Generazione di Shear Adesione mappa usando SynVivo reti microvascolari sintetico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere una mappa di adesione pura dell'adesione delle particelle cellulari da un singolo esperimento utilizzando reti microvascolari sintetiche. Ciò si ottiene rivestendo prima il dispositivo microfluidico con la proteina di interesse, in questo caso avadon. In una seconda fase, le particelle biotinilate vengono iniettate nel dispositivo a velocità di taglio fisiologiche, che si legano al dispositivo rivestito in avadon con modelli differenziali a seconda delle velocità di taglio locali.

Successivamente, viene contato il numero di particelle legate per generare una mappa di adesione delle particelle utilizzando un database creato computazionalmente dei valori di velocità pura nella rete. I risultati mostrano che è possibile ottenere una mappa di adesione pura da un singolo esperimento, con un notevole risparmio di tempo e reagenti rispetto alle camere di flusso a piastre parallele convenzionali. Il vantaggio principale di questa tecnologia rispetto ai metodi esistenti, come i canali di flusso lineare, è che possiamo generare mappe condivise da un singolo esperimento, con un conseguente notevole risparmio di costi e tempo.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della somministrazione di farmaci, come la capacità dei veicoli di somministrazione di farmaci di legarsi con i bersagli desiderati. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo utilizzando camere di flusso a piastra a paletta per comprendere la lesione particolare della cellula. In condizioni fluide, tuttavia, l'obiettivo di questo test è fornire informazioni di base sull'adesione delle particelle e delle cellule.

La piattaforma syn vivo può essere applicata a una varietà di altri sistemi, come il cancro e la somministrazione del SNC, le infezioni e l'infiammazione, la trombosi e la disfunzione del microcircolo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi del dispositivo microfluidico sono difficili da imparare, abituarsi a piccoli volumi di campione e le migliori pratiche per evitare la formazione di bolle sono comunicate meglio visivamente. A dimostrare la procedura sarà Ashley Smith, una ricercatrice del nostro laboratorio.

Il dispositivo microfluidico SynVivo SMN è composto da due serie di porte parallele, una per il flusso nel rivestimento superficiale, le parti e/o le celle per l'alloggiamento e l'altra per l'esecuzione del saggio. Per iniziare, immergere completamente il dispositivo in una capsula di Petri contenente acqua deionizzata sterile e posizionare la piastra nel vuoto. Essiccare Lasciare che l'essiccante funzioni fino a quando tutta l'aria non viene rimossa dai canali del dispositivo.

L'operazione dovrebbe richiedere circa 15 minuti prima di rimuovere il dispositivo dall'acqua. Utilizzare una pinza a punta fine per posizionare il tubo tigon innescato con acqua in ciascuna porta del dispositivo. Il tubo dovrebbe essere lungo circa un pollice.

Il dispositivo può ora essere rimosso dall'acqua utilizzando una pipetta o una siringa. Posizionare una goccia d'acqua attorno alla base di un tubo della porta di ingresso. Rimuovere con cautela il tubo.

La goccia d'acqua impedirà all'aria di entrare nel dispositivo. Successivamente, preparare una siringa da un millilitro caricata con avadon a una concentrazione di 20 microgrammi per millilitro. Collegare la siringa a un ago e un tubo in acciaio inossidabile calibro 24 Clamp la porta di ingresso non utilizzata con una ganascia clamp.

Inserire il tubo nella porta di ingresso del dispositivo. Iniettare avadon a una velocità di flusso di un microlitro al minuto per 10 minuti per consentire la completa perfusione del dispositivo. Al termine del tempo di flusso.

Clamp tutti i tubi con ganascia clamps e posizionare il dispositivo a quattro gradi durante la notte. Lasciare che il dispositivo raggiunga la temperatura ambiente. Quindi posizionare il dispositivo su un microscopio a fluorescenza invertita dotato di un tavolino motorizzato e di una fotocamera ad alte prestazioni.

Preparare una soluzione di due micron di particelle biotinilate a una concentrazione di 5 milioni di particelle per millilitro in soluzione salina tampone fosfato o PBS. Caricare le particelle in una siringa da un millilitro. Preparare una seconda siringa da un millilitro di PBS.

Caricare solo ogni siringa su una pompa a siringa, quindi collegarle all'ago e al tubo utilizzando una siringa per pipettatore. Posizionare una goccia d'acqua attorno alla base del tubo della porta di ingresso e rimuovere con cura il tubo utilizzato per rivestire il dispositivo. Inserire con cautela il tubo per le particelle biotinilate e per il PBS in ciascuna delle porte di ingresso.

