VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost

L'obiettivo generale è quello di dimostrare la metodologia che utilizza il silenziamento genico indotto da virus per identificare i geni coinvolti nella resistenza non ospite per ottenere VIG della pianta endogena. Il gene bersaglio inocula le piante di nicotiana hamama con il virus del sonaglio del tabacco costrutto dai fichi che trasportano un frammento del gene bersaglio, preparare e inoculare le colture patogene non ospiti che esprimono la proteina fluorescente verde sulle foglie delle piante silenziate dal gene. Successivamente, valutare le colonie fluorescenti verdi di agenti patogeni non ospiti sotto la luce UV al buio.

Al fine di identificare le piante gene silenziate che compromettono la resistenza dei non ospiti, identificare il gene bersaglio sequenziando l'inserto nel vettore virale. Nel complesso, questa metodologia di screening genetico forward mediato da VIX consente ai ricercatori di identificare facilmente i geni coinvolti nella resistenza delle piante contro i patogeni batterici. In un breve periodo di tempo, ci siamo resi conto che l'importanza di combinare il silenziamento genico indotto da virus mediava la genetica diretta con i patogeni che esprimono GFP UV per identificare i geni responsabili della resistenza non ST.

Quando in precedenza abbiamo fatto un noioso screening genetico in avanti segnando per la morte cellulare indotta dall'iperrisposta e la morte cellulare indotta dalla malattia. Quindi i semi di nicotiana Ben su una miscela di invasatura fuori suolo germinano i semi in una camera di crescita. Dopo tre settimane, trapiantare le piantine in vasi individuali, coltivarle in serra per almeno due o tre giorni prima del virus del sonaglio del tabacco.

L'inoculazione del vettore di fichi scongela gradualmente gli steli congelati di agrobacterium contenente i cloni di cDNA. Intv due vettori in condizioni sterili inoculano le singole colture di agrobatteri su Luria. Le piastre Berti agro incubano le piastre a 28 gradi Celsius per un massimo di due giorni.

Far crescere quattro colonie replicate per ogni clone in modo che sia disponibile un adeguato inoculo di agrobacterium per l'inoculazione di due piante. Inoculare TRV one nel terreno liquido Luria berti. Raccogliere le colture coltivate durante la notte mediante centrifugazione, risospendere i batteri in inoculazione, tamponare e incubare per tre ore a temperatura ambiente su un agitatore a 50 giri/min.

Dopo aver raccolto le cellule mediante centrifugazione, misurare la densità ottica e sospendere i pellet batterici in un tampone MES da cinque millimolari con pH 5,5 Successivamente, inoculare la coltura batterica T RV one con OD 600 di 0,3 nel lato axi di tre o quattro foglie di nicotiana hamama utilizzando una siringa senza ago nel sito di inoculazione T RV one. Bucherellare le foglie con inoculo delle rispettive colonie T RV due usando uno stuzzicadenti per due settimane. Mantenere le piante a bassa temperatura con un'adeguata nutrizione perché una crescita vigorosa è importante per un efficiente silenziamento genico da parte dei suini.

Ad esempio, in questo esperimento viene utilizzato lo pseudomonas senge PV tomato T one. Gli agenti patogeni dovrebbero trasportare un plasmide in grado di esprimere G-F-P-U-V crescere i ceppi PGE nei re essere liquido, mezzo integrato con 10 microgrammi per millilitro. Rifampicina 50 microgrammi per millilitro può micina a 28 gradi Celsius per 12 ore.

Raccogliere le colture batteriche mediante centrifugazione, quindi confermare la presenza di fluorescenza verde utilizzando una lampada UV a lunga lunghezza d'onda al buio. Dopo due lavaggi in acqua sterile, sospendere nuovamente le cellule alla concentrazione desiderata di acqua sterile e regolare OD 600. Quindi inoculare i rispettivi agenti patogeni sul lato assiale del bersaglio.

