Name: Endolinfatica immunoterapia e di vaccinazione nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Impara l'immunoterapia endolinfatica nei topi per stimolare le risposte immunitarie con iniezioni dirette nei linfonodi inguinali. Questo metodo migliora l'efficacia dei vaccini rispetto alle iniezioni sottocutanee tradizionali.

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Gli autori sono grati per l&#39;aiuto sperimentale nello sviluppo del metodo di immunizzazione endolinfatica nei topi da Iris Erdmann, Barbara von Beust, e Julia Maria Martínez-Gómez. Grazie anche a Maggy Arras e Nikola Cesarovic per averci permesso di usare la loro sala operatoria per questa produzione video.

1. Anestesia di topi <ol><li> Preparare i anestetici mescolando ketamina (anestetico dissociativo) e xilazina (sedativo e analgesico) in soluzione salina tamponata. Le concentrazioni di chetamina e xilazina nella soluzione finale sono 12,5 e 2 mg / ml, rispettivamente. </li><li> Iniettare anestetici ai topi per somministrazione intraperitoneale utilizzando una siringa con un ago G 25-30. Utilizzare 0,1 ml/10 g di peso corporeo. </li><li> Applicare una pomata oftalmica per gli occhi dei topi in modo da evitare l&#39;essiccazione-out delle cornee. </li><li> Assicurarsi che il mouse sia sufficientemente anestetizzato pizzicando il piede o del piede con le pinze. Se il mouse non reagisce con riflessi per il pizzico, procedere con un intervento chirurgico. Se il mouse reagisce pizzico di riflessi o contrazioni muscolari, aspettare 1-2 minuti e ripetere il test pizzico. Se il mouse reagisce ancora, sostituire il mouse con un nuovo animale e ripetere le procedure dal punto 1.2 in poi. </li></ol> 2. I chirurgicancision della zona inguinale del mouse <ol><li> Posizionare il mouse sulla sua schiena. </li><li> Bagnare una regione inguinale con etanolo disinfezione (70%). Per fornire una migliore disinfezione, la regione inguinale può essere rasata per rimuovere pelliccia prima disinfezione con etanolo. </li><li> Prendete la zampa posteriore e piegare l&#39;articolazione dell&#39;anca per produrre un angolo di circa 90 ° dell&#39;articolazione dell&#39;anca. </li><li> Utilizzando un curvo forcipe microdissecting, prendere la pelle del mouse nella zona inguinale, dove l&#39;articolazione dell&#39;anca è piegato e tirare la pelle bagnata leggermente. </li><li> Tenendo la pelle con le pinze, tagliare una piccola incisione (&lt;5 mm) attraverso la pelle con le forbici chirurgiche. </li><li> Posizionare la punta delle forbici chiuse nell&#39;incisione e aprire ulteriormente l&#39;incisione aprendo le forbici tenendolo dentro l&#39;incisione. Questo farà sì che la pelle allo strappo e dovrebbe produrre un diametro inferiore a 10 mm. Nota: Una sorgente di luce fredda con guide di luce flessibile può essere utilizzato per migliorare la visibilità. In più vecchiotopi, soprattutto maschi, l&#39;identificazione del linfonodo può essere difficile a causa tessuto molto grasso nella regione inguinale. </li></ol> 3. Iniezione endolinfatica <ol><li> Preparare una siringa (0,5 ml o meno) con un ago ipodermico G 28-30; un breve smussatura può essere preferibile