Name: Long Term cronica Pseudomonas aeruginosa Infezione delle vie aeree nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Impara il metodo delle perle di agar per stabilire infezioni croniche da Pseudomonas aeruginosa nelle vie aeree dei topi. Questo approccio consente una carica batterica stabile fino a un mese.

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La ricerca nel laboratorio di Bragonzi è stato finanziato dalla Fondazione Italiana Fibrosi Cistica (CFaCore) e UE-F7-2009-223.670. Parte di questo lavoro è stato svolto in ALEMBIC, un laboratorio di microscopia avanzata, e il mouse istopatologia è stato eseguito presso l&#39;Unità di Anatomia Patologica (Istituto Scientifico San Raffaele).

1. Batteri Preparazione per l&#39;infezione cronica (tre e due giorni prima del mouse Challenge) <ol><li> Selezionare l&#39;appropriato P. ceppo aeruginosa da testare. </li><li> Seminare un&#39;ansata di P. aeruginosa da -80 ° C delle colture per un piatto Trypticase Soy Agar (TSA) e incubare a 37 ° C durante la notte. </li><li> Scegli una singola colonia e inoculare in 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) in una provetta snap-capped 15 ml ed incubare a 37 ° C per una notte in un incubatore agitazione a 200 rpm. </li></ol> 2. Incorporare batteri in Beads Agar per l&#39;infezione cronica (un giorno prima infezione) <ol><li> Prendere una piccola aliquota della coltura batterica durante la notte, diluire 1:50 in tampone fosfato (PBS) e misurare la densità ottica (OD) a 600 nm. </li><li> Diluire la coltura batterica overnight aggiungendo 2 OD in una nuova provetta con tappo a scatto contenente 20 ml di TSB fresca. </li><li> Incubare a 37 ° C per circa 3 -4 ore di fase di login in un incubatore agitazione a 200 rpm, fino a raggiungere un totale di 10-15 OD. </li><li> Nel frattempo, preparare la TSA, fatta di TSB con 1,5% agar, autoclave ed equilibrare a 50 ° C in un bagno d&#39;acqua. Equilibrare 150 ml di olio minerale pesante preautoclaved in un matraccio di Erlenmeyer a 50 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Una volta P. aeruginosa raggiunge la fase log, raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 2700 xg per 15 min a 4 ° C e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet batterico in 1 ml di PBS sterile e vortice accuratamente per risospendere completamente il pellet. </li><li> Miscelare 1 ml di sospensione batterica con 9 ml di TSA liquido pre-equilibrata a 50 ° C. </li><li> Aggiungere 10 ml TSA-P. aeruginosa miscela di olio minerale pesante (preriscaldata a 50 ° C) e subito mescolare per 6 minuti a temperatura ambiente. L&#39;agitazione deve produrre un vortice visibile nell&#39;olio. </li><li> Raffreddare la miscela a 4 ° C, agitando alla sp minimoeed per 35 min (Figura 1). </li><li> Appoggiare la miscela agar-perle di olio in ghiaccio per altri 20 min. </li><li> Trasferire l&#39;agar-perle in 50 ml provette Falcon e centrifugare a 2.700 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Accuratamente rimuovere l&#39;olio minerale e lavare con PBS sterile sei volte, come descritto nel passaggio 2.11. Dopo tre lavaggi, le sfere possono essere pellet per gravità invece di utilizzare la centrifuga. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere l&#39;agar-perle in 20-30 ml di PBS. </li><li> Prelevare un &#39;aliquota delle perle (circa 0,5 ml) e asettico omogeneizzare. </li><li> Prendete 100 ml di perline omogeneizzati e diluire in 900 ml di PBS sterile. Serie diluire 01:10 fino al 10 -6. </li><li> Diluizione seriale piastra su piastre di TSA, compreso campione non diluito fino a 10 -6 e incubare le piastre a 37 ° C. </li><li> Misurare il diametro tallone utilizzando un microscopio ottico invertito in vari campi. Il diametro cordone deve essere compreso tra 100-200 micron ( <strong&gt; Figura 1). </li><li> Conservare le perle di una notte a 4 ° C. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Panoramica della preparazione e del mouse perline infezione agar. P. aeruginosa cellule sono risospese in 1 ml di PBS e aggiunti 9 ml di liquido TSA (50 ° C). Questa miscela viene aggiunta a 150 ml di olio minerale pesante a 50 ° C in un pallone e agitata ad alta velocità per 6 minuti a temperatura ambiente. Quando il pallone viene raffreddato a 4 ° C con agitazione lenta per 35 min, l&#39;agar solidifica creando perline, e batteri presenti nella miscela sono incorporati nei branelli agar. Particolare di un cordone agar contenente cellule batteriche è (A) indicato. Dopo aver rimosso l&#39;olio minerale con diversi lavaggi con PBS sterile, la sospensione di agar-perline è pronto fo inoculazione nei polmoni dei topi da un&#39;iniezione endotracheale (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . 3. Topi sfida con Agar-perle Etica Dichiarazione: Questo protocollo e sperimentazione seguono le linee guida della cura degli animali e il comitato etico di Istituto Scientifico San Raffaele. <ol><li> Contare il numero di Unità Formanti Colonie (CFU) sulle piastre di TSA per determinare il numero di CFU / ml nella sospensione agar-perline. Diluire l&#39;agar-perline con PBS sterile per 2-4 x 10 7 UFC / ml per raggiungere un inoculo ottimale di 1-2 x 10 6 in 50 microlitri. </li><li> Anestetizzare C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 settimane) topi maschi con ketamina (50 mg / ml) e xilazina (5 mg / ml) in 0,9% NaCl somministrata ad un volume di 0,002 ml / g di peso corporeo da iniezione intraperitoneale. NOTA: L&#39;anestesia è considerato adeqlutare quando l&#39;animale rimane ancora in silenzio, non risponde agli stimoli esterni, ed è costante il cuore e la frequenza respiratoria. </li><li> Posizionare il mouse in posizione supina. Disinfettare il cappotto del mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Esporre la trachea da un taglio verticale della pelle e intubare la trachea con una sterile, flessibile 22 G 0,9 millimetri x 25 mm catetere IV, mantenendo attenzione per rimuovere il stylette mentre si muove verso il basso nella trachea. Inserire il catetere non troppo in profondità nella trachea. Arrestare prima di raggiungere la carena (biforcazione). </li><li> Immediatamente prendere un volume di 50 ml di sospensione di sferette agar da una siringa da 1 ml e collegarlo al catetere. Premere delicatamente il pistone della siringa, permettendo alle sfere di essere impiantati nel polmone. Chiudere l&#39;incisione utilizzando clip di sutura. </li><li> Posizionare l&#39;animale su una piastra elettrica fino a completamente sveglio. </li></ol> 4. Valutazione Mice <ol><li> Osservare i topi al giorno per segni clinici tra cui la qualità del cappotto, la postura,deambulazione, e lo stato di