Name: Fluorescenza In situ Ibridazioni (FISH) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a Plant e Insetti tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Impara la tecnica FISH per localizzare virus e batteri endosimbiontici in tessuti vegetali e di insetti. Questo metodo permette di visualizzare acidi nucleici con precisione spaziale.

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La ricerca in laboratorio Ghanim è stato supportato da assegno di ricerca n. 908-42.12/2006 dal tedesco-israeliano Foundation (GIF), Grant no. IS-4062-07 dagli Stati Uniti e Israele binazionale agricolo di Ricerca e Sviluppo Fund (BARD), e assegno di ricerca n. 884/07 da Israele Science Foundation (ISF) per MG

1. Preparazioni Generale Whitefly, Flora e virus per l&#39;analisi FISH <ol><li> Posteriore B e Q aleurodidi biotipo su piantine di cotone (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) e mantenere all&#39;interno di gabbie a prova di insetti e camere di crescita in condizioni standard di 25 ± 2 ° C, 60% di umidità relativa, e una luce di 14 ore / 10-hr fotoperiodo scuro. </li><li> Eseguire PCR per testare infezione con endosimbionti utilizzando primer specifici endosymbiont come precedentemente descritto 15-19. </li><li> Acquistare Piantine di pomodoro (Solanum esculentum cv. Bistecca) da un vivaio commerciale oppure semi di pomodoro pianta. </li><li> Mantenere nelle stesse condizioni di allevamento sopra descritte fino a quando le piante raggiungono il quattro stadi true-foglia, l&#39;età più adatta per whitefly-mediata inoculazione di TYLCV 15 (vedere paragrafo 4.1). </li></ol> 2. Manipolazione Insetto, Fissazione, Probe Design, ibridazione e visualizzazione per Endosimbionte FISH <ol><li> Raccogliere 10 aleurodidi adulti per aspirazione da piante di cotone, o scegliere 10 3 ° o 4 ° ninfe instar da foglie di cotone. </li><li> Immergere immediatamente in fissativo di Carnoy (acido cloroformio-etanolo-acetico glaciale, 06:03:01, vol / vol) all&#39;interno di tubi Eppendorf. Fix per 2 ore a notte (preferibilmente durante la notte). </li><li> Rimuovere completamente il fissativo e decolorare nel 6% H 2 O 2 in etanolo per 2 ore. </li><li> Conservare i campioni in etanolo assoluto per diversi giorni a diverse settimane a temperatura ambiente, o procedere al passo successivo. </li><li> Sonde di progettazione complementari primer DNA temporanee basate sui 16S ribosomiale geni RNA di ciascun batterio. Per progettare le sonde, tenere il conto delle stesse considerazioni per la progettazione di primer PCR. Utilizzare le sonde oligonucleotidiche BTP1 5&#39;-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 &#39;, Rb1 5&#39;-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3&#39;, 5&#39;-BTH Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 &#39;e Ars2 5&#39;-Cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 &#39;per la gestione mirata di Portiera, Rickettsia, Hamilonella, e Arsenophonus, rispettivamente. </li><li> Ibridare campioni notte al buio in tampone di ibridazione (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 M NaCl, 0,01% [peso / vol] sodio dodecil solfato, 30% formammide [vol / vol]) contenente 10 pmol sonda fluorescente per ml . Combinare più di una sonda con differenti coloranti fluorescenti se necessario. Utilizzare aleurodidi non infette con il batterio mirati e campioni non-probe come controlli negativi. </li><li> Montare i campioni di tutto, su un vetrino da microscopio, in tampone di ibridazione contenuta con un bloccante liquido, coprire con un vetrino, sigillare con smalto, e vista sotto una fluorescenza o microscopio confocale. </li></ol> 3. Whitefly Organo Dissection, Fissazione, ibridazione e visualizzazione per TYLCV FISH <ol><li> Raccogliere aleurodidi adulti allevati con continuità su piante di pomodoro TYLCV infettati mediante aspirazione e anesthetize dall&#39;esposizione a tovagliolo di carta impregnata con