Long Term cronica

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire un'infezione cronica persistente a lungo termine delle vie aeree da pseudomonas aerogen nei topi. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando il ceppo batterico di pseudomonas aerogen selezionato. Il secondo passaggio consiste nell'includere i batteri in piccole perle di agar mescolando i batteri con agar e olio minerale a 50 gradi Celsius, quindi raffreddando la miscela a quattro gradi Celsius sotto agitazione lenta e continua.

Successivamente, l'olio minerale viene rimosso mediante diversi lavaggi con PBS e un'aliquote dei granuli di agar viene omogeneizzata e seminata su piastre di agar. Per determinare il contenuto batterico, l'ultimo passaggio consiste nell'iniettare alcune microlitri della sospensione di granuli di agar nella trachea di topi per indurre un'infezione polmonare cronica da Pseudomonas aeruginosa. Infine, il liquido di lavaggio broncoalveolare e i polmoni possono essere recuperati in diversi momenti successivi alla sfida e seminati su piastre di agar per rilevare la percentuale di topi cronicamente infetti e il carico batterico nelle vie aeree dei topi sopravvissuti. Il principale vantaggio di questi metodi con granuli di agar rispetto ai metodi esistenti è che consentono un'infezione cronica stabile a lungo termine in una elevata percentuale di topi, portando al mantenimento di un carico batterico stabile fino a un mese.

I metodi AGA bit creano nel polmone del mouse una condizione microaerobica che permette ai batteri di crescere sotto forma di microcolonie. In modo analogo alla crescita nel muco dei pazienti affetti da fibrosi cistica, questi metodi possono aiutare i ricercatori a rispondere a domande fondamentali sulla patogenesi della fibrosi cistica e di altre malattie respiratorie, nonché a testare nuove terapie contro le infezioni polmonari croniche da Pseudomonas aeruginosa. I metodi possono inoltre essere utilizzati per ottenere infezioni croniche con altri patogeni, inclusi Burkholderia dolosa o Staphylococcus aureus; sono possibili anche infezioni concomitanti con diversi patogeni o esperimenti di competizione. A dimostrazione della procedura saranno coinvolti Pheno, un postdoc, e Camil Riva, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Tre giorni prima della sfida nei topi, inoculare un’ansa piena di Pseudomonas aeruginosa dalla coltura congelata a -80 gradi Celsius su una piastra di agar triptone soia e incubare a 37 gradi Celsius per tutta la notte.

Il giorno successivo, selezionare una singola colonia inoculata in cinque millilitri di brodo di soia tripticasa e incubata a 37 °C durante la notte in un incubatore agitato a 200 giri al minuto. La mattina seguente, diluire un piccolo aliquota della coltura batterica notturna in soluzione salina tamponata al fosfato in un rapporto di 1 a 50. Quindi misurare la densità ottica a 600 nanometri.

Successivamente, diluire la coltura batterica notturna aggiungendo due OD della sospensione batterica in un nuovo tubo contenente 20 millilitri di TSB fresco, incubato a 37 gradi Celsius per circa tre o quattro ore in fase logaritmica in un incubatore agitato a 200 giri al minuto fino al raggiungimento di un totale di 10-50 OD. Una volta che Pseudomonas aeruginosa ha raggiunto la fase logaritmica, raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 2.700 × g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il soprannatante. Successivamente.

Risospendere il pellet batterico in un millilitro di PBS sterile ed eseguire un vortex accurato per risospendere completamente il pellet. Successivamente, mescolare un millilitro della sospensione batterica con nove millilitri di TSA liquido pre-equilibrato a 50 gradi Celsius. Aggiungere questa miscela all'olio minerale pesante preriscaldato a 50 gradi Celsius.

Mescolare immediatamente per sei minuti a temperatura ambiente. L'agitazione deve produrre un vortice visibile nell'olio. Successivamente raffreddare la miscela a quattro gradi Celsius, mescolando alla velocità minima per 35 minuti.

Quindi lasciare in ghiaccio per ulteriori 20 minuti. Successivamente, trasferire le perle di agar in provette falcon da 50 millilitri e centrifugare a 2.700 ×g per 15 minuti a 4 °C.