idratazione. Controllo del peso corporeo al giorno. I topi che perdono ≥ 20% del peso corporeo devono essere eutanasia. </li><li> Seguire il punto 5 per la raccolta del liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL) e dei punti 6 e 7 per la raccolta dei polmoni e l&#39;analisi di totale CFU, l&#39;analisi istologica, la risposta infiammatoria in termini di numero totale e differenziale delle cellule nel BAL, analisi di citochine, e mieloperossidasi (MPO) attività. </li></ol> 5. BAL Fluid Raccolta e analisi <ol><li> Euthanize i topi da CO 2 inalazione. </li><li> Posizionare il mouse nella posizione supina. Disinfettare il cappotto del mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Esporre la trachea e la gabbia toracica da un taglio verticale della pelle. Esporre i polmoni tagliando il diaframma. </li><li> Inserire un filo di sutura sotto la trachea utilizzando una pinzetta e intubare la trachea con una sterile, flessibile 22 g 0,9 millimetri x 25 mm catetere IV. Tirare le due estremità del filo di sutura di impegnare la catheter alla trachea e annodare il filo attorno alla trachea. </li><li> Prendere un volume di 1 ml di RPMI 1640 utilizzando una siringa da 1 ml e fissarlo al catetere. Spingere lo stantuffo della siringa per lavare i polmoni e immediatamente recuperare il liquido, riporlo in una provetta da 15 ml. NOTA: Se le citochine sono da analizzare, aggiungere inibitori della proteasi per RPMI 1640. </li><li> Ripetere questa operazione tre volte per un totale di 3 ml di RPMI. Da ora in poi, conservare il liquido BAL su ghiaccio. Andare al punto 6 per la raccolta e l&#39;analisi dei polmoni. NOTA: Si prega di notare che non tutto il liquido sarà recuperato (2,8 ml al massimo). </li><li> Per la quantificazione dei batteri presenti nel BAL, campionare una piccola aliquota (300 microlitri), serialmente diluire 1:10 in PBS sterile, piastra su piastre di TSA e incubare a 37 ° C per una notte. </li><li> Contare le cellule totali utilizzando un microscopio ottico invertito luce diluendo un&#39;aliquota del BAL 1:2 con Tuerk in una camera di conta cellulare Burker. </li><li> Centrifugare la remaining BAL a 330 xg per 8 minuti a 4 ° C. Prendere il surnatante per l&#39;analisi di citochine ELISA, riporlo a -80 ° C. Seguire i passaggi 5,10-5,13 per la conta cellulare differenziale cytospin. </li><li> Se il pellet è rosso, lisare gli eritrociti risospendere il pellet in 250-300 ml di tampone di lisi diluito 1:10 in acqua distillata ultrapura per 3 min. Neutralizzare con 2 ml di PBS e centrifugare a 330 xg per 8 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in RPMI 10% di siero fetale bovino (FBS). Utilizzare un volume che fornirà 1 x 10 6 cellule / ml, in base al numero di celle totale. </li><li> Posizionare vetrini da microscopio e dei filtri in apposite cave nel cytospin con i filtri di cartone di fronte al centro del cytospin. Pipettare 150 ml di ciascun campione nei pozzetti appropriati del cytospin e centrifugare in una citocentrifuga a 300 xg per 5 min. </li><li> Colorare i vetrini da Romanowsky colorazione utilizzando un kit commerciale, secondo la maistruzioni di nufacturer e come descritto in precedenza 12. Seguire i passaggi 5,14-5,17 per l&#39;analisi delle attività MPO. </li><li> Centrifugare la rimanente quantità di BAL a 380 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 250 ml di cloruro di esadeciltrimetilammonio 0,5% in acqua distillata ultrapura per lisare le cellule. La sospensione può essere congelato a -20 ° C per diversi giorni prima dell&#39;esecuzione del test. </li><li> Centrifugare a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C e utilizzare il surnatante effettuare test MPO in piastre a 96 pozzetti, aggiungere il campione in duplicato a ciascun pozzetto e, se necessario, anche vere diluizioni del campione. </li><li> Aggiungere a ciascun campione nei pozzetti un volume uguale di 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB) come substrato per la perossidasi. Lasciare che la reazione abbia luogo al buio per almeno 5 minuti e fino a quando non vi è un ulteriore sviluppo nel colore. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 2 MH 2 SO 4 unand misurare la densità ottica a 450 nm. Il valore di assorbanza sarà direttamente proporzionale all&#39;attività perossidasi. </li></ol> 6. Misurazione della carica batterica nei polmoni e citochine analisi <ol><li> Subito dopo la raccolta BAL, polmoni accise del topo, li lavare in PBS sterile, lobi distinti, metterli in un tubo a fondo rotondo con 2 ml di PBS sterile e memorizzare sul ghiaccio. NOTA: Se citochine sono da analizzare, aggiungi inibitori della proteasi di PBS ai tubi. </li><li> Asetticamente omogeneizzare i polmoni, prendere una piccola aliquota (300 microlitri) dall&#39;omogenato, serie diluire 1:10 in PBS, la piastra su piastre di TSA e incubare a 37 ° C durante la notte. Si prega di notare che il carico totale delle vie aeree batterica sarà la somma dei CFU trovati in BAL e del polmone. </li><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato rimanendo a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C. Prendete il surnatante per l&#39;analisi di citochine ELISA, e conservare a -80 ° C. </li></ol> 7. Esame istologico &lt;ol&gt; <li> Effettuare analisi istologica solo sui polmoni in cui BAL non sono stati raccolti, per preservare aspetto e le proprietà del polmone. </li><li> Euthanize il mouse CO 2 inalazione. </li><li> Esporre la gabbia toracica da un taglio verticale della pelle, esporre i polmoni tagliando il diaframma. </li><li> Accise polmoni, li lavare in PBS, separano i lobi, metterli in una provetta contenente formalina 5-10 ml 10% neutra tamponata (4% formaldeide) e conservare a 4 ° C al riparo dalla luce. </li><li> Polmoni Incorpora in paraffina, utilizzando le procedure standard. </li><li> Tagliare 5 sezioni micron di spessore utilizzando un microtomo. </li><li> Diapositive macchia con ematossilina e eosina e coprire le diapositive con un coprioggetto, secondo le procedure standard. </li><li> Esaminare vetrini utilizzando un microscopio invertito campo chiaro e acquisire le immagini collegando al microscopio una telecamera. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Le fasi critiche del P. aeruginosa-perline preparazione e la sfida del mouse sono riportati di seguito. Il ceppo P. aeruginosa utilizzato per i topi sfida è critica. Mortalità, infezione cronica o di liquidazione potrebbero differire significativamente a seconda del ceppo batterico utilizzato per la sfida. Il P. aeruginosa RP73 ceppo clinico è stato preferito rispetto al ceppo di laboratorio di riferimento PAO1 quanto ha determinato una mortalità relativam...