acetone. Esporre aleurodidi solo per 1-2 min come troppo lunga esposizione di acetone può risolvere aleurodidi tessuti. Utilizzare aleurodidi nonviruliferous allevati su piante di pomodoro non infette e non campioni sonda per i controlli per confermare l&#39;ibridazione specifica. </li><li> Aleurodidi Montare su microscopio depressione scivoli per la dissezione degli organi utilizzando un microscopio stereo. </li><li> Tirare via la testa dell&#39;insetto dal protorace e sezionare ghiandole salivari in 1x PBS completato con l&#39;1% di toluidina blu macchia per una migliore visualizzazione, a causa delle loro piccole dimensioni. Consentire l&#39;assorbimento del colorante per 2-3 min. </li><li> Estrarre l&#39;insetto parte alla confluenza tra il torace e l&#39;addome per osservare ed espellere il midgut. Espellere il contenuto dell&#39;addome spingendo con una pinza sulla punta addome. </li><li> Rimuovere delicatamente il PBS e blu di toluidina da dissezioni di successo e aggiungere lentamente 300 ml di fissativo di Carnoy per risolvere gli organi per 5 min. </li><li> Ladd il fissativo da un lato del bene depresso e non dalla parte superiore per impedire movimenti incontrollati degli organi sezionati. Una volta che tocca il fissativo, gli organi aderiranno al vetro, e tutto il processo che non si muovano. </li><li> Rimuovere fissativo e aggiungere 500 ml di tampone di ibridazione supplementato con 10 pmol della sonda di DNA fluorescente Cy5-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;, che è complementare ad una sequenza in TYLCV gene della proteina di rivestimento. </li><li> Ibridare notte a temperatura ambiente al buio incubando il vetrino con il campione all&#39;interno di una piccola camera umida composta piccola scatola di plastica con carta asciugamano bagnato sul fondo. </li><li> Dopo l&#39;ibridazione, raccogliere gli organi con uno strumento di dissezione fine e rapidamente spostarli in un vetrino da microscopio fresco contenente 30 ml di nuovo tampone di ibridazione integrati con DAPI (0,1 mg / ml in 1x PBS) e contenuti con bloccante liquido. </li><li> Coprire i campioni con un vetrino, sigillare spiritoh smalto per unghie e vista sotto una fluorescenza o microscopio confocale. </li></ol> 4. Manipolazione pianta, a mano sezionamento, Fissazione e ibridazione per TYLCV FISH <ol><li> Seminare piantine di pomodoro con TYLCV utilizzando viruliferous inoculazione mosca bianca-mediata. Il virus può essere rilevato usando questo metodo FISH in piante asintomatiche una settimana dopo l&#39;inoculazione. I sintomi della malattia tipici sono visibili tre settimane dopo l&#39;inoculazione. Utilizzare piante di pomodoro infette e nessun campione sonda per i controlli per confermare l&#39;ibridazione specifica. </li><li> Utilizzare una lama di rasoio istologico affilata per la preparazione tagliate a mano 2-4 cm di lunghezza sezioni longitudinali o trasversali di pomodoro steli e foglie. </li><li> In provette Eppendorf, fissare le sezioni in fissativo di Carnoy per 2 ore durante la notte a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere fissativo e preservare le sezioni in etanolo assoluto per diversi giorni a diverse settimane a temperatura ambiente, o procedere al passo successivo. </li><li> Lavare le sezionitre volte, 1 min ciascuno, in tampone di ibridazione. </li><li> Ibridare le sezioni con 500 microlitri di tampone di ibridazione supplementato con 10 pmol di oligonucleotide sonda fluorescente Cy3-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;che è complementare ad una sequenza in TYLCV gene della proteina di rivestimento. </li><li> Lavare le sezioni tre volte, 1 min ciascuno, in tampone di ibridazione. </li><li> Mount intere sezioni in tampone di ibridazione integrato con DAPI (0,1 mg / ml in 1x PBS) e contenuti con blocker liquido, coprire con un vetrino, sigillare con smalto e vista sotto una fluorescenza o microscopio confocale. </li></ol>

