Name: VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Scopri la metodologia VIGS per identificare geni coinvolti nella resistenza nonhost nelle piante. Questo protocollo utilizza patogeni batterici esprimenti GFPuv per screening visivo rapido ed efficiente.

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Questo progetto è stato finanziato dalla Fondazione Samuel Roberts Noble. Autori ringraziano Mss. Janie Gallaway e Colleen Elles per un&#39;eccellente cura delle piante, e la signora Katie Brown per opere d&#39;arte. Vorremmo anche ringraziare Mss. Trina Cottrell, Pooja Uppalapati, Moumita Saha, Swetha Vinukonda e il signor Isaac Greenhut per assistenza tecnica durante istituzione di questo protocollo.

1. Crescita delle piante e Target silenziamento genico <ol><li> Condizioni di crescita delle piante: <ol><li> Seminare N. semi benthamiana sul suolo-meno miscela invasatura, Metro-Mix 350 e germinare i semi in una camera di crescita. Qualsiasi altro suolo o fuori suolo medio può anche essere usato al posto di Metro-Mix. </li><li> Trapianto di tre settimane vecchie piantine in singoli vasi e farli crescere in una serra mantenuta a 21 ± 2 ° C insieme ad altre condizioni di crescita, come descritto nella letteratura precedente 12. Due o tre giorni dopo il trapianto, le piante possono essere utilizzati per TRV inoculazione. </li></ol></li><li> Crescere TRV2 cloni: TRV è un virus bipartito e il suo genoma è costituito da RNA1 e RNA2. RNA1 codifica un RNA polimerasi RNA-dipendente e una proteina movimento 20,21. RNA2 codifica una proteina di rivestimento (CP) e due proteine ​​non strutturali provenienti dai RNA subgenomici 21. Sia RNA1 e RNA2 sono necessari per la formazione di vir maturatonoi particelle e la loro diffusione 20,21. costruzione della libreria di cDNA in TRV2 vettore è descritto nella letteratura precedente 22,23. Brevemente, biblioteca VIGS utilizzato in questo studio è stato costruito dagli RNA estratto da tessuti fogliari esposti a vari elicitori biotici e abiotici. <ol><li> Estrarre Agrobacterium (GV2260 ceppo) contenente i cloni di cDNA in TRV2 vettore (una piastra a 96 pozzetti) dal freezer. A poco a poco li scongelare e dopo le culture a temperatura ambiente, inoculare la cultura Agrobacterium individuale su Luria-Bertani (LB) piastra di agar con rifampicina (10 mg / ml) e kanamicina (50 mg / ml) utilizzando un replicatore 96-pin. </li><li> Incubare le piastre a 28 ° C per due giorni. Noi di solito crescono quattro colonie repliche per ogni clone in modo adeguato Agrobacterium inoculo è disponibile per pungere l&#39;inoculazione dei due impianti. Eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili. </li></ol></li><li> VIGS: <ol><li> CrescereAgrobacterium (GV2260) portante TRV1 a 28 ° C in terreno liquido LB con antibiotici summenzionati. Celle di raccolta per centrifugazione di culture cresciute durante la notte, risospendere nel buffer di inoculazione (10 mM MES, pH 5.5, 200 mM acetosyringone), e incubare per 3 ore a temperatura ambiente su un agitatore a 50 rpm. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere in 5 mM MES tampone (pH 5,5) e inoculare (OD 600 = 0,3) nel lato abaxial di 3-4 N. benthamiana lascia utilizzando una siringa senza ago. Procedura di inoculazione dettagliato è dimostrato nella letteratura precedente 24. Più tardi, nella sede di inoculazione TRV1, inoculare rispettivi TRV2 colonie, pungendo le foglie con uno stuzzicadenti. </li><li> Mantenere le piante con una nutrizione adeguata, come la crescita vigorosa è importante per VIGS efficienti 12. Circa due settimane dopo l&#39;inoculazione le trascrizioni dei geni mirati cominceranno a diminuire e le piante sono pronte per INOC patogenomento a tre settimane dopo l&#39;inoculazione TRV. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di Nonhost Culture patogeno e inoculazione impianto <ol><li> Dettagli di agenti patogeni utilizzati in questo studio: Pseudomonas syringae pv. Tabaci, P. syringae pv. pomodoro T1, P. syringae pv. glycinea e Xanthomonas campestris pv. vesicatoria sono utilizzati in questo studio. Crescere P. syringae in B Re (KB) mezzo liquido integrato con rifampicina (10 mg / ml), kanamicina (50 mg / ml) a 28 ° C per 12 ore. Crescere X. campestris pv. vesicatoria in LB liquido per 16 ore. Tutti gli agenti patogeni harbor un plasmide che può esprimere GFPuv come descritto nella letteratura precedente 19. </li><li> Preparazione delle colture di agenti patogeni per l&#39;inoculazione impianto: <ol><li> Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione e confermare la presenza di fluorescenza verde tramite lunghe walampada UV velength al buio. Lavare le cellule due volte con acqua sterile e risospendere alla concentrazione desiderata con acqua sterile. </li><li> Seminare il rispettivo agente patogeno (s) sul lato abaxial di geni silenziati foglie di destinazione (5 all&#39;8) come macchie (circa 1,5 cm diametro). Diversi patogeni nonhost possono essere testati simultaneamente per la loro crescita nel gene piante silenziate bersaglio. Contemporaneamente inoculare il patogeno host come questo può essere usato come controllo positivo per la visualizzazione in planta crescita batterica. Inoculare anche il controllo vettoriale (TRV :: 00) piante. </li></ol></li></ol> 3. Osservazione in planta di crescita di batteri patogeni <ol><li> Esporre le foglie inoculate ad una lunga luce UV di lunghezza d&#39;onda nel buio. Colonie batteriche possono essere visualizzate come punti verdi fluorescenti nella parte abassiale della foglia sullo sfondo di fluorescenza rossa emessa dalla superficie della foglia. </li><li> Osservare la crescita dei patogeniDa 2 giorni dopo l&#39;inoculazione (dpi) a 5 dpi. L&#39;osservazione quotidiana durante questo intervallo di tempo è necessario. </li><li> Dopo la prima schermata, breve elenco dei cloni il cui silenziamento risultati in crescita di uno o più agenti patogeni nonhost (s). </li><li> Ripetere VIGS per i cloni selezionati e nuovamente valutare la risposta dei geni di piante silenziate patogeno nonhost (s). Questo secondo livello di screening è fatto per rimuovere i falsi positivi ottenuti nel primo schermo. </li></ol> 4. Conferma di piante selezionate per resistenza Nonhost compromessa <ol><li> Tacere i cloni di cDNA selezionate dalla schermata come descritto sopra. Inoculare l&#39;intera pianta con nonhost patogeno (s) immergendo le piante con rispettive culture patogeno con 0,01% (v / v) Silwet L-77 e sottoponendo le piante sommerse per aspirare per 3 - 5 min. Quantificare la crescita batterica mediante saggio di crescita convenzionale 6,18,19 come descritto di seguito. </li><li> A 0 ore post inoculazione (HPI),3 dpi e 5 dpi, raccolgono due campioni di foglie da cinque biologico repliche per ciascun patogeno nonhost (s) foglie inoculate con un pugno foglia (0,5 cm 2). Macinare i campioni di foglie, di serie diluito e piatto il SAP su KB agar addizionato con antibiotici e incubare appropriate a 28 ° C per 2 giorni. Contare le colonie batteriche utilizzando un contatore di colonie e calcolare la crescita batterica nelle foglie, come descritto nella letteratura precedente 6. </li><li> Piante sensibili al nonhost patogeno (s) dovrebbero mostrare maggiore numero di crescita dei patogeni rispetto al controllo vettoriale. </li></ol> 5. Sequenziamento Inserisci e Identificazione di Target Gene <ol><li> Eseguire colonia PCR per il clone selezionato utilizzando attB1 e attB2 primer o utilizzando i primer fiancheggianti il ​​sito di clonaggio nel vettore TRV2. Eseguire il prodotto di PCR sul gel e controllare l&#39;amplificazione della singola banda. </li><li> Inserto gene vegetale nel vettore TRV2 può essere sequenziato usando attBprimer o primer fiancheggianti il ​​sito di clonazione. </li><li> Eseguire BLAST utilizzando la sequenza e identificare i dettagli gene. </li><li> Ottenere piena sequenza genica lunghezza insieme con le regioni non tradotti (UTR). </li><li> Selezionare 300-400 bp frammenti provenienti da tre diverse regioni della sequenza e li clonare in TRV2 vettore. Indipendentemente eseguire VIGS utilizzando tutti e tre i VIGS costrutti e confermare il compromesso di resistenza nonhost in tutte e tre le piante silenziate gene. </li></ol>