La fibrosi cistica (CF) è una malattia genetica causata da mutazioni nel transmembrana della fibrosi cistica regolatore della conduttanza (CFTR). Questo gene codifica per un canale del cloro espressi sulla membrana della maggior parte delle cellule epiteliali. Bronchiectasia, muco tamponamento e parenchimale distruzione causata principalmente da infezioni da Pseudomonas aeruginosa progressivamente portare a grave malattia polmonare e la mortalità nella maggior parte dei pazienti CF 1. Capire patogenesi CF e l&#39;ulteriore sviluppo di nuove terapie si basano su modello animale con le caratteristiche di CF. Diversi topi, geneticamente modificati per il gene CFTR, sono stati generati, ma limitazioni nella capacità di queste specie di ricapitolare malattia polmonare CF-simili e diverse altre anomalie di organi visto in pazienti CF sono stati ampiamente documentati 2. Sviluppo di infezione è una delle principali sfide CF modello animale. I cl letteraturasuggerisce presto che una infezione cronica che dura più di un mese può essere raggiunto solo se i topi vengono inoculati con i batteri incorporati in un agente di immobilizzazione come agar, agarosio, o alghe alginato 3-5. Questi agenti immobilizzanti forniscono le condizioni microaerobica / anaerobiche che permettono ai batteri di crescere in forma di microcolonie, analogamente alla crescita nel muco dei pazienti FC 6. Questo modello di infezione cronica porta alla persistenza dei batteri nei polmoni causando infiammazione delle vie respiratorie e danni 7. Tuttavia, a seconda del metodo utilizzato, il ceppo batterico e la dose inoculato nei polmoni, la percentuale di topi infettati croniche e la carica batterica recuperato nei polmoni a differenti tempi possono differire considerevolmente. In particolare, la sfida principale per l&#39;infezione cronica a lungo termine rimane la bassa carica batterica da P. aeruginosa e la bassa percentuale di infetti settimane topi dopo sfida, indicando that cellule batteriche vengono progressivamente cancellati dall&#39;host. Selezionando il P. aeruginosa RP73 ceppo clinico da una raccolta di CF isolati 8 abbiamo ottenuto con successo una bassa mortalità, le lesioni più gravi, e l&#39;alta percentuale di infezione cronica con una carica batterica stabile fino a un mese nei topi C57Bl/6NCrl. Dettagli Questo documento metodologia per l&#39;incorporamento P. aeruginosa nelle perle di agar, abbiamo infettato topi mediante instillazione, misurata la carica batterica e citochine nei polmoni, raccolta BAL ed eseguito un esame istologico. Nel complesso, questo protocollo sarà di aiuto ai ricercatori per affrontare questioni di fondamentale importanza sulla patogenesi 8,9 e testare nuove terapie contro il P. aeruginosa infezione cronica 10,11.