<ol><li>Czosnek, H., Laterrot, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+worldwide+survey+of+Tomato+yellow+leaf+curl+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses.</a> Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).</li>
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<li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).</li>
<li>Nirgianaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).</li>
<li>Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+bacteriocyte-associated+endosymbionts+of+plant+sap-sucking+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects.</a> Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).</li>
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<li>Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+Wolbachia+infection+in+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).</li>
<li>Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+localization+of+bacterial+symbionts+in+three+whitefly+species+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29+from+the+east+coast+of+the+Adriatic%5BTitle%5D)+AND+%22+Bull.+Entomol.+Res%22%5BJournal%5D)">Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic.</a> Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo descritto qui per la localizzazione di un virus vegetale nella sua pianta ospite e dell&#39;insetto vettore, e batteri endosimbiontica nel loro ospite whitefly specifico, può essere adattato per la localizzazione di altri virus in piante e anche nei tessuti animali. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per localizzare batteri endosimbiontica e patogeni e altri microrganismi in sistemi vegetali e animali. I metodi descritti si basano sul semplice concetto di ibridazione tra breve, fluorescenza marca...

Quando studio delle interazioni tra virus vegetali e altri patogeni con i loro ospiti vegetali infetti, è importante visualizzare i patogeni e relativi acidi nucleici in situ, indipendentemente dal fatto che causano effetti negativi sulla loro ospiti. Questo è molto importante quando si studia il movimento patogeno all&#39;interno e tra le cellule vegetali. Nella localizzazione in situ di prodotti genici del patogeno è un passo essenziale che integra altri approcci per studiare il processo di patogenicità. Molti agenti patogeni delle piante, in particolare virus, vengono trasmessi da insetti, avendo interazioni complesse e intime con i loro vettori. La localizzazione di questi virus nei loro vettori è importante per studiare il percorso per la trasmissione, e le possibili siti di interazione all&#39;interno del vettore. La trasmissione di alcuni virus delle piante insetto-vectored è aiutata da batteri endosimbiontica che risiedono all&#39;interno di questi insetti. Per studiare meglio la trasmissione di questi virus vegetali by loro vettori, è anche indispensabile per visualizzare i batteri endosimbiontica in generale, e quelli coinvolti nella trasmissione del virus, in particolare. Colocalizzazione dei batteri virus e endosimbiontica è quindi desiderato per indagare le possibili relazioni tra questi organismi, nel loro ospite insetti. A parte la trasmissione del virus, batteri endosimbiontica influenzano diversi aspetti della biologia di insetti vettori, la localizzazione così spaziale di questi batteri all&#39;interno di insetti è di grande interesse e importanza. Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) è il più importante complesso malattia virale di pomodoro coltivata in tutto il mondo 1-4. TYLCV è un virus floema limitata ed è vectored esclusivamente dalla mosca bianca Bemisia tabaci 5,6. Un modello che descrive la traslocazione di begomoviruses nei loro vettori mosche bianche è stato proposto 6-9. Due ostacoli specifici sono attivamente attraversati duranteing questa trasmissione circulative: midgut / emolinfa e le barriere ghiandole emolinfa / salivari. Questo processo di trasmissione si ipotizza essere mediata da recettori sconosciute che riconoscono il capside del virus. TYLCV è pensato per attraversare B. tabaci midgut 6,10, e viene assorbito attraverso la ghiandola salivare primario 6 prima di essere iniettato nella pianta. Nel emolinfa mosca bianca, TYLCV interagisce con una proteina GroEL prodotta dal batterio insetto endosimbiontica secondario Hamiltonella. Questa interazione garantire un trasporto sicuro del TYLCV nella emolinfa, e lo protegge dagli attacchi del sistema immunitario degli insetti 11. Hamiltonella e Portiera, il endosymbiont primario di mosche bianche, sono alloggiati in bacteriocytes, cellule di insetto si trovano nelle emolinfa e la casa endosimbiontica batteri 11. B. tabaci ospita batteri endosimbiontica aggiuntive, tra cui Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, e FritschEA, che può essere localizzata all&#39;interno o all&#39;esterno dei bacteriocytes, e hanno diversi effetti sulla biologia dell&#39;insetto 12. Diversi studi hanno cercato di studiare la localizzazione di TYLCV in piante e whiteflies utilizzando protocolli in termini di tempo e costosi quali microscopia elettronica a trasmissione (TEM), anticorpi e RNA in situ su sezione di spessore microscopico 10,13, uno studio recente ha descritto la localizzazione dei virus delle piante all&#39;interno delle loro piante e vettoriali padroni di casa utilizzando un semplice protocollo 14. Qui si descrive un protocollo semplice per la localizzazione di TYLCV in B. tabaci sezionato midguts e delle ghiandole salivari, e nelle sezioni preparato da piante TYLCV da HIV. Descriviamo ulteriormente la localizzazione della Portiera, il endosymbiont primario di B. tabaci, e le sue endosimbionti secondarie Hamitonella, Rickettsia e Arsenophonus. Questo protocollo si basa sull&#39;utilizzo di sonde di DNA corti, chesono fluorescente sulla loro estremità 5 &#39;, e specificamente ibridarsi sequenze complementari a sequenze di geni virali o batterici. Il campione di trasformazione è relativamente facile e il segnale ottenuto è altamente specifico. Il protocollo descritto può essere utilizzato per localizzare virus, batteri e altri agenti patogeni nel loro vegetali, animali e insetti host, e può inoltre essere utilizzato per localizzare mRNA in un dato tessuto.

