Name: Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Impara a isolare e coltivare cellule endoteliali dal telencefalo embrionale per studiare l'angiogenesi cerebrale e le interazioni neurovascolari. Questo metodo utilizza separazione magnetica con microsfere CD31.

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Questo lavoro è stato supportato da una Alleanza Nazionale per la Ricerca sulla Depressione e schizofrenia (NARSAD) Young Investigator Award e National Institutes of Health concedere R01NS073635 AV.

1. Preparazione dei reagenti e soluzioni <ol><li> Rivestimento di 35 mm piatto di coltura: collagene di tipo 1 soluzione viene fornito in soluzione acquosa in 20 mM di acido acetico (~ 100 mg di proteina / fiala). Diluire un volume adeguato di soluzione di collagene per una concentrazione di lavoro del 0,01% con acqua di coltura tissutale sterile grado. Piatti cappotto con 1 ml di soluzione di collagene per 3-4 ore a temperatura ambiente (RT) o 37 ° C, o durante la notte a 2-8 ° C. Rimuovere la soluzione in eccesso dal piatto rivestito e lasciarlo asciugare durante la notte. Sciacquare il piatto con acqua di coltura tissutale grado o PBS prima di aggiungere media. Piatti rivestiti possono essere conservati a 4 ° C per un mese. </li><li> Preparare completa di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM). Integrare il DMEM (500 ml) con 10% FBS e soluzione antibiotica-antimicotica (concentrazione 1x; 1 ml/100 ml). DMEM completo può essere conservato a 4 ° C per due mesi. </li><li> Preparare una aliquota (50 ml) di DMEM con DNasi I (0,001 mg / ml), (denominato DMEM-DNasi I). </li><li> Preparare un&#39;altra aliquota (10 ml) di DMEM con collagenasi e dispasi (1 mg / ml) (denominato DMEM-collagenase/dispase). </li><li> Preparare cellule endoteliali Cultura Media (ECCM, 500 ml), integrato con EGF (5 mg), ECG (100 mg) e 5 ml di soluzione antibiotica-antimicotica. ECCM può essere conservato a 4 ° C per due mesi. </li><li> Preriscaldare tutti i media prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare buffer di purificazione: PBS, pH 7,2 con 0,5% BSA e 2 mM EDTA. Tenere tampone a freddo (2-8 ° C). </li></ol> 2. Rimozione di embrioni e la dissezione di Telencefalo Tutti gli esperimenti su animali da laboratorio sono approvati dalla cura degli animali e l&#39;uso comitati del McLean Hospital e conformi alle linee guida NIH per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. <ol><li> Utilizzare cronometrate topi CD1 gravidanza (giorno embrionale 15). Il giorno della scoperta spina vaginale è considerato embrionale giorno 0 (E0). Dighe CD1 generalmente producono grandi cucciolate, così 10-12 embriones sono attesi da una diga incinta. </li><li> Per isterotomia, anestetizzare i topi in gravidanza con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg) / xylazina (5 mg / kg). Per i topi di circa 20-30 g, erogare 0,3 ml di una soluzione anestetica 10 ml / kg di ketamina / xilazina e garantire che il dolore e il disagio è minimo durante le iniezioni intraperitoneali di anestetico. Utilizzare ritenuta mano per le iniezioni. </li><li> Controllare anestesia profonda da pizzico punta. Rimuovere gli embrioni di topi profondamente anestetizzati. Decapitare ogni embrione immediatamente dopo l&#39;estrazione dalla madre. Mettere le teste embrionali in piastre sterili a freddo ghiaccio PBS. </li><li> Segui isterectomia per eutanasia immediato con overdose di anestetico (130 mg / kg pentobarbital, ip), un metodo di eutanasia, che è coerente con le linee guida AVMA per l&#39;eutanasia degli animali: 2013 Edition. </li><li> Sotto un microscopio stereo, rimuovere il cervello dalla testa con le forbici MicroTip sottili e una pinza sottile. Nota: Un sezionare alta qualitàione è essenziale per rimuovere con successo la membrana piale dal cervello embrionale. Ciò si ottiene con la pratica. Pinza sottile e forbici MicroTip sono strumenti fondamentali per ottenere un buon dissezione. </li><li> Utilizzare le pinze per avere una presa salda sul cervello e le forbici MicroTip a staccarsi membrana piale. Rimuovere il mesencefalo e metencephalon e isolare il telencefalo. Trasferimento telencefalo-piale libero da tutti gli embrioni per un piatto di cultura 35 millimetri con 2 ml di PBS nel ghiaccio. </li></ol> 3. Isolamento delle cellule <ol><li> Macinare telencefalo in 1-2 mm frammenti con una lama di bisturi e raccogliere il tessuto in un tubo Falcon da 15 ml contenente 2 ml di DMEM completo. </li><li> Dissociare il tessuto delicatamente ma accuratamente con una pipetta 1 ml fino grumi scompaiono