<table><tbody><tr><td>Bacto Tryptic Brodo di soia</td><td>Becton Dickinson</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulato</td><td>Becton Dickinson</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale pesante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>S-(+)-ketamina cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml 25 G 5/8 pollici </td><td></td> Catetere <td>PIC 3071250300350</td><td></td>0,5 mm x 16 mm</tr><tr><td>22 G 0,9 mm x 25 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinza - Punte da 0,5 mm Curvo</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici, iride, 11 cm, diritta</td><td>World Precision Instruments</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Clip per sutura</td><td>Strumenti per la scienza 12040-01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura filettatura</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Read 102 Burker camera monouso</td><td>Biosigma</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>Tuerk soluzione</td><td>Fluka</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>tampone di lisi RBC</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>EZ cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710021</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio Superfrost ultra plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik Romanowsky set di colorazione</td><td>Medion Diagnostics</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di esadeciltrimetilammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>Piastra EIA/RIA a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'- Tetrametilbenzidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponata neutra</td><td>Bio-Optica</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin non Papanicolau</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>Eosina più soluzione alcolica</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Incubatore a scuotimento</td><td>Amerex Instruments</td><td>Steady Shake 757</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Grant</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td><td>Ystral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilancia di precisione</td><td>KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>Citocentrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Pad riscaldante a basso costo</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>Sonda di omogeneizzazione</td><td>Ystral</td><td>2366925(piccolo)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico invertito</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>Camera (microscopio)</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>Rotary microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

long term cronica<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; infezione delle vie aeree nei topi