per un lungo bisello. Aspirare 10 ml di vaccino da iniettare e assicurano che la siringa è privo di aria. </li><li> Localizzare il linfonodo inguinale con l&#39;aiuto delle pinze curve e la punta della forbice chiusa. Il linfonodo viene visualizzata grigiastro all&#39;interno del tessuto grasso più biancastra e può essere ulteriormente individuate attraverso afferenti ed efferenti capillari che entrano ed escono il linfonodo. </li><li> Immobilizzare il linfonodo tenendolo tra i rami delle pinze curve. </li><li> Prendere la siringa e inserire l&#39;ago nel linfonodo con lo smusso rivolto verso l&#39;alto, assicurandosi che il complesso smussatura entra nel linfonodo. </li><li> Iniettare il vaccino (10 microlitri). Se il cenno del capo linfae si gonfia (esplodere), l&#39;iniezione può essere assunto successo. Se l&#39;ago non è posizionato abbastanza in profondità nel linfonodo, una parte o l&#39;intero vaccino può fuoriuscire e non entrare nel linfonodo. Se l&#39;ago viene inserito troppo in profondità, il vaccino iniettato uscirà sottocutanea sotto del linfonodo. Nel caso di quest&#39;ultimo, ripetere l&#39;iniezione o sostituire il mouse con un nuovo mouse greggia. </li></ol> 4. Chiusura del Incision da sutura <ol><li> Aprire una confezione di sterile sutura chirurgica. </li><li> Afferrare l&#39;ago di sutura con un porta-aghi in corrispondenza della porzione distale del corpo dell&#39;ago. Serrare il supporto dell&#39;ago stringendola fino alle prime catture cricchetto. </li><li> Afferrare la pelle su un lato l&#39;incisione con pinze (a seconda delle preferenze del chirurgo, dentato o pinze o uncini cutanei non-denti possono essere utilizzati). Inserire l&#39;ago ca. 2-3 mm dal bordo dell&#39;incisione, entrando dall&#39;esterno della pelle. </li><li> Loosen stiva della pelle con la pinza e afferrare il lato opposto della incisione con le pinze. Inserire l&#39;ago ca. 2-3 mm dal bordo dell&#39;incisione, entrando dall&#39;interno della pelle. </li><li> Allentare il supporto dell&#39;ago e afferrare l&#39;ago con le pinze. Estrarre l&#39;ago con il battistrada attraverso la pelle, lasciando una conveniente lunghezza del battistrada di fuori del primo punto ago-inserimento (se diversi topi sono da trattare, lasciare un terminale più corto; 5-10 topi può funzionare con un ago di sutura / calcare). </li><li> Rendere il nodo preferito secondo protocolli chirurgo standard. Un punto è sufficiente che l&#39;incisione non è maggiore di 10 mm. Per incisioni di grandi dimensioni, effettuare un secondo punto. </li></ol> 5. Il trattamento post-operativa <ol><li> Posizionare il mouse nella gabbia e coprire con i tessuti per tenere in caldo. Durante il trattamento più topi, metterli uno vicino all&#39;altro per tenere in caldo. In alternativa, posizionare il mouse su un tappetino caldo fino a quando si sono svegliatiup. </li><li> Osservare il mouse fino a quando si svegliano. </li><li> Osservare i topi quotidiano con riferimento a guarigione delle ferite così come altri sintomi clinici, come infezioni della ferita. La ferita è in genere sufficientemente chiusa entro due giorni e guarito entro sette giorni dalla procedura. </li></ol>