e una sospensione lattiginosa è raggiunto. </li><li> Centrifugare dissociato cellule a 800-1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere pellet in DMEM-DNasi I. delicatamente dissociare il cells nuovamente utilizzando 1 ml pipetta e centrifugare a 800-1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet in caldo DMEM completo. Celle filtranti attraverso una sterile maglia di Nylon 70 micron. Raccogliere le cellule filtrati e tenere in ghiaccio. </li><li> Raccogliere le cellule porzioni trattenuti sulla maglia e digerire ulteriormente con DMEM-collagenase/dispase (2 ml) per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3x cellule in DMEM-DNasi tramite centrifugazione a 800-1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Pool queste cellule con le cellule filtrati raccolti nel passo 3.5. Lavare le cellule in totale una volta con DMEM completo. Procedere per determinare il numero di cellulare e passaggi di etichettatura magnetici. Nota: è importante avere una cella singola sospensione prima marcatura magnetica. </li></ol> 4. Etichettatura magnetica <ol><li> Questo protocollo mostra la marcatura magnetica di 10 7 cellule. Per il numero di cellule inferiore a 10 7, utilizzare lo stesso volume di reagente e per il numero di cellule superiore a 10 7, scalare tutti i volumi dei reagenti e dei volumi totalidi conseguenza (ad esempio 2 x 10 7 cellule totali, utilizzare il doppio del volume di tutti i reagenti indicati). Conservare tutti i reagenti e le cellule in ghiaccio. </li><li> Determinare il numero di cellule con un emocitometro. </li><li> Sospensione cellulare centrifugare a 300 xg per 10 minuti a RT. Aspirare il surnatante completamente. </li><li> Aggiungere 90 μl/10 7 cellule di tampone di purificazione al pellet seguita da 10 ml di microsfere CD31. Le microsfere forniti dal costruttore sono coniugati ad anticorpo monoclonale anti-CD31 mouse. </li><li> Mescolare bene e incubare per 15 minuti in frigorifero. Nota: temperature più elevate e / o tempo di incubazione più lungo durante l&#39;etichettatura magnetica può provocare legame non specifico. </li><li> Lavare le cellule aggiungendo 1-2 ml/10 7 cellule di tampone di purificazione e centrifugare a 300 xg per 10 min. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 500 ml di buffer di purificazione. Procedere alla separazione magnetica o fase di purificazione. </li></ol> 5. Purification <ol><li> Mettere colonna MS nel campo magnetico della MACS separatore. </li><li> Risciacquare colonna con 500 microlitri di tampone di purificazione. </li><li> Applicare sospensione cellulare sulla colonna. Caricare numero adeguato di cellule per colonna MS come numero di cellule superiore può intasare la colonna. Attenzione: Ogni colonna MS può ospitare un numero massimo di 2 x 10 7 cellule, per un numero di cellule superiore, utilizzare più colonne. </li><li> Raccogliere e smaltire flow-through contenente cellule senza etichetta. </li><li> Lavare colonna con 500 ml di buffer di depurazione tre volte. Durante le fasi di lavaggio, assicurarsi che il serbatoio colonna è vuota prima di aggiungere ulteriori aliquote del buffer di purificazione. </li><li> Togliere colonna dal separatore MACS e posizionarlo su un tubo Falcon 15 ml. </li><li> Un pistone viene fornito insieme con la colonna MS. Pipettare 1 ml di tampone di purificazione nella colonna MS e subito scovare le cellule marcate magneticamente saldamente spingendo lo stantuffo nella colonna. </li><li> Piatto cells su un piatto di coltura 35 millimetri rivestiti con collagene di tipo 1 e crescere le cellule in ECCM in un incubatore a 37 ° C con 95% O 2 e 5% CO 2. </li><li> Cambia il mezzo ogni quattro giorni. Utilizzare PVECs per esperimenti o sottocultura dopo 10-12 giorni, quando il piatto è confluente. </li></ol> 6. Subculture del fotovoltaico ECS <ol><li> Rimuovere il ECCM e risciacquare il monostrato di PVECS con 1-2 ml di PBS sterile. </li><li> Aggiungere delicatamente 1,5 ml di soluzione 0,25% tripsina-EDTA a coprire il monostrato cellulare. </li><li> Riportare il piatto per l&#39;incubatore. Entro 5-7 minuti, le cellule saranno staccarsi dalla superficie del piatto. </li><li> Dopo che le cellule hanno staccato, immediatamente aggiungere un uguale volume di inibitore della tripsina e triturare più volte. </li><li> Trasferire le cellule ad una sterile 15 ml tubo Falcon. Centrifugare la provetta a 500 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di preriscaldata ECCM. </li><li> Seed le cellule per espandere la cultura, iminvecchiamento o altri saggi. </li></ol>