<table><tbody><tr><td>Etichettato in modo fluorescente&nbsp; Sonde</td><td>Metabion</td><td>20 bp HPLC purificato</td><td>Sequenza progettata dal cliente</td></tr><tr><td>Blu di toluidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>bloccante liquido</td> di biologia molecolare <td>Ted Pella Inc.</td><td>Codice 22309</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescenza<em&gt; in situ</em&gt; ibridazioni (fish) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a plant e insetti tessuti

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è un nome dato a una varietà di tecniche comunemente utilizzate per la visualizzazione trascritti genici in cellule eucariotiche e può essere ulteriormente modificato per visualizzare altri componenti della cellula come l&#39;infezione con virus e batteri. Localizzazione spaziale e la visualizzazione di virus e batteri durante il processo di infezione è un passo essenziale che integra espressione profiling esperimenti come microarrays e RNAseq in risposta a diversi stimoli. Comprendere le infezioni spazio-temporali con questi agenti integra esperimenti biologici volti a comprendere la loro interazione con componenti cellulari. Diverse tecniche di visualizzazione dei virus e batteri come sistemi gene reporter o metodi immunoistochimici richiedono molto tempo, e alcuni sono limitati a lavorare con organismi modello e coinvolgere metodologie complesse. FISH destinato RNA o DNA specie nella cella è un me relativamente facile e veloceThOD per studiare la localizzazione spazio-temporale di geni e per scopi diagnostici. Questo metodo può essere robusto e relativamente facile da attuare quando i protocolli impiegano breve ibridazione, sonde commercialmente acquistati, che non sono costosi. Ciò è particolarmente robusto quando la preparazione del campione, la fissazione, ibridazione, e la visualizzazione microscopica non comportano passaggi complessi. Qui si descrive un protocollo per la localizzazione di batteri e virus nei tessuti insetti e vegetali. Il metodo si basa sulla preparazione semplice, fissazione, e l&#39;ibridazione dei monti interi insetti e organi sezionati o parti di impianti fatti a mano, con 20 paia di basi sonde di DNA brevi coniugati con coloranti fluorescenti sul loro 5 &#39;o 3&#39; finisce. Questo protocollo è stato applicato con successo per un certo numero di tessuti insetti e vegetali, e può essere utilizzato per analizzare l&#39;espressione di mRNA o altre specie di RNA o DNA nella cellula.

