Generazione di Shear Adesione mappa usando SynVivo reti microvascolari sintetico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere una mappa della adesione al taglio tra cellule e particelle da un singolo esperimento, utilizzando reti microvascolari sintetiche. Questo risultato si ottiene innanzitutto rivestendo il dispositivo microfluidico con la proteina di interesse, in questo caso l'avadon. Come secondo passaggio, vengono iniettate nel dispositivo particelle biotinilate a velocità di taglio fisiologiche, le quali si legano al dispositivo rivestito con avadon mostrando schemi differenziali in base alle velocità di taglio locali.

Successivamente, viene contato il numero di particelle legate al fine di generare una mappa dell'adesione al taglio delle particelle, utilizzando un database computazionale di valori di velocità di taglio nella rete. I risultati mostrano che una mappa dell'adesione al taglio può essere ottenuta da un singolo esperimento, comportando un risparmio significativo di tempo e reagenti rispetto alle camere di flusso a piastre parallele convenzionali. Il vantaggio principale di questa tecnologia rispetto ai metodi esistenti, come i canali di flusso lineari, è la possibilità di generare mappe condivise da un singolo esperimento, ottenendo così un notevole risparmio in termini di costi e tempo.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della somministrazione di farmaci, ad esempio riguardo alla capacità dei veicoli di somministrazione di legarsi ai bersagli desiderati. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo utilizzando camere a flusso con piastre oscillanti per comprendere lesioni cellulari particolari. Tuttavia, in condizioni di fluido, l'obiettivo di questo saggio è fornire informazioni di base sull'adesione di particelle e cellule.

La piattaforma syn vivo può essere applicata a diverse altre aree, come il cancro e il rilascio a livello del sistema nervoso centrale, infezione e infiammazione, trombosi e disfunzione della microcircolazione. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi che coinvolgono il dispositivo microfluidico sono difficili da apprendere, l'abituarsi a volumi campione ridotti e le migliori pratiche per evitare la formazione di bolle vengono trasmesse in modo più efficace attraverso una rappresentazione visiva. La procedura sarà dimostrata da Ashley Smith, scienziata ricercatrice del nostro laboratorio.

Il dispositivo microfluidico SynVivo SMN è composto da due serie di porte parallele, una per il flusso di rivestimenti superficiali, gruppi funzionali e/o cellule per l'ancoraggio, e l'altra per l'esecuzione del saggio. Per iniziare, immergere completamente il dispositivo in una piastra di Petri contenente acqua deionizzata sterile e posizionare la piastra in vuoto. Disidratare, lasciando procedere la disidratazione fino a quando tutta l'aria è stata rimossa dai canali del dispositivo.

Attendere circa 15 minuti prima di rimuovere il dispositivo dall'acqua. Utilizzare pinzette a punta fine per inserire un tubo tigon prerisciacquato con acqua in ciascuna porta del dispositivo. La lunghezza del tubo dovrebbe essere di circa 2,5 cm.

Ora il dispositivo può essere rimosso dall'acqua utilizzando una pipetta o una siringa. Mettere una goccia d'acqua attorno alla base di un tubo del porto di ingresso. Rimuovere con attenzione il tubo.

La goccia d'acqua impedirà all'aria di entrare nel dispositivo. Successivamente, preparare una siringa da un millilitro caricata con avadon a una concentrazione di 20 microgrammi per millilitro. Collegare la siringa a un ago in acciaio inossidabile da 24 gauge e bloccare con una pinza a ganascia il porto di ingresso non utilizzato.

Inserire il tubo nel porto di ingresso del dispositivo. Iniettare avadon a una portata di un microlitro al minuto per 10 minuti per consentire una perfusione completa del dispositivo. Al termine del tempo di flusso.

Stringare tutti i tubi con morsetti a ganascia e posizionare il dispositivo a quattro gradi durante la notte. Lasciare che il dispositivo raggiunga la temperatura ambiente. Successivamente, posizionare il dispositivo su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un palcoscenico motorizzato e di una telecamera ad alte prestazioni.

Preparare una soluzione di particelle biotinilate di due micron a una concentrazione di 5 milioni di particelle per millilitro in soluzione salina tampone al fosfato o PBS. Caricare le particelle in una siringa da un millilitro. Preparare una seconda siringa da un millilitro contenente PBS.

Caricare solo ogni siringa su una pompa per siringhe, quindi collegarle all'ago e al tubo utilizzando una siringa pipetta. Posizionare una goccia d'acqua attorno alla base del tubo del porto di ingresso e rimuovere con attenzione il tubo utilizzato per rivestire il dispositivo. Inserire con cura i tubi per le particelle biotinilate e per il PBS in ciascun porto di ingresso.

Quindi iniziare a iniettare le particelle biotinilate a una portata di 2,5 microlitri al minuto. Monitorare il porto di ingresso al microscopio al primo segnale delle particelle. Avviare il cronometro e proseguire il flusso per tre minuti.

Al termine dei tre minuti, arrestare il flusso delle particelle biotinilate interrompendo contemporaneamente il flusso di PBS a una velocità di 2,5 microlitri al minuto. Lasciare scorrere il PBS nel dispositivo per tre minuti al fine di rimuovere le particelle non legate. Per iniziare l'acquisizione, utilizzare la funzione di scansione dell'immagine grande nel software di imaging per acquisire l'immagine dell'intero dispositivo, quindi numerare in sequenza le biforcazioni nel dispositivo e creare un'area di interesse circolare con un diametro doppio rispetto a quello dei canali.

In questo caso, impostare il diametro dell'area di interesse a 200 micron poiché il diametro del canale è di 100 micron. Utilizzare la funzione di conteggio automatico nel software di imaging per esportare il numero di particelle in ciascuna area di interesse in un foglio di calcolo. Analogamente, utilizzare la funzione di conteggio automatico per esportare il numero di particelle nell'intero dispositivo.

Le simulazioni CFD vengono eseguite e i risultati sono archiviati in un database per ulteriori analisi. Le informazioni incluse nei risultati contengono i tassi di shear sulla parete, il flusso di particelle in velocità e l'adesione al dispositivo. Queste informazioni vengono utilizzate per determinare il numero di particelle che aderiscono in ciascuna area di interesse, data una concentrazione definita di particelle in ingresso.

Per generare una mappa dell'adesione al taglio, calcolare la percentuale di adesione come specificato nel protocollo testuale come passaggio finale. Tracciare la mappa dell'adesione al taglio utilizzando la velocità di taglio in ciascuna biforcazione delle reti e i valori percentuali di adesione. Questa immagine mostra un tipico dispositivo SMN rivestito con avidina in condizioni syn vivo dopo il legame di particelle biotinilate di due micron.

Si noti che le particelle aderiscono preferenzialmente nelle vicinanze delle biforcazioni della rete. Le biforcazioni numerate nella rete SMN syn vivo sono visibili qui. Questa immagine rappresenta la mappa del gradiente di sforzo tangenziale sulle pareti, generata dal modello CFD del dispositivo.

Il tasso di taglio varia nel dispositivo da 250 secondi inversi a 15 secondi inversi, come osservato nella microvascolatura in vivo. Si noti che questi diversi tassi di taglio non possono essere ottenuti simultaneamente in canali microfluidici lineari, poiché forniscono un tasso di taglio costante per ogni portata. Il grafico mostrato qui dei valori del tasso di taglio in ciascuna delle biforcazioni della rete rivela che i modelli di tasso di taglio sono complessi e non possono essere ottenuti mediante una semplice relazione analitica, a differenza dei canali di flusso lineari.

Inoltre, sono presenti molteplici biforcazioni nella rete che ricadono nello stesso intervallo di shear. Questo aumenta l'affidabilità statistica dei dati mostrati. Di seguito sono riportati risultati campione dell'analisi CFD relativi ai flussi di particelle nella rete, utilizzati per calcolare i flussi di particelle nei rami e nelle biforcazioni della rete sperimentale.

La mappa dell'adesione tangenziale ottenuta da un singolo esperimento SMN syn vivo segue la relazione inversa osservata nelle mappe di adesione tangenziale ricavate da esperimenti con canali lineari. Tuttavia, utilizzando un saggio SynVivo, un singolo esperimento consente di generare questa mappa tangenziale, mentre con i canali lineari sono necessarie numerose ripetizioni sperimentali. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una chiara comprensione di come utilizzare i dispositivi SynVivo SMN per generare la mappa di adesione condivisa a partire da un singolo esperimento.

Quando si esegue questo esperimento, è importante ricordare di non introdurre bolle nel dispositivo microfluidico SynVivo SMN dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'infiammazione per studiare l'interazione tra leucociti e endotelio a diverse velocità di taglio in un singolo esperimento. Nella prossima generazione di dispositivi, i ricercatori potranno studiare l'adesione di rotolamento e la migrazione dei leucociti in un singolo saggio, qualcosa che attualmente non è possibile.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi per studiare l'adesione di farmaci, veicoli di somministrazione e cellule, al fine di indagare aspetti come l'effetto fisiologico del flusso sull'adesione cellula-cellula, cellula-farmaco e farmaco-veicolo.