<ol><li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li>
<li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li>
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<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Funzione PVEC di sono fisiologicamente più rilevanti rispetto adulte cellule endoteliali cerebrali e EC da altre fonti di tessuto per gli studi incentrati sulle interazioni neurovascolari e anche avere un potenziale terapeutico. Per la preparazione funzione PVEC, è principio fondamentale con dissezione di lavorare velocemente per ottenere una buona redditività poiché le cellule morte possono legarsi in modo aspecifico a microsfere CD31. Inoltre, se cella singola sospensione non viene raggiunto prima della fase di marcat...

Angiogenesi, neurogenesi e migrazione neuronale sono eventi critici nel sistema nervoso centrale (SNC) lo sviluppo, la riparazione e la rigenerazione. Diversi studi eleganti hanno dimostrato che le cellule endoteliali stimolano la proliferazione neuronale e viceversa attraverso il rilascio di fattori solubili e per contatto diretto. Abbiamo trovato curioso che nella maggior parte di questi studi 1-3, mentre progenitori neuronali / cellule staminali neurali sono isolate dal cervello embrionale, sono co-coltivate con cellule endoteliali da cervello adulto, altre fonti tessuti adulti, o con linee di cellule endoteliali. Ciò può essere dovuto in parte alle difficoltà tecnici associati isolando e coltivando popolazioni pure di cellule endoteliali dal cervello embrionale. Tuttavia, l&#39;angiogenesi, la neurogenesi e migrazione neuronale sono eventi concomitanti che si verificano in ordini di grandezza più robusta nel cervello embrionale rispetto al normale cervello adulto. La rete vascolare periventricolare del embryonic proencefalo (telencefalo) proviene da una nave situata all&#39;interno dei gangli basali primordium e si sviluppa in forma di un gradiente ordinata da ventrale a quella dorsale telencefalo dal giorno embrionale 11 (E11) 4,5. Questo plesso delle navi della rete vascolare periventricolare sono distinti da navi piale basato su origini, posizione anatomica, modelli di crescita, e la regolamentazione dello sviluppo 4,5. La direzione di propagazione della sfumatura angiogenesi periventricolare corrisponde alla telencefalico trasversale gradiente neurogenetico. All&#39;interno del telencefalo, il gradiente angiogenesi periventricolare e la pendenza dei neuroni GABA migrazione sovrapposizioni tangenzialmente spazialmente pure 6. Per quanto riguarda i tempi, il gradiente angiogenesi è in anticipo rispetto al neurogenetico gradiente e GABA neurone gradiente di circa un giorno. Così, le cellule endoteliali periventricolare sono spazialmente e temporalmente ben posizionati per fornire spunti critici per sostenere la neurogenesi telencefalica eneuronale 4,6 migrazione. Pertanto, l&#39;uso delle embrionali cellule endoteliali periventricolare in esperimenti di co-coltura con cellule progenitrici e / o neuroni neuronali potrebbe fornire un modello più favorevole per lo studio delle interazioni neurovascolari e lo sviluppo di nuovi viali per il trattamento di malattie neurodegenerative o lesioni cerebrali traumatiche / ischemico. Sottolineiamo l&#39;importanza di eliminare la membrana piale, non solo per limitare la contaminazione delle cellule epiteliali, ma anche per separare le cellule endoteliali piale che sono molecolarmente e funzionalmente distinta dalle cellule endoteliali della periventricolare rete vascolare 4,6 (PVECs denominati per distinguerli da piale EC) . Qui, descriviamo il metodo che usiamo abitualmente nel nostro laboratorio per ottenere una resa ricca e pura di PVECs. Queste cellule endoteliali sono preparati da forebrains embrionali isolate da un singolo mouse al momento giusto incinta. Essi possono essere ampliati, subcoltivate e congelati giù con successo per un uso futuro.