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</ol>

TMK è chiamato come inventore di brevetti che si occupano di immunoterapia endolinfatica nell&#39;uomo. TMK è stato consulente scientifico ed ha ricevuto le spese di viaggio da ImVisioN GmbH, Cytos Biotechnology, MannKind Corporation, e XBiotech USA Inc. PJ non ha alcun interesse conflitto di rivelare.

Immunizzazione endolinfatica e immunoterapia hanno dimostrato di essere adatto per la stimolazione di entrambe le risposte anticorpali e risposte delle cellule T. Come dimostrato in questo video-articolo, la procedura endolinfatica di vaccinazione è un metodo semplice e veloce per stimolare una forte risposta immunitaria nei topi. Un chirurgo esperto può eseguire la procedura durante 3-4 min. La sessione può anche essere condiviso tra due chirurghi in cui si è tipicamente facendo l&#39;anestesia e la sutura e il secondo...

I vaccini sono tipicamente iniettati per via sottocutanea o intramuscolare stimolazione delle risposte immunitarie. Il successo di questa procedura richiede drenaggio efficace di vaccino ai linfonodi dove le cellule presentanti l&#39;antigene possono interagire con i linfociti per la generazione di risposte T e B-cellule. Inoltre, la forza e il tipo di risposte immunitarie indotte dipendono anche dalla densità o frequenza di tali interazioni, nonché il microambiente stesso, specialmente il contenuto di citochine. Poiché solo una piccola frazione di un vaccino iniettato in un tessuto periferico raggiunge un linfonodo, vaccinazioni di topi e nell&#39;uomo mediante iniezione diretta del vaccino con linfonodi, il sito sono stati generati risposte immunitarie, sono state eseguite. Nell&#39;uomo, la procedura è guidata da ultrasuoni, una procedura utilizzata anche per la somministrazione di agenti di imaging per la visualizzazione e la diagnosi del sistema linfatico. Nei topi, la procedura è invasiva. Qui, una piccola (5-10 mm) incision è realizzato nella regione inguinale di animali anestetizzati 1, il linfonodo è localizzato e immobilizzato con una pinza, e un volume di 10-20 ml di vaccino viene iniettato sotto controllo visivo; 10 microlitri è usato per prime iniezioni e in topi giovani con piccoli linfonodi, considerando che 20 microlitri può essere iniettato nei linfonodi di età superiore o topi già innescate, che hanno i linfonodi più grandi. L&#39;incisione può essere chiuso con un punto singolo con suture chirurgiche. Con questo metodo, i topi sono vaccinati con il plasmide DNA 2,3, RNA messaggero 4, 1,3,5,6 peptide, proteina 7-10, particelle 11, 12 batteri così come adiuvanti 7,13, e forte miglioramento immunitario Sono state osservate risposte contro tutti i tipi di vaccini. Il metodo endolinfatica della vaccinazione è particolarmente indicata nelle situazioni in cui la vaccinazione convenzionale produce immunità insufficiente o in cui la quantità di vaccino disponibile è limitato o very costoso. Nell&#39;uomo, il metodo endolinfatica di immunizzazione è stato applicato a pazienti allergici 14,15 o di pazienti con cancro 16-21. Sebbene l&#39;idea corrente è che il metodo endolinfatica è più invasivo rispetto ad altri metodi iniettabili come le iniezioni intramuscolari e sottocutanee, la percezione del dolore non è superiore dopo una puntura venosa 15. Si prevede che la vaccinazione endolinfatica diventerà alternativa o complementare ad altri metodi di vaccini profilattici e terapeutici particolarmente. Questo articolo descrive in dettaglio come viene eseguita la procedura di vaccinazione endolinfatica nei topi. Tutte le procedure descritte, sono state approvate dall&#39;Agenzia veterinario cantonale di Zurigo ed eseguiti secondo le linee guida federali svizzere e direttive sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.

<table><tbody><tr><td>Ketamina (Ketasol-100)</td><td>Graeub AG, Svizzera</td><td></td><td>Anestetici</td></tr><tr><td>Xilazina (Rompun)</td><td>Bayer, Germania</td><td></td><td>Anestetici</td></tr><tr><td>Viscotears Eye-Gel</td><td>Novartis, Svizzera</td><td></td><td>Per evitare che gli occhi si secchino durante l'anestesia.</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine 0,5 ml</td><td>BD Medical, Francia</td><td></td><td>29 G Siringhe da insulina con aghi fissati in modo permanente</td></tr><tr><td>6-0 Dermalon Monofilamento Nylon</td><td>Covidien, MA, USA</td><td></td><td>Per suture (0,7 metriche, 18 G, 45 cm, Blu)</td></tr><tr><td>Pinze curve, 4,5 in</td><td>Polymed, Svizzera</td><td></td><td>Per l'incisione e la tenuta dei linfonodi</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche diritte, 4,5 in</td><td>Polymed, Svizzera</td><td></td><td>Per incisione</td></tr><tr><td>Porta ago, 5,5 in</td><td>Polymed, Svizzera</td><td></td><td>Per chiudere l'incisione con la sutura</td></tr></tbody></table>