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Immunità impianto limita la crescita di patogeni nonhost e, quindi, poca o nessuna fluorescenza verde è emessa da impianti di controllo vettoriale foglie inoculate con patogeni nonhost sotto luce UV di lunghezza d&#39;onda lunga (Figura 3D). Tuttavia, quando un gene coinvolto nella resistenza nonhost viene messo a tacere, le piante silenziate gene favoriscono la crescita di nonhost fluorescenza patogeno e verde è visto (Figura 3E). Questo è il principio di base coinvolti nel metodo desc...

Nonhost resistenza è la resistenza di tutte le specie vegetali da anelli di un particolare agente patogeno 1,2. Questo conferisce ampio spettro e durevole resistenza alle malattie nelle piante 2,3. Tuttavia, il suo meccanismo, in particolare contro batteri patogeni, non è ben compreso 4. Screening per mutanti o piante tacere che la resistenza nonhost compromesso, e l&#39;alta velocità trascrizione profiling per l&#39;identificazione di geni differenzialmente espressi durante la resistenza nonhost 5-9 sono due principali approcci precedentemente utilizzati per sezionare batterica resistenza nonhost. Perché la resistenza nonhost è controllato da un complesso meccanismo (s) 4 con il coinvolgimento di molti geni, un approccio genomica funzionale di throughput elevato per l&#39;identificazione di geni è fondamentale per una migliore comprensione del meccanismo di resistenza nonhost (s). Indotta da virus silenziamento genico (VIGS) è stato utilizzato con successo per mettere a tacere pianta endogenageni in molte specie vegetali 10,11. Nicotiana benthamiana è una delle migliori piante adatte per VIGS 10,12 e il suo progetto di sequenza del genoma è ora disponibile 13. virus sonaglio tabacco (TRV) basati VIGS è stato ampiamente utilizzato come strumento di genetica inversa per caratterizzare i geni coinvolti nella resistenza nonhost 2,4,14. Questo VIGS vettori e derivati ​​sono ora disponibili attraverso Arabidopsis Centro di Risorse Biologiche (ABRC, <a href="http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html</a> ). VIGS è stato utilizzato anche come strumento di genetica in avanti per identificare geni coinvolti nella immunità pianta 15-17, resistenza soprattutto nonhost 6,18. Valutare la risposta ipersensibile (HR)-mediata morte cellulare indotta da piante contro uno specifico agente patogeno nonhost e valutare la malattia la morte cellulare indotta sono due importanti saggi utilizzati principalmente per identifying gene suscettibile tacere piante. Tuttavia, la morte delle cellule umane è indotta solo contro di tipo II nonhost patogeni e non contro le tipo-I nonhost patogeni 2. Quindi, le analisi delle risorse umane non può essere usato universalmente per identificare strategie di resistenza nonhost utilizzati dalle piante, in particolare contro un&#39;ampia gamma di tipo-I nonhost patogeni. Inoltre, la perdita parziale della resistenza nonhost in un gene silenziato impianto non sempre porta a sintomi di malattia 6 e quindi di punteggio malattia non può essere utilizzato per identificare le piante compromettenti resistenza nonhost. In contrario, valutare la crescita dei patogeni nonhost nelle piante silenziate gene è un metodo migliore per studiare la perdita di resistenza nonhost nel gene piante silenziate. Rispetto al saggio di crescita convenzionale 6,19, un metodo più veloce per valutare la crescita batterica nonhost sulle piante silenziate gene può ridurre il tempo richiesto per genetica diretta screening. Abbiamo precedentemente riportato un metodo per osservare i batteril crescita patogeno su foglie da occhio nudo sotto ultravioletta (UV) utilizzando batteri esprimenti proteina fluorescente verde (GFP) 19. In questo manoscritto si dimostra l&#39;utilità di GFPuv esprimere patogeni batterici nonhost per una facile identificazione di geni silenziati piante che sono compromesse per la resistenza nonhost. Questa metodologia è accurata per l&#39;identificazione delle piante sensibili e suscettibili di screening ad alto rendimento.

