Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare colture pure di cellule endoteliali provenienti da quattro cervelli embrionali per studiare l'angiogenesi cerebrale e le interazioni neurovascolari. Questo risultato si ottiene innanzitutto rimuovendo la membrana piale e isolando il cefalone dai cervelli embrionali. Il secondo passaggio della procedura consiste nel produrre una sospensione di singole cellule mediante dissociazione, filtrazione e digestione del tessuto raccolto.

Il terzo passaggio consiste nell'etichettare magneticamente le cellule utilizzando microperle CD31. I passaggi finali sono la purificazione delle cellule marcate con CD31 mediante separazione magnetica e successivamente la loro coltivazione. Alla fine, vengono ottenute popolazioni pure di cellule endoteliali paraventricolari per ulteriori studi mediante microscopia a immunofluorescenza e saggi di angiogenesi.

Questo metodo sarà utile per studi incentrati sui meccanismi cellulari e molecolari. Per gli anis cerebrali, può fungere da strumento per chiarire le interazioni tra cellule endoteliali ventricolari e il dialogo incrociato con i tipi cellulari neuronali. Ha inoltre un potenziale notevole per la missione terapeutica degli anis.

La dimostrazione di questo metodo è fondamentale per eliminare alcune delle difficoltà tecniche associate all'isolamento e alla coltura di popolazioni pure di cellule endoteliali dal cervello embrionale. Per questo protocollo, si prelevino le teste di cuccioli E15 da femmine CD1 in PBS freddo su ghiaccio sotto un stereomicroscopio. Rimuovere i cervelli utilizzando forbici a punta fine e pinzette fini.

Una buona dissezione è fondamentale e si acquisisce con la pratica e con strumenti in ottime condizioni. Successivamente, utilizzare la pinzetta per afferrare saldamente il cervello e le forbici microfine per rimuovere la membrana perineurale. Questo passaggio è il più delicato dell'intera procedura, ma le competenze necessarie si sviluppano con l'esercizio.

Quindi rimuovere il mesencefalo e il metacefalo. Isolare il cefalo. Successivamente, trasferirlo privo della membrana peel in una piastra di coltura da 35 millimetri contenente due millilitri di PBS su ghiaccio.

Raccogliere tutti gli artigli in un singolo piatto. Iniziare trinciando gli artigli in frammenti di uno o due millimetri con una lama di bisturi. Raccogliere il tessuto in un tubo da 15 millilitri contenente due millilitri di DMEM completo.

Dissociare delicatamente ma completamente il tessuto mediante pipettaggio con una pipetta da un millilitro fino alla scomparsa dei grumi e all'ottenimento di una sospensione lattescente. Centrifugare la sospensione a 800-1000 G per cinque minuti. A temperatura ambiente, rimuovere con attenzione il soprannatante mediante aspirazione e risospendere.

Sospendere il palato in DMEM con DS uno. Dissociare nuovamente le cellule utilizzando una pipettaggio delicato e ripetere il passaggio di centrifugazione. Quindi risospendere il pellet in DMEM completo preriscaldato.

Filtrare le cellule sospese attraverso una maglia di nylon da 70 micron e raccogliere le porzioni cellulari trattenute sulla maglia, quindi digerirle ulteriormente in due millilitri di DMEM con collaghenasi e dis bays. Attendere alcuni minuti, quindi lavare il tessuto. Da tre a utilizzando la centrifugazione e la risospensione del pellet in DMEM con DS un pool, raccogliere il lavato insieme al filtrato mantenuto in ghiaccio.

Quindi lavare la combinazione con DMEM completo utilizzando la centrifugazione e la risospensione. Determinare ora il numero di cellule mediante emocitometro e procedere con l'etichettatura magnetica. I volumi indicati in questo protocollo sono adatti fino a 10 milioni di cellule; per numeri cellulari superiori, aumentare proporzionalmente.

Centrifugare innanzitutto la sospensione cellulare a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare completamente il soprannatante e aggiungere 90 microlitri di tampone di purificazione freddo al pellet cellulare, seguiti da 10 microlitri di microperle coniugate con CD31. Mescolare bene le cellule utilizzando una pipetta da 200 microlitri e incubare la sospensione per 15 minuti in frigorifero, senza superare questo tempo, in modo che l'etichettatura rimanga specifica. Lavare le cellule aggiungendo da uno a due millilitri di tampone di purificazione freddo e centrifugando a 300 G per 10 minuti.

Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone di purificazione freddo. Inserire ora una colonna MS nel campo magnetico del separatore max. Successivamente, lavare la colonna con 500 microlitri di tampone di purificazione a temperatura ambiente.

Quindi applicare la sospensione cellulare sulla colonna. È adatta fino a 20 milioni di cellule. Raccogliere e scartare tutto il flusso in uscita, che contiene le cellule non marcate.

Lavare la colonna con 500 microlitri di tampone di purificazione per tre volte. Assicurarsi sempre che il serbatoio della colonna sia vuoto prima di aggiungere aliquote successive di tampone di purificazione. Rimuovere ora la colonna dal separatore max e posizionarla su una provetta da 15 millilitri.

Aggiungere un millilitro di tampone di purificazione sulla colonna e rimuovere immediatamente le cellule marcate magneticamente spingendo con fermezza lo stantuffo fornito all'interno della piastra della colonna. Le cellule espulse vanno raccolte in una piastra di coltura da 35 millimetri pre-ricoperta con collagene di tipo uno.

Ora coltivare le cellule con ECCM in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius con 95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica. Cambiare il mezzo ogni quattro giorni. Osservare ogni giorno le cellule in crescita nella piastra di coltura mediante microscopio.

La caratterizzazione fenotipica delle cellule endoteliali periventricolari o dei cambiamenti delle PVE CS dal primo al dodicesimo giorno, osservata mediante microscopia a contrasto di fase, mostra che le cellule aderiscono alla piastra il primo giorno e presentano una morfologia caratteristica della divisione cellulare tra il quinto e l'ottavo giorno. Le PVE CS passano da una morfologia a selciato a una forma a fuso, tipica delle cellule endoteliali e più simile al loro stato in vivo.

Al giorno 12, la coltura di PVEC raggiunge la piena confluenza. I p vs possono essere sottocoltivati facilmente per espandere la colonia dopo il passaggio.

La purezza delle colture di cellule endoteliali è stata determinata essere del 100% utilizzando i seguenti marcatori delle cellule endoteliali. ISO selectina prima del fattore di von Willebrand, CD31, PE cam-1 e VE-caderina. Immagini ad alta magnificazione di PVC preparate da embrioni CD1, così come da embrioni tie2-GFP i cui endoteli esprimevano GFP, sono state marcate con ISO lectina prima; esse mostravano le comuni morfologie a selciato e a forma di fuso, nonché morfologie poligonali con prolungamenti sottili in alcune piastre di coltura rivestite con collagene. In assenza di Matrigel, le PVC formavano schemi a reticolo che ricordavano la caratteristica unica della rete vascolare periventricolare in vivo.

Ciò riflette l'elevato potenziale angiogenico dei PVE Cs. È stato eseguito un saggio di angiogenesi in cui 20.000 PVE Cs sono stati aggiunti a piatti di coltura rivestiti con matrice gel. Questi PV Cs hanno mostrato una marcata formazione di tubuli entro 18 ore.

È possibile condurre studi a lungo termine sui CS pve, inclusa la migrazione, la motilità, la morfologia, saggi della funzione cellulare e anche esperimenti in vivo, etichettando i PV isolati da embrioni CD uno con nano cristalli Q dot. Questi nano cristalli forniscono una fluorescenza intensa e stabile nel citoplasma delle cellule vive.

Pve EECS possono essere trasfettati con traccianti cellulari come Cell Light Plasma Membrane. RFP back MAM 2.0 per una chiara visualizzazione della morfologia cellulare in esperimenti di imaging su cellule vive. Pve CS sono stati coltivati in diversi terreni di coltura e la morfologia cellulare è stata confrontata mediante microscopia a contrasto di fase e ISO selettina prima della colorazione.

Mentre le CS PV coltivate in ECCM mostravano una morfologia a forma di fuso e raggiungevano la confluenza entro il giorno 12, le CS pve coltivate in mezzo di crescita per cellule endoteliali cerebrali di ratto mostravano una morfologia molto allungata e raggiungevano la confluenza entro il giorno 20. D'altro canto, le CS PV coltivate nel mezzo D-M-E-M-F 12 mostravano esclusivamente una morfologia piatta e poligonale, senza formazione di fusi, una crescita molto rapida ed erano confluenti entro il quarto giorno.

I PVEC sono stati coltivati in ECCM per un massimo di tre passaggi senza perdita di fenotipo e funzione. Pertanto, l'ECCM è il mezzo preferito per la coltura dei PVEC. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se effettuata correttamente.

La coltura condivisa di cellule endoteliali periventricolari con precursori neuronali probabilmente stimola la neurogenesi e la migrazione neuronale molto meglio rispetto alle cellule endoteliali del cervello adulto o di altre origini. Possono quindi essere utili per favorire il recupero della funzione neurologica in molteplici scenari.