Rimuovere con precisione l'olio minerale e lavare il pellet di perle di agar con PBS sterile. Ripetere la procedura sei volte dopo tre lavaggi. Le perle possono essere sedimentate per gravità anziché utilizzare la centrifuga dopo l'ultimo lavaggio.

Risospesi le perle di agar in 20-30 millilitri di PBS in modo asettico, omogeneizzando 0,5 millilitri delle perle. Successivamente, diluire 100 microlitri delle perle omogeneizzate in 900 microlitri di PBS sterile e procedere con diluizioni seriali. Diluire le perle per sei volte fino a 10 alla meno sei, in un rapporto di uno a dieci.

Quindi piastrare le diluizioni seriali su piastre TSA, inclusa la diluizione indiluita. Campionare fino a 10 alla meno sesta e incubare le piastre a 37 gradi Celsius. Misurare il diametro delle perle utilizzando un microscopio ottico invertito in diversi campi.

Il diametro delle perle deve essere compreso tra 100 e 200 micron prima della sfida nei topi. Contare il numero di unità formanti colonie sulle piastre TSA al fine di determinare il numero di UFC per millilitro nella sospensione di perle di agar. Successivamente, regolare il volume delle perle di agar a due-quattro volte 10 alla settima UFC per millilitro per raggiungere un inocolo ottimale di uno-due volte 10 alla sesta in 50 microlitri.

Posizionare un topo maschio di sei-otto settimane, precedentemente anestetizzato con ketamina e xilazina, in posizione supina su un tappetino riscaldante, quindi disinfettare il mantello con etanolo al 70%. Esporre la trachea praticando un'incisione verticale della cute. Successivamente, utilizzare una pinzetta per separare i muscoli che ricoprono la trachea.

Quindi aspirare fino a 50 microlitri di sospensione di perle di agar mediante una siringa da un millilitro. Successivamente, intubare la trachea con un catetere e collegare la siringa da un millilitro contenente la sospensione di perle di agar al catetere. Spingere delicatamente lo stantuffo della siringa per consentire l'impianto delle perle nel polmone.

Chiudere quindi l'incisione utilizzando clip di sutura. In questo passaggio, posizionare il topo eutanasizzato in posizione supina e disinfettare il mantello con etanolo al 70%.

Successivamente, esporre la trachea e la gabbia toracica mediante un taglio verticale della cute. Dopodiché, esporre i polmoni recidendo il diaframma. Inserire un filo di sutura sotto la trachea utilizzando pinzette ed intubare la trachea con un catetere.

Quindi tirare i due capi del filo di sutura per fissare il catetere alla trachea, e non il filo intorno alla trachea. Prendere ora un millilitro di mezzo di coltura cellulare utilizzando una siringa da un millilitro e attaccarla al catetere. Premere lo stantuffo della siringa per lavare i polmoni, recuperare immediatamente il liquido e conservarlo in un tubo da 15 millilitri.

Ripetere questo passaggio tre volte con un totale di tre millilitri di mezzo, quindi conservare il liquido di lavaggio broncoalveolare in ghiaccio per la raccolta e l'analisi dei polmoni. Escindere i polmoni dal topo. Sciacquarli in PBS sterile.

Quindi separare i lobi. Collocarli in un tubo con fondo rotondo contenente due millilitri di PBS sterile e conservare sul ghiaccio. Omogeneizzare i polmoni in modo asettico e in serie.

Diluire l'omogenato in PBS in un rapporto di uno a 10. Successivamente, piastrare diluizioni seriali, inclusivo del campione non diluito, su piastre TSA e incubare a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Prelevare il liquido BAL dal ghiaccio e diluirlo con soluzione di Turk in un rapporto di uno a due sotto un microscopio ottico capovolto.

Contare il numero totale di cellule in una camera di conta cellulare di Burker per la centrifugazione del fluido BAL per il conteggio cellulare differenziale a 330 volte la forza di gravità per otto minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro in mezzo di coltura cellulare contenente il 10% di siero fetale bovino. Posizionare i vetrini e i filtri negli appositi alloggiamenti del citospin con i filtri di cartone rivolti verso il centro dello strumento.