<table><tbody><tr><td>Piastre con fondo a U a 96 pozzetti</td><td>Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>35-3077</td><td></td></tr><tr><td>Replicatore a 96 pin in acciaio inossidabile</td><td>Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>Lampade di ispezione UV ad alta intensità, modello B-100ap</td><td>Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)</td><td>6283K50</td><td>ID produttore 95-0127-01 </td></tr><tr><td>Contatore</td> <td>di colonie Stuart SC6Bibby Scientific Limited, Staffordshire, Regno Unito</td><td>SC6PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Miscela per vasi fuori suolo, Metro-Mix 350</td><td>SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: attB1 (GGGGACAAGTTTGTAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)</td>MES <td>sintetizzato</td><td></td>su misura</tr><tr><td>, monoidrato </td><td>VWR international (Radnor, PA, USA)</td><td>CAS No. 145224-94-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone (Dimetossi-4'-idrossiacetofenone) </td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77)</td><td>Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)</td><td>VIS-30</td><td></td></tr></tbody></table>

vigs-mediated forward genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza nonhost

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost resistenza alle malattie delle piante contro i batteri patogeni è controllato da meccanismi di difesa complessi. La comprensione di questo meccanismo è importante per lo sviluppo di piante resistenti alle malattie durevoli contro un&#39;ampia gamma di patogeni. Indotta da virus silenziamento genico (VIGS) a base di genetica diretta screening è un approccio utile per l&#39;identificazione di geni di difesa delle piante imprimere resistenza nonhost. Virus sonaglio tabacco (TRV) a base di VIGS vettore è il più efficiente VIGS vettore ad oggi ed è stato utilizzato in modo efficiente per silenziare geni bersaglio endogeni in Nicotiana benthamiana. In questo manoscritto, dimostriamo un approccio prospettico di screening genetico per il silenziamento di singoli cloni da una libreria di cDNA in N. benthamiana e valutare la risposta del gene piante silenziate per resistenza nonhost compromessi contro i patogeni nonhost, Pseudomonas syringae pv. pomodoro T1, P. syringae pv. glycINEA, e X. campestris pv. vesicatoria. Questi agenti patogeni batterici sono progettati per esprimere proteine ​​GFPuv e le loro colonie verde fluorescenti possono essere visti ad occhio nudo sotto la luce UV in nonhost piante inoculate patogeni se il gene bersaglio tacere è coinvolto in impartire resistenza nonhost. Questo facilita l&#39;identificazione affidabile e più veloce di geni silenziati piante suscettibili ai patogeni nonhost. Inoltre, promettente informazioni gene candidato può essere conosciuto con il sequenziamento del gene inserto centrale in TRV vettore. Qui mostriamo la capacità di throughput elevato di VIGS-mediate genetica avanti per identificare i geni coinvolti nella resistenza nonhost. Approssimativamente, 100 cDNA