Se necessario, le foglie silenziate geneticamente sono circondate di circa 1,5 centimetri di diametro. Testare contemporaneamente diversi agenti patogeni non ospiti per la loro crescita nel gene bersaglio, le piante silenziate includono anche un controllo del vettore per la visualizzazione. Impiantare una crescita batterica tra i due e i cinque giorni.

Esporre le foglie inoculate a una luce UV a lunga lunghezza d'onda al buio. Assicurati di indossare una protezione per la pelle e gli occhi. Monitorare le colonie batteriche come macchie fluorescenti verdi sul lato assiale della foglia sullo sfondo della fluorescenza rossa emessa dalla superficie fogliare.

Verificare la fluorescenza verde emessa dal patogeno ospite che funge da controllo positivo. Osservare la crescita dell'agente patogeno ogni giorno da due a cinque giorni dopo l'inoculazione. Fai un elenco dei cloni che, silenziandoli, hanno provocato la crescita di uno o più agenti patogeni non ospiti.

Per rimuovere i falsi positivi dalla prima schermata. Ripetere i VIG per cloni selezionati e, di nuovo, testare la risposta delle piante geneticamente silenziate ai patogeni non a costo zero. Utilizzare la PCR a colonia sul clone selezionato per amplificare l'inserto utilizzando A TTB uno e TB, due primer nel T RV, due vettori o primer che oscurano il sito di clonazione.

Eseguire il prodotto PCR su un gel aros e verificare l'amplificazione della singola banda. Quindi sequenziare l'inserto genico della pianta nel vettore T RV due utilizzando i primer A TTB o i primer che fiancheggiano il sito di clonazione. Eseguire l'esplosione utilizzando la sequenza e identificare i dettagli del gene.

Un protocollo generalizzato per silenziare un gran numero di geni utilizzando fichi a base di virus del sonaglio del tabacco nella nicotiana. Hamana è mostrato in questo diagramma di flusso. Alcune delle piante silenziate dal gene hanno mostrato varie alterazioni fenotipiche, tra cui crescita stentata, ingiallimento e fenotipi di fotosbiancamento.

Questi dati mostrano la fluorescenza verde del patogeno esposto alla luce UV al buio prima dell'inoculazione delle piante e dei loro impianti di crescita: tre giorni dopo l'inoculazione, la stessa foglia esposta alla luce bianca viene mostrata come controllo. Questo esperimento traccia la crescita dei batteri che esprimono G-F-P-U-V nella plana. Tre non ospiti.

I patogeni sono stati utilizzati per dimostrare il processo di identificazione del gene silenziato pianta suscettibile ai patogeni non ospiti in natura non silenziato nicotiana hamama piante con immunità. Questi agenti patogeni non sono cresciuti. Tuttavia, almeno due patogeni non ospiti sono cresciuti sulle foglie silenziate del gene NB sgt.One

. I dati quantitativi sulla crescita batterica dimostrano il processo di identificazione delle piante geneticamente silenziate compromesse per la resistenza non ST. Utilizzando questo approccio genetico forward mediato da fichi, abbiamo silenziato circa 5.000 geni nella nicotiana hamana e identificato piante che compromettono la resistenza non-ST per un periodo di circa un anno e mezzo.

Ad esempio, qui viene mostrata la crescita di patogeni non ospiti in due piante silenziate geniche identificate da questa schermata. Speriamo di aver trasmesso come eseguire il silenziamento genico indotto da virus per centinaia di geni, e quindi valutare le piante silenziate osservando la crescita di agenti patogeni non a costo in plana per sezionare la resistenza a costo zero. Utilizzando questo gene indotto dal virus, il protocollo mediato dal silenziamento, è possibile silenziare centinaia di geni in un periodo di tempo di circa due o tre settimane, e quindi valutare la crescita di patogeni non equini marcati con GFP UV in circa due o tre ore al giorno, per un periodo compreso tra due e cinque giorni.