Il sistema studiato in questo manoscritto è mostrato in Figura 1 e comprende una pianta infetta con TYLCV, un adulto e una ninfa del whitefly B. tabaci, e l&#39;anatomia interna della mosca bianca che mostra il percorso per TYLCV traslocazione nella insetto. Figura 2 mostra doppia FISH in una mosca bianca adulta per il simbionte primario Portiera e il simbionte secondario Arsenophonus. figura 3 mostra doppia FISH per Portiera e Ha...

Descriviamo qui un semplice ibridazione in situ fluorescente (FISH) metodo per la localizzazione di virus e batteri nei tessuti insetti e vegetali. Questo protocollo può essere esteso per la visualizzazione di mRNA in tutto il monte e le sezioni microscopiche.

Fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazioni (FISH) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a Plant e Insetti tessuti

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

fluorescence-situ-hybridizations-fish-for-localization-viruses

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Ibridazione in situ per la localizzazione precisa delle Trascrizioni nelle piante

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; su cromosomi mitotici di zanzare

Fonte: Ng, K. M., Tropini, C. Visualizzazione delle interazioni microbiota-ospite intestinale tramite ibridazione fluorescente in situ , colorazione con lectine e imaging. J. Vis. Esp. (2021).Questo video dimostra la procedura di ibridazione fluorescente in situ (FISH) per colorare il microbiota intestinale all'interno del tessuto intestinale del topo ibridando sonde fluorescenti con rRNA batterico (acido ribosomico ribonucleico) e controcolorando le strutture dell'ospite per analisi...

Ibridazione in situ fluorescente dei batteri intestinali nelle sezioni intestinali del topo

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

Abbiamo stabilito un protocollo di ibridazione fluorescente in situ per la rilevazione di un genoma del virus DNA persistente all'interno di sezioni tissutali di modelli animali. Questo protocollo permette studiando processo di infezione da codetection del genoma virale, i suoi prodotti di RNA e proteine ​​virali o cellulari all'interno delle cellule singole.

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

Questo protocollo per la marcatura immunofluorescente sia delle proteine del virus vegetale che delle proteine degli insetti vettori nelle viscere degli insetti asportati può essere utilizzato per studiare le interazioni tra virus e insetti vettori, le funzioni delle proteine degli insetti e i meccanismi molecolari alla base della trasmissione del virus.

Marcatura immunofluorescente di virus vegetali e proteine di insetti vettori nell'intestino degli emitteri

Questo protocollo semplificato descrive in dettaglio un flusso di lavoro per rilevare e visualizzare batteri in campioni di tessuto complessi, dal fissaggio del tessuto alla colorazione dei microbi con ibridazione fluorescente in situ .

Visualizzazione delle interazioni microbiota-ospite intestinale tramite ibridazione fluorescente in situ , colorazione della lectina e imaging

I microbi intestinali, compresi i batteri extracellulari e gli agenti patogeni intracellulari come il virus Orsay e i microsporidi (funghi), sono spesso associati ai nematodi selvatici di Caenorhabditis . Questo articolo presenta un protocollo per rilevare e quantificare i microbi che colonizzano e / o infettano i nematodi C. elegans e per misurare il carico patogeno dopo infezioni controllate in laboratorio.

Ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) per visualizzare la colonizzazione microbica e l'infezione nell'intestino di Caenorhabditis elegans

Impara la tecnica FISH per localizzare virus e batteri endosimbiontici in tessuti vegetali e di insetti. Questo metodo permette di visualizzare acidi nucleici con precisione spaziale.

Fluorescenza

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