endolinfatica immunoterapia e di vaccinazione nei topi

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

I vaccini sono tipicamente iniettati per via sottocutanea o intramuscolare per la stimolazione delle risposte immunitarie. Il successo di questo richiede drenaggio efficiente di vaccino ai linfonodi dove le cellule presentanti l&#39;antigene possono interagire con i linfociti per la generazione delle risposte immunitarie voluto. La forza e il tipo di risposte immunitarie indotte dipendono anche dalla densità o frequenza di interazioni nonché il microambiente, in particolare il contenuto di citochine. Poiché solo una minima parte di vaccini iniettati perifericamente raggiunge linfonodi, le vaccinazioni di topi e gli esseri umani sono stati eseguiti mediante iniezione diretta di vaccino nei linfonodi inguinali, cioè l&#39;iniezione endolinfatica. Nell&#39;uomo, la procedura è guidata da ultrasuoni. Nei topi, una piccola (5-10 mm) incisione viene fatta nella regione inguinale di animali anestetizzati, il linfonodo è localizzato e immobilizzato con una pinza, e un volume di 10-20 ml di vaccino viene iniettato sotto controllo visivo.L&#39;incisione viene chiusa con un solo punto usando suture chirurgiche. I topi sono stati vaccinati con il plasmide DNA, RNA, peptidi, proteine, particelle e batteri e coadiuvanti, e si è osservata una forte miglioramento delle risposte immunitarie contro tutti i tipi di vaccini. Il metodo endolinfatica della vaccinazione è particolarmente indicata nelle situazioni in cui la vaccinazione convenzionale produce immunità insufficiente o in cui la quantità di vaccino disponibile è limitato.

La procedura di iniezioni intralinfatiche nei topi, nonostante la natura chirurgica, è semplice e relativamente veloce. Una persona esperta in grado di eseguire la procedura in 3-4 min. L&#39;incisione che è chiuso con un punto guarisce in genere entro due giorni (Figura 1) Endolinfatica vaccinazione o immunizzazione è stato eseguito con mRNA, DNA plasmidico, peptidi, proteine, virus e batteri. Figura 2 illustra la produzione anticorpale dopo immunizzazione ...

Vaccinazione profilattica e terapeutica spesso non riesce a stimolare forti risposte immunitarie dovuto settimana drenaggio del vaccino ai linfonodi e conseguente scarsa coinvolgimento delle cellule immunitarie. Mediante iniezione diretta di vaccino da linfonodi, cosiddetta iniezione endolinfatica, l&#39;efficacia del vaccino può essere fortemente migliorata e dosi di vaccino può essere ridotta.