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Un modello murino di infezione cronica delle vie aeree è un asset fondamentale nella fibrosi cistica (CF) di ricerca, anche se ci sono una serie di preoccupazioni per quanto riguarda il modello stesso. Prime fasi di infiammazione e infezione sono stati ampiamente studiati utilizzando il modello di agar-perle del mouse Pseudomonas aeruginosa, mentre solo pochi studi si sono concentrati sulla infezione cronica a lungo termine in vivo. La sfida principale per l&#39;infezione cronica a lungo termine rimane la bassa carica batterica da P. aeruginosa e la bassa percentuale di infetti settimane topi dopo sfida, indicando che le cellule batteriche vengono progressivamente cancellati dall&#39;host. Questo articolo presenta un metodo per ottenere efficiente infezione cronica a lungo termine in topi. Questo metodo si basa sul radicamento del P. aeruginosa ceppi clinici nei agar-perle in vitro, seguita da instillazione nei topi C57Bl/6NCrl. Infezione polmonare bilaterale è associato SEVrali misurabili read-out, tra cui la perdita di peso, la mortalità, infezione cronica, e la risposta infiammatoria. Il P. aeruginosa RP73 ceppo clinico è stato preferito rispetto al ceppo di laboratorio di riferimento PAO1 quanto ha determinato una mortalità relativamente bassa, le lesioni più gravi, e l&#39;infezione cronica più elevata. P. colonizzazione aeruginosa può persistere nel polmone per oltre tre mesi. Murini patologia polmonare assomiglia a quella di pazienti CF con malattia avanzata cronica polmonare. Questo modello murino imita più da vicino il corso della malattia umana e può essere utilizzato sia per studi sulla patogenesi e per la valutazione di nuove terapie.

Quando il protocollo è fatto correttamente, il P. aeruginosa agar-perle misureranno tra 100-200 micron e può essere osservato con un microscopio ottico invertito pipettando un piccolo volume della sospensione di agar-perline su un vetrino. Singole cellule batteriche sono visibili nelle perline agar, come mostrato in dettaglio in figura 1. La scelta di P. ceppo aeruginosa usati nella preparazione agar-perline è critica. Figura 2 e <...

Descriviamo il metodo di agar-perle di stabilire persistente a lungo termine infezione delle vie respiratorie Pseudomonas aeruginosa cronica nel modello di topo.