Pipettare 150 microlitri di ogni campione nei pozzetti appropriati della citosina e della centrifusione citocentrifuga a 300 volte la forza di gravità per cinque minuti. Successivamente, dopo la colorazione, dovrebbe essere osservata una macchia di cellule, sulla quale può essere eseguito il conteggio differenziale al microscopio. Questa figura mostra l'andamento temporale dell'infezione cronica da Pseudomonas aeruginosa con il ceppo di riferimento PAO1 e RP73.

Stirpe clinica per ogni punto temporale. Gli istogrammi rappresentano la percentuale di mortalità indotta da batteriemia in rosso e la sopravvivenza in grigio, oppure la percentuale di animali che hanno eliminato l'infezione in bianco e quelli in grado di stabilire un'infezione cronica in verde. Lo stirpe clinica Pseudomonas aeruginosa RP73 è più efficiente nel stabilire un'infezione cronica rispetto allo stirpe di laboratorio PAO1.

I topi sopravvissuti sono stati sottoposti a eutanasia nei tempi indicati e i polmoni sono stati prelevati, omogeneizzati e coltivati su piastre di TSA per determinare il carico batterico. Le curve di crescita dei ceppi P oh one e RP 73 nei polmoni di topo mostrano che la quantità di batteri a tre giorni dall'infezione è maggiore per P oh one rispetto a RP 73. Successivamente, a partire da sette giorni in poi, quando si stabilisce l'infezione cronica, il carico batterico si assesta tra 10 alla quarta e 10 alla quinta UFC per polmone per entrambi i ceppi. Dopo sette giorni di infezione cronica con il ceppo clinico RP 73, è stata valutata il reclutamento delle cellule infiammatorie nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL).

Il numero di leucociti totali è notevolmente più elevato nei topi infettati da RP 73 rispetto ai topi non infettati. Le cellule più rappresentate sono i neutrofili, a indicare una risposta considerevole del sistema immunitario innato all'infezione cronica. Nella casella qui sotto, delle frecce indicano i neutrofili e un macrofago come visibili in una goccia su un vetrino dopo la centrifugazione citologica.

Qui sono mostrate colorazioni con ematossilina ed eosina su sezioni istologiche di polmoni di topo dopo sette giorni di infezione cronica con perle del ceppo clinico rp. 73; le perle indicate dalle frecce possono essere osservate nel lume bronchiale e microcolonie di cellule batteriche. Nelle aree infette, i bronchi e il parenchima polmonare sono caratterizzati da un massiccio reclutamento di cellule infiammatorie.

Mentre le vie aeree di un topo non infetto erano prive di cellule infiammatorie, il diametro e la concentrazione finale dei BES sono dettagli molto importanti. Per ottenere un buon risultato, è fondamentale ricordare che la dimensione dei bead è influenzata dalla velocità di rotazione durante la fase di raffreddamento e che la quantità iniziale di batteri può influire sul diluizione finale dei bead. Inoltre, la selezione di un ceppo di pseudomonas appropriato, che provochi una bassa mortalità nei topi e un'alta percentuale di infezione cronica, ridurrà al minimo il numero di topi utilizzati.

Dopo l'infezione dei topi, viene effettuato il conteggio batterico. Inoltre, possono essere eseguiti analisi della risposta infiammatoria in termini di conteggio totale e differenziale delle cellule nel liquido bronchiale, analisi delle citochine, saggio della mieloperossidasi e analisi istologica, al fine di studiare la risposta all'ulcera in seguito a infezione batterica. Non dimenticare che lavorare con patogeni opportunisti come Pseudomonas richiede sempre l'adozione di precauzioni specifiche, quali indossare guanti, manipolare i batteri all'interno di una cappa a sicurezza biologica e utilizzare tecniche sterili.

Lo sviluppo di modelli animali appropriati ha permesso la sperimentazione preclinica di nuove molecole antibatteriche e antinfiammatorie. Questo rappresenta un passaggio fondamentale per future interazioni terapeutiche nell'infezione polmonare di pazienti affetti da fibrosi cistica o altre malattie respiratorie.