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D-4527</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Collagene, soluzione di tipo 1 dalla coda di ratto&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Qualità Biologici</td><td>114057-131</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4055</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Colonna MS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microsfere CD31</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-418</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Separatore MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MACS multi stand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro cellulare 70 &; micro; m</td><td>BD Bioscienze</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione antibiotica e antimicotica</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenasi/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Piatto di coltura da 35 mm</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo Falcon da 15 ml&nbsp;</td><td>BD Bioscienze</td><td>352097</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo Falcon 50 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>352098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit ECCM</td> Il kit <td>355054</td><td>BD Bioscience</td><td>include un integratore per la crescita delle cellule endoteliali, un EGF e un integratore</td></tr> per la <tr><td>crescita delle cellule endoteliali (ECGS)</td><td>BD Bioscience</td><td>354006</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Applicazioni per celle</td> <td>RBECGM</td><td>R819-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM F12&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>10565-018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologie GlutaMAX</td><td>Life</td><td>305050-061</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acqua per colture tissutali</td><td>Life Technologies</td><td>15230162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,25% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina di soia</td><td>BD Bioscience</td><td>5425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscienze</td><td>354234</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di etichettatura cellulare Qtracker 655</td><td>Life Technologies</td><td>Q25021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Membrana al plasma CellLight-RFP, BacMam 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>C10608</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo biotinilato isolectina B4 Sigma</td><td></td><td>L2140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fattore anti-Von Willebrand</td><td>Sigma</td><td>F3520</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Supporti di montaggio rigidi VECTASHIELD con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Butler Schein Animal Health Supply</td><td>44028</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>1009</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus CK-40</td><td>CK-40</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus FSX-100</td><td>FSX-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>7 inox</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Forbici a micropunta fine</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS5611</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali forebrain

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Cellule endoteliali cerebrali embrionali possono servire come strumento importante nello studio dell&#39;angiogenesi e sviluppo neurovascolari e interazioni. Le due reti vascolari del prosencefalo embrionale, piale e periventricolare, sono spazialmente distintivo e avere origini e modelli di crescita. Le cellule endoteliali delle reti vascolari piale e periventricolare hanno profili di espressione genica e funzioni uniche. Qui vi presentiamo un protocollo step-by-step per l&#39;isolamento, la cultura, e la verifica delle popolazioni pure di cellule endoteliali dalla rete vascolare periventricolare (PVECs) del prosencefalo embrionale (telencefalo). In questo approccio, telencefalo privo di membrana piale ottenuto da giorno embrionale 15 topi è macinata, digerito con collagenasi / dispasi, e disperso meccanicamente in una sospensione di cellule singole. PVECs sono purificati dalla sospensione cellulare mediante la selezione positiva con l&#39;anticorpo anti-CD-31/PECAM-1 coniugato con microsfere con un forte magneticometodo di separazione. Cellule purificate sono coltivate su collagene 1 rivestite piatti di coltura di cellule endoteliali terreno di coltura fino a quando diventano confluenti e l&#39;ulteriore subcoltivate. PVECs ottenuto con questo protocollo mostra ciottoli e fenotipi fusiformi, come visualizzato dal contrasto di fase microscopia ottica e microscopia a fluorescenza. Purezza delle culture funzione PVEC è stato stabilito con i marcatori delle cellule endoteliali. Nelle nostre mani, questo metodo affidabile e coerente produce popolazioni pure di PVECs. Questo protocollo andrà a beneficio studi volti a ottenere intuizioni meccanicistica nel prosencefalo angiogenesi, comprendere le interazioni funzione PVEC e trasversali colloqui con tipi di cellule neuronali e detiene un enorme potenziale per l&#39;angiogenesi terapeutica.

La caratterizzazione fenotipica di PVECs dal giorno 1-12 è mostrata da contrasto di fase microscopia ottica (Figura 2). Le cellule attaccate al piatto al giorno 1 mostra morfologia caratteristica di divisione cellulare (Figura 2A). Tra 5-8 giorni, PVECs transizione dalla pietra, affastellate al mandrino morfologia forma tipica per le cellule endoteliali e più simile al suo stato in vivo (Figure 2B e 2C). Di giorno 12 la cultura funzione PVEC ra...