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire un'infezione cronica persistente a lungo termine delle vie aeree da pseudomonas aerogen nei topi. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando il ceppo batterico di pseudomonas aerogen selezionato. Il secondo passaggio consiste nell'includere i batteri in piccole perle di agar mescolando i batteri con agar e olio minerale a 50 gradi Celsius, quindi raffreddando la miscela a quattro gradi Celsius sotto agitazione lenta e continua.Successivamente, l'olio minerale viene rimosso mediante diversi lavaggi con PBS e un'aliquote dei granuli di agar viene omogeneizzata e seminata su piastre di agar. Per determinare il contenuto batterico, l'ultimo passaggio consiste nell'iniettare alcune microlitri della sospensione di granuli di agar nella trachea di topi per indurre un'infezione polmonare cronica da Pseudomonas aeruginosa. Infine, il liquido di lavaggio broncoalveolare e i polmoni possono essere recuperati in diversi momenti successivi alla sfida e seminati su piastre di agar per rilevare la percentuale di topi cronicamente infetti e il carico batterico nelle vie aeree dei topi sopravvissuti. Il principale vantaggio di questi metodi con granuli di agar rispetto ai metodi esistenti è che consentono un'infezione cronica stabile a lungo termine in una elevata percentuale di topi, portando al mantenimento di un carico batterico stabile fino a un mese.I metodi AGA bit creano nel polmone del mouse una condizione microaerobica che permette ai batteri di crescere sotto forma di microcolonie. In modo analogo alla crescita nel muco dei pazienti affetti da fibrosi cistica, questi metodi possono aiutare i ricercatori a rispondere a domande fondamentali sulla patogenesi della fibrosi cistica e di altre malattie respiratorie, nonché a testare nuove terapie contro le infezioni polmonari croniche da Pseudomonas aeruginosa. I metodi possono inoltre essere utilizzati per ottenere infezioni croniche con altri patogeni, inclusi Burkholderia dolosa o Staphylococcus aureus; sono possibili anche infezioni concomitanti con diversi patogeni o esperimenti di competizione. A dimostrazione della procedura saranno coinvolti Pheno, un postdoc, e Camil Riva, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Tre giorni prima della sfida nei topi, inoculare un’ansa piena di Pseudomonas aeruginosa dalla coltura congelata a -80 gradi Celsius su una piastra di agar triptone soia e incubare a 37 gradi Celsius per tutta la notte.Il giorno successivo, selezionare una singola colonia inoculata in cinque millilitri di brodo di soia tripticasa e incubata a 37 °C durante la notte in un incubatore agitato a 200 giri al minuto. La mattina seguente, diluire un piccolo aliquota della coltura batterica notturna in soluzione salina tamponata al fosfato in un rapporto di 1 a 50. Quindi misurare la densità ottica a 600 nanometri.Successivamente, diluire la coltura batterica notturna aggiungendo due OD della sospensione batterica in un nuovo tubo contenente 20 millilitri di TSB fresco, incubato a 37 gradi Celsius per circa tre o quattro ore in fase logaritmica in un incubatore agitato a 200 giri al minuto fino al raggiungimento di un totale di 10-50 OD. Una volta che Pseudomonas aeruginosa ha raggiunto la fase logaritmica, raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 2.700 × g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il soprannatante. Successivamente.Risospendere il pellet batterico in un millilitro di PBS sterile ed eseguire un vortex accurato per risospendere completamente il pellet. Successivamente, mescolare un millilitro della sospensione batterica con nove millilitri di TSA liquido pre-equilibrato a 50 gradi Celsius. Aggiungere questa miscela all'olio minerale pesante preriscaldato a 50 gradi Celsius.Mescolare immediatamente per sei minuti a temperatura ambiente. L'agitazione deve produrre un vortice visibile nell'olio. Successivamente raffreddare la miscela a quattro gradi Celsius, mescolando alla velocità minima per 35 minuti.Quindi lasciare in ghiaccio per ulteriori 20 minuti. Successivamente, trasferire le perle di agar in provette falcon da 50 millilitri e centrifugare a 2.700 ×g per 15 minuti a 4 °C.Rimuovere con precisione l'olio minerale e lavare il pellet di perle di agar con PBS sterile. Ripetere la procedura sei volte dopo tre lavaggi. Le perle possono essere sedimentate per gravità anziché utilizzare la centrifuga dopo l'ultimo lavaggio.Risospesi le perle di agar in 20-30 millilitri di PBS in modo asettico, omogeneizzando 0,5 millilitri delle perle. Successivamente, diluire 100 microlitri delle perle omogeneizzate in 900 microlitri di PBS sterile e procedere con diluizioni seriali. Diluire le perle per sei volte fino a 10 alla meno sei, in un rapporto di uno a dieci.Quindi piastrare le diluizioni seriali su piastre TSA, inclusa la diluizione indiluita. Campionare fino a 10 alla meno sesta e incubare le piastre a 37 gradi Celsius. Misurare il diametro delle perle utilizzando un microscopio ottico invertito in diversi campi.Il diametro delle perle deve essere compreso tra 100 e 200 micron prima della sfida nei topi. Contare il numero di unità formanti colonie sulle piastre TSA al fine di determinare il numero di UFC per millilitro nella sospensione di perle di agar. Successivamente, regolare il volume delle perle di agar a due-quattro volte 10 alla settima UFC per millilitro per raggiungere un inocolo ottimale di uno-due volte 10 alla sesta in 50 microlitri.Posizionare un topo maschio di sei-otto settimane, precedentemente anestetizzato con ketamina e xilazina, in posizione supina su un tappetino riscaldante, quindi disinfettare il mantello con etanolo al 70%. Esporre la trachea praticando un'incisione verticale della cute. Successivamente, utilizzare una pinzetta per separare i muscoli che ricoprono la trachea.Quindi aspirare fino a 50 microlitri di sospensione di perle di agar mediante una siringa da un millilitro. Successivamente, intubare la trachea con un catetere e collegare la siringa da un millilitro contenente la sospensione di perle di agar al catetere. Spingere delicatamente