gradi Celsius e posizionarle su vetrini adesivi in polilisina caldi. Posizionare i vetrini con le sezioni attaccate su una piastra riscaldante a 41 gradi Celsius per due o tre minuti al buio.Quindi conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius. Questo esperimento illustra una caratterizzazione rapida e semplice della vascolarizzazione retinica come una rete complessa di vasi sanguigni che si estende attraverso diversi strati retinici. Combinando un caricamento bolus di iso-selettina con l'etichettatura mediante immersione in sulfa-rosamina, è possibile visualizzare e scansionare quasi immediatamente il tessuto vivente nella retina, etichettando i vasi sanguigni dallo strato superficiale a quello profondo.A differenza della SRH, relativamente ben diffusibile, la selectina non permea efficacemente attraverso la membrana limitante interna. La fissazione con carbimide presenta diversi vantaggi rispetto alla fissazione convenzionale con paraformaldeide durante l'etichettatura delle proteine sinaptiche; ad esempio, dopo un breve periodo di fissazione con carbimide, la colorazione immunofluorescente per il marcatore sinaptico PSD 95 nello strato plessiforme interno (IPL) mostrava un aspetto puntiforme brillante, coerente con la distinzione delle singole sinapsi.Al contrario, quando si utilizza un fissativo convenzionale a base di paraformaldeide, l'identificazione dei componenti sinaptici risulta meno chiara. Risultati simili sono stati ottenuti su sezioni criostatiche della retina. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come montare un tessuto delicato su questa membrana e di come applicare una colorazione citochimica al preparato.Occorreranno 15 minuti per attaccare la retina al filtro.

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