Questo video mostra una strategia semplice e affidabile per la preparazione di colture pure di cellule endoteliali del prosencefalo embrionale entro 10-12 giorni e sarà utile per la ricerca focalizzata su molti aspetti della angiogenesi cerebrale.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare colture pure di cellule endoteliali provenienti da quattro cervelli embrionali per studiare l'angiogenesi cerebrale e le interazioni neurovascolari. Questo risultato si ottiene innanzitutto rimuovendo la membrana piale e isolando il cefalone dai cervelli embrionali. Il secondo passaggio della procedura consiste nel produrre una sospensione di singole cellule mediante dissociazione, filtrazione e digestione del tessuto raccolto.Il terzo passaggio consiste nell'etichettare magneticamente le cellule utilizzando microperle CD31. I passaggi finali sono la purificazione delle cellule marcate con CD31 mediante separazione magnetica e successivamente la loro coltivazione. Alla fine, vengono ottenute popolazioni pure di cellule endoteliali paraventricolari per ulteriori studi mediante microscopia a immunofluorescenza e saggi di angiogenesi.Questo metodo sarà utile per studi incentrati sui meccanismi cellulari e molecolari. Per gli anis cerebrali, può fungere da strumento per chiarire le interazioni tra cellule endoteliali ventricolari e il dialogo incrociato con i tipi cellulari neuronali. Ha inoltre un potenziale notevole per la missione

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Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di cellule murine endoteliali polmonari. Questo metodo comprende meccanico e dissociazione enzimatica tessuto polmonare e una 2-step processo di purificazione con anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpi coniugati a sfere magnetiche, che produce una popolazione pura di cellule endoteliali di origine per lo più microvascolare.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Questo metodo descrive come isolare e immortalare cellule endoteliali microvascolari di cervello di topo. Descriviamo un passo-passo protocollo partire dalla omogeneizzazione del tessuto cerebrale, mineralizzazione, semina e immortalizzazione delle cellule. Di solito, ci vogliono circa cinque settimane per ottenere una omogenea, immortalato linea microvascolare delle cellule endoteliali.

Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Cervello Modello barriera

Questo video presenta l'isolamento di microvasi dal cervello di un ratto utilizzando una combinazione di centrifugazione a gradiente di densità e metodi di digestione enzimatica. I microvasi isolati possono essere coltivati in un pallone di coltura pre-rivestito con matrice di collagene e fibronectina per ottenere colonie di cellule endoteliali.

Coltura di cellule endoteliali da microvasi cerebrali di ratto: una procedura per isolare e coltivare cellule endoteliali da microvasi di cervello di ratto

Questo video dimostra un protocollo per indurre la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte in cellule endoteliali cerebrali.

Generazione di cellule endoteliali cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte

Coltura cellulare primaria è una tecnica utile per analizzare specifiche popolazioni di cellule, particolarmente da embrioni di topo transgenico a stadi specifici dello sviluppo. Qui, ventricoli embrionali vengono sezionati e dissociato, e perle di anticorpi coniugati riconoscere e separare le cellule endoteliali per ulteriori analisi.

Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) sono interconnesse da specifiche proteine giunzionali che formano una barriera altamente regolata che separa il sangue e il sistema nervoso centrale (SNC), la cosiddetta barriera emato-encefalica (BBB). L'isolamento delle cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello murino, come discusso in questo protocollo, consente studi dettagliati in vitro della BEE.

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

Le cellule endoteliali vascolari svolgono un ruolo significativo in molti importanti disturbi cardiovascolari. Questo articolo descrive un metodo semplice per isolare ed espandere le cellule endoteliali dall'aorta del topo senza l'uso di attrezzature speciali. Il nostro protocollo fornisce un mezzo efficace per identificare i meccanismi nella fisiopatologia delle cellule endoteliali.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

Segnaliamo un metodo affidabile per isolare e coltivare cellule endoteliali primarie specifiche per il tumore da modelli murini geneticamente modificati.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) derivano da (hemogenic) cellule endoteliali specializzate durante lo sviluppo, ma poco si sa circa il processo attraverso il quale alcune cellule endoteliali specificano a diventare la formazione del sangue. Dimostriamo un metodo basato citometria a flusso che permette l'isolamento simultaneo di cellule endoteliali hemogenic e HSPC da tessuti embrionali murine.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare le cellule progenitrici endoteliali da sangue del cordone ombelicale. Alcune delle applicazioni includono l'utilizzo di queste cellule come biomarcatore per identificare i pazienti con rischio cardiovascolare, trattamento delle malattie ischemiche, e costrutti di creazione valvola vascolare e cuore tessutale.

Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano

Viene presentato un protocollo per l'isolamento e la coltura primaria delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) dal tessuto cerebrale murino neonatale per generare un modello in vitro robusto per studiare la funzione della barriera emato-encefalica in condizioni fisiologiche e patologiche.

Isolamento e coltura delle cellule endoteliali microvascolari del cervello del topo

Impara a isolare e coltivare cellule endoteliali dal telencefalo embrionale per studiare l'angiogenesi cerebrale e le interazioni neurovascolari. Questo metodo utilizza separazione magnetica con microsfere CD31.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

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