Endolinfatica immunoterapia e di vaccinazione nei topi

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è stimolare le risposte immunitarie nei topi mediante iniezione diretta del vaccino nei linfonodi. Questo viene ottenuto anestetizzando prima il topo ed eseguendo una piccola incisione nella regione inguinale. Successivamente, localizzare e immobilizzare i linfonodi inguinali.L'ultimo passaggio consiste nell'iniettare il vaccino nel linfonodo inguinale. In definitiva, l'amministrazione intralinfatica del vaccino può essere valutata misurandone la risposta e confrontandola con metodi di somministrazione tradizionali come le iniezioni sottocutanee. Generalmente, le persone nuove a questo metodo hanno difficoltà a colpire il linfonodo con il vaccino.Potrebbe essere necessario un certo allenamento per coordinare l'immobilizzazione del linfonodo, l'inserimento dell'ago e l'iniezione del vaccino, poiché l'ago può facilmente uscire dalla posizione corretta, con conseguente iniezione del vaccino al di fuori del linfonodo. Per iniziare, anestetizzare il topo seguendo il protocollo descritto nel testo allegato. Nel più breve tempo possibile, applicare un unguento oftalmico sugli occhi del topo per evitare che le cornee si secchino.Quindi posizionare il topo in posizione supina e pizzicare la zampa del topo con una pinzetta per verificare che sia sufficientemente anestetizzato. Se non si osserva alcuna reazione, coprire la testa del topo con un tessuto per proteggerla dalla luce e disinfettare una regione inguinale con etanolo al 70%. Sollevare quindi la zampa posteriore e piegare l'articolazione dell'anca formando un angolo di 90 gradi.Ora, con pinzette da dissezione microscopiche curve, sollevare la pelle aderente nella curvatura ed effettuare un piccolo taglio attraverso la cute. Quindi inserire la punta delle forbici chiuse nell'incisione. Aprire le forbici per strappare un diametro inferiore a 10 millimetri nella regione inguinale.Identificare il linfonodo in base al suo aspetto sferico e grigiastro rispetto al tessuto adiposo circostante più chiaro. Utilizzare una siringa da 0,5 millilitri con un ago ipodermico da 28 gauge a bevello corto per aspirare 10 microlitri del vaccino da iniettare. Ora immobilizzare il linfonodo tra le branchie della pinza curva.Quindi, con il bisellino rivolto verso l'alto, inserire l'ago della siringa nel linfonodo. Assicurarsi che l'intero bisellino entri nel linfonodo. Iniettare il vaccino e osservare il rigonfiamento, che indica un'iniezione riuscita.Aprire una confezione di sutura chirurgica sterile usando un pinza portaago. Afferrare l'ago da sutura nella parte distale del corpo dell'ago. Quindi stringere la pinza portaago comprimendola fino a quando il primo scatto del meccanismo non si blocca e tirare il filo.Successivamente, afferrare la pelle da un lato dell'incisione. Inserire l'ago dall'esterno della pelle al margine dell'incisione. Ora allentare la presa sulla pelle e afferrare il lato opposto dell'incisione con la pinza.Inserire l'ago dall'interno della pelle a circa due o tre millimetri dal bordo dell'incisione. Afferrare nuovamente l'ago. Terminare con la pinzetta e allentare il portaaigo.Fare passare l'ago con il filo attraverso la cute, lasciando una lunghezza conveniente di filo all'esterno del primo punto di inserzione dell'ago. Realizzare il nodo chirurgico preferito. Se l'incisione è più lunga di 10 millimetri.Eseguire un secondo punto quando l'incisione è sufficientemente chiusa. Trasferire il topo su un tappetino riscaldante per il recupero. Monitorare i topi quotidianamente per la guarigione della ferita e per altri sintomi clinici come infezioni.Queste iniezioni intralinfatiche nei topi sono semplici e relativamente rapide. Un'incisione chiusa con un solo punto di sutura si rimargina tipicamente entro due giorni. Qui, la produzione di anticorpi è stata misurata dopo immunizzazione con la proteina fosfolipasi A due.L'allergene principale del veleno B. La somministrazione intralinfatica ha indotto forti risposte anticorpali con un'iniezione di 0,01 microgrammi di PLA A due, mentre erano necessari 10 microgrammi di PLA A due per ottenere una risposta adeguata mediante iniezione sottocutanea.In questo esperimento, la vaccinazione intra-linfatica è stata utilizzata per stimolare le risposte dei linfociti T citotossici. Una singola iniezione sottocutanea di topi TCR 3 1 8 con G 33 ha indotto la prevista risposta dei linfociti T citotossici di otto. Tale risposta è stata amplificata di circa sei ordini di grandezza dopo un'iniezione intra-linfatica. Le funzioni dei linfociti T CD4 sono state inoltre testate in un saggio di sfida tumorale.Quando i topi immunizzati sono stati sottoposti a sfida per via endovenosa con cellule tumorali EL4 sinniche esprimenti NP52, i topi hanno sviluppato linfoma sistemico. L'immunizzazione per via intralinfatica ha determinato tempi di sopravvivenza molto più lunghi rispetto all'immunizzazione per via sottocutanea. Negli esseri umani.L'amministrazione intralinfatica del vaccino viene eseguita con l'ausilio dell'ecografia, identificando i linfonodi sottocutanei. Interessantemente, negli esseri umani, i traccianti proteici radiomarcati indicano che le iniezioni sottocutanee hanno una scarsa distribuzione nei linfonodi, mentre l'iniezione diretta nel sistema linfatico favorisce un rilascio efficiente alle cellule immunitarie per la stimolazione della risposta immunitaria. Una volta acquisita padronanza, questa procedura di vaccinazione intralinfatica può essere eseguita in circa due o tre minuti per topo.

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