lo stantuffo della siringa per consentire l'impianto delle perle nel polmone.Chiudere quindi l'incisione utilizzando clip di sutura. In questo passaggio, posizionare il topo eutanasizzato in posizione supina e disinfettare il mantello con etanolo al 70%.Successivamente, esporre la trachea e la gabbia toracica mediante un taglio verticale della cute. Dopodiché, esporre i polmoni recidendo il diaframma. Inserire un filo di sutura sotto la trachea utilizzando pinzette ed intubare la trachea con un catetere.Quindi tirare i due capi del filo di sutura per fissare il catetere alla trachea, e non il filo intorno alla trachea. Prendere ora un millilitro di mezzo di coltura cellulare utilizzando una siringa da un millilitro e attaccarla al catetere. Premere lo stantuffo della siringa per lavare i polmoni, recuperare immediatamente il liquido e conservarlo in un tubo da 15 millilitri.Ripetere questo passaggio tre volte con un totale di tre millilitri di mezzo, quindi conservare il liquido di lavaggio broncoalveolare in ghiaccio per la raccolta e l'analisi dei polmoni. Escindere i polmoni dal topo. Sciacquarli in PBS sterile.Quindi separare i lobi. Collocarli in un tubo con fondo rotondo contenente due millilitri di PBS sterile e conservare sul ghiaccio. Omogeneizzare i polmoni in modo asettico e in serie.Diluire l'omogenato in PBS in un rapporto di uno a 10. Successivamente, piastrare diluizioni seriali, inclusivo del campione non diluito, su piastre TSA e incubare a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Prelevare il liquido BAL dal ghiaccio e diluirlo con soluzione di Turk in un rapporto di uno a due sotto un microscopio ottico capovolto.Contare il numero totale di cellule in una camera di conta cellulare di Burker per la centrifugazione del fluido BAL per il conteggio cellulare differenziale a 330 volte la forza di gravità per otto minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro in mezzo di coltura cellulare contenente il 10% di siero fetale bovino. Posizionare i vetrini e i filtri negli appositi alloggiamenti del citospin con i filtri di cartone rivolti verso il centro dello strumento.Pipettare 150 microlitri di ogni campione nei pozzetti appropriati della citosina e della centrifusione citocentrifuga a 300 volte la forza di gravità per cinque minuti. Successivamente, dopo la colorazione, dovrebbe essere osservata una macchia di cellule, sulla quale può essere eseguito il conteggio differenziale al microscopio. Questa figura mostra l'andamento temporale dell'infezione cronica da Pseudomonas aeruginosa con il ceppo di riferimento PAO1 e RP73.Stirpe clinica per ogni punto temporale. Gli istogrammi rappresentano la percentuale di mortalità indotta da batteriemia in rosso e la sopravvivenza in grigio, oppure la percentuale di animali che hanno eliminato l'infezione in bianco e quelli in grado di stabilire un'infezione cronica in verde. Lo stirpe clinica Pseudomonas aeruginosa RP73 è più efficiente nel stabilire un'infezione cronica rispetto allo stirpe di laboratorio PAO1.I topi sopravvissuti sono stati sottoposti a eutanasia nei tempi indicati e i polmoni sono stati prelevati, omogeneizzati e coltivati su piastre di TSA per determinare il carico batterico. Le curve di crescita dei ceppi P oh one e RP 73 nei polmoni di topo mostrano che la quantità di batteri a tre giorni dall'infezione è maggiore per P oh one rispetto a RP 73. Successivamente, a partire da sette giorni in poi, quando si stabilisce l'infezione cronica, il carico batterico si assesta tra 10 alla quarta e 10 alla quinta UFC per polmone per entrambi i ceppi. Dopo sette giorni di infezione cronica con il ceppo clinico RP 73, è stata valutata il reclutamento delle cellule infiammatorie nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL).Il numero di leucociti totali è notevolmente più elevato nei topi infettati da RP 73 rispetto ai topi non infettati. Le cellule più rappresentate sono i neutrofili, a indicare una risposta considerevole del sistema immunitario innato all'infezione cronica. Nella casella qui sotto, delle frecce indicano i neutrofili e un macrofago come visibili in una goccia su un vetrino dopo la centrifugazione citologica.Qui sono mostrate colorazioni con ematossilina ed eosina su sezioni istologiche di polmoni di topo dopo sette giorni di infezione cronica con perle del ceppo clinico rp. 73; le perle indicate dalle frecce possono essere osservate nel lume bronchiale e microcolonie di cellule batteriche. Nelle aree infette, i bronchi e il parenchima polmonare sono caratterizzati da un massiccio reclutamento di cellule infiammatorie.Mentre le vie aeree di un topo non infetto erano prive di cellule infiammatorie, il diametro e la concentrazione finale dei BES sono dettagli molto importanti. Per ottenere un buon risultato, è fondamentale ricordare che la dimensione dei bead è influenzata dalla velocità di rotazione durante la fase di raffreddamento e che la quantità iniziale di batteri può influire sul diluizione finale dei bead. Inoltre, la selezione di un ceppo di pseudomonas appropriato, che provochi una bassa mortalità nei topi e un'alta percentuale di infezione cronica, ridurrà al minimo il numero di topi utilizzati.Dopo l'infezione dei topi, viene effettuato il conteggio batterico. Inoltre, possono essere eseguiti analisi della risposta infiammatoria in termini di conteggio totale e differenziale delle cellule nel liquido bronchiale, analisi delle citochine, saggio della mieloperossidasi e analisi istologica, al fine di studiare la risposta all'ulcera in seguito a infezione batterica. Non dimenticare che lavorare con patogeni opportunisti come Pseudomonas richiede sempre l'adozione di precauzioni specifiche, quali indossare guanti, manipolare i batteri all'interno di una cappa a sicurezza biologica e utilizzare tecniche sterili.Lo sviluppo di modelli animali appropriati ha permesso la sperimentazione preclinica di nuove molecole antibatteriche e antinfiammatorie. Questo rappresenta un passaggio fondamentale per future interazioni terapeutiche nell'infezione polmonare di pazienti affetti da fibrosi cistica o altre malattie respiratorie.

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: de Vries, C. R., et.al. Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica della ferita da Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Esp. (2020)Questo video mostra l'inoculazione ritardata di Pseudomonas aeruginosa luminosa in un topo con due ferite dorsali a spessore totale coperte da una medicazione trasparente. Questo facilita la formazione di biofilm e l'instaurazione di infezioni croniche. Il monitoraggio regolare della bioluminescenza consente la quantificazione del carico...

Sviluppo di un modello topino di infezione cutanea cronica da Pseudomonas aeruginosa 

Abbiamo sviluppato un modello di lesione polmonare nel topo mediante iniezione intra-tracheale del batterio Pseudomonas aeruginosa. Questo modello imita il danno polmonare durante la polmonite ed è clinicamente rilevante.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

L'obiettivo di questo protocollo è fornire metodi automatizzati per quantificare le patologie polmonari croniche in un modello murino di BPCO. Il protocollo include l'esposizione dei topi al fumo di sigaretta (CS), la misurazione della funzione polmonare, il gonfiaggio dei polmoni e l'utilizzo di metodi morfometrici per misurare l'enfisema e il rimodellamento delle piccole vie aeree nei topi.

Misurazione automatica di enfisema polmonare e piccole vie aeree ritocca in sigaretta Mice-fumo esposti

Mentre lo studio in vitro delle interazioni ospite-patogeno consente la caratterizzazione di specifiche risposte immunitarie, sono necessari modelli in vivo per osservare gli effetti di risposte complesse. Utilizzando l'esposizione a Candida albicans seguita da un'infezione polmonare mediata da Pseudomonas aeruginosa, abbiamo stabilito un modello murino di interazioni microbiche coinvolte nella patogenicità della polmonite associata al ventilatore.

Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways

Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per modellare la polmonite batterica nei topi. Qui, descriviamo un non invasivo, economico, rapido metodo per indurre la polmonite tramite aspirazione (vale a dire, l'inalazione) di un inoculo batterico pipettati in orofaringe. metodi di valle per la valutazione della risposta immunitaria innata polmonare sono anche dettagliata.

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Questo studio descrive la generazione di successo di un nuovo modello animale di malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD) esponendo ripetutamente topi ad alte concentrazioni di ozono.

Generazione di un modello di malattia polmonare ostruttiva cronica nei topi da esposizione ripetuta dell'ozono

Qui segnaliamo i metodi comuni per analizzare la funzione fagocitica dei macrofagi alveolari murini e lo spazio batterico dal polmone. Questi metodi di studio in vitro fagocitosi dei branelli di isotiocianato di fluorescina e fagocitosi in vivo di Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Inoltre descriviamo un metodo per l'eliminazione di p. aeruginosa nei topi.

Fagocitosi del macrofago alveolare e la Clearance di batteri nei topi

Descriviamo un protocollo di inoculazione ritardata per generare infezioni croniche delle ferite nei topi immunocompetenti.

Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica di Pseudomonas aeruginosa Wound

Questo manoscritto descrive la creazione di un modello infettivo di polmonite nei topi e la rispettiva caratterizzazione della risoluzione delle lesioni insieme ai metodi per la crescita dei batteri e l'instillazione intratracheale. Viene inoltre descritto un nuovo approccio che utilizza la citometria a flusso ad alta dimensione per valutare il panorama immunitario.

Modello sperimentale per valutare la risoluzione della polmonite

I topi sono generalmente resistenti alle infezioni da Mycobacterium abscessus, il che complica la scoperta e lo sviluppo di antibiotici tanto necessari contro le infezioni polmonari. Qui, descriviamo un metodo di preparazione dell'inoculo e dell'infezione intratracheale che ha dimostrato di fornire un'infezione prolungata nei topi immunocompetenti.

Preparazione di Mycobacterium abscessus incluso nella perla di agar per inoculare topi immunocompetenti per via intratracheale

Impara il metodo delle perle di agar per stabilire infezioni croniche da Pseudomonas aeruginosa nelle vie aeree dei topi. Questo approccio consente una carica batterica stabile fino a un mese.

Long Term cronica

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