Quindi iniziare a iniettare particelle biotinilate a una velocità di flusso di 2,5 microlitri al minuto. Monitorare la porta di ingresso sul microscopio al primo segno di particelle. Avvia il timer e continua a fluire per tre minuti.

Al termine dei tre minuti, interrompere il flusso di particelle biotinilate avviando contemporaneamente il flusso di PBS a una velocità di flusso di 2,5 microlitri al minuto. Lasciare che il PBS fluisca nel dispositivo per tre minuti per lavare via le particelle non legate. Per iniziare l'acquisizione, utilizzare la funzione di scansione dell'immagine di grandi dimensioni nel software di imaging per acquisire l'immagine dell'intero dispositivo, quindi numerare in sequenza le biforcazioni nel dispositivo e creare un'area circolare di interesse con il doppio del diametro dei canali.

In questo caso, impostare il diametro dell'area di interesse su 200 micron poiché il diametro del canale è di 100 micron. Utilizza la funzione di conteggio automatico nel software di imaging per esportare il numero di particelle in ciascuna area di interesse in un foglio di calcolo. Allo stesso modo, utilizza la funzione di account automatizzato per esportare il numero di particelle nell'intero dispositivo.

Vengono eseguite simulazioni CFD e i risultati vengono memorizzati in un database per ulteriori analisi. Le informazioni incluse nei risultati contengono velocità di taglio della parete, velocità, flusso di particelle e aderenza al dispositivo. Le informazioni qui riportate vengono utilizzate per determinare il numero di particelle che aderiscono a ciascuna area di interesse in base a un input definito di una concentrazione di particelle.

Per generare una mappa di aderenza a taglio, calcolare la percentuale di adesione come descritto nel protocollo di testo come passaggio finale. Traccia la mappa di adesione pura utilizzando la velocità di pura ad ogni biforcazione delle reti e i valori di adesione percentuale. Questa immagine mostra un tipico dispositivo SMN syn vivo rivestito avidan dopo il legame di due particelle biotinilate micron.

Si noti che le particelle aderiscono preferenzialmente vicino alle biforcazioni nella rete. Le biforcazioni numerate nella rete SMN syn vivo possono essere viste qui. Questa immagine è la mappa di taglio della parete campione generata dal modello CFD del dispositivo.

La velocità di taglio varia nel dispositivo da 250 secondi inversi a 15 secondi inversi come osservato nel microvascolarizzazione in vivo. Si noti che queste velocità di taglio variabili non possono essere ottenute contemporaneamente nei canali microfluidici lineari in quanto forniscono una velocità di taglio costante per ogni portata. Il grafico mostrato qui dei valori della velocità di taglio in ciascuna delle biforcazioni della rete rivela che i modelli di velocità di taglio sono complessi e non possono essere ottenuti con una semplice relazione analitica a differenza dei canali di flusso lineari.

Inoltre, nella rete sono presenti più biforcazioni che cadono nello stesso bidone. Aumentando l'affidabilità statistica dei dati mostrati. Di seguito sono riportati i risultati di esempio dell'analisi CFD per i flussi di particelle nella rete, che vengono utilizzati per calcolare i flussi di particelle nei rami e nelle biforcazioni della rete sperimentale.

La mappa di adesione pura calcolata da un singolo esperimento SMN syn vivo segue la relazione inversa osservata dalle mappe di adesione pura ottenute da esperimenti di canale lineare. Tuttavia, utilizzando un saggio SynVivo, un singolo esperimento consente la generazione di questa mappa pura, mentre più esecuzioni sperimentali vengono acquisite dai canali lineari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare i dispositivi SynVivo SMN per generare l'adesione condivisa da un singolo esperimento.

Quando si esegue questo esperimento, è importante ricordare di non introdurre bolle nel dispositivo microfluidico SynVivo SMN dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'infiammazione per studiare l'interazione dell'endotelio leucocitario a diversi tassi in un unico esperimento. Nella prossima generazione di dispositivi, i ricercatori possono studiare l'adesione e la migrazione del rotolamento dei leucociti in un unico test, cosa che attualmente non è possibile.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi che studiano l'adesione di farmaci, veicoli di somministrazione di farmaci e cellule per indagare su questioni quali l'effetto fisiologico del flusso sulla cellula cellulare, sul farmaco cellulare e sull'adesione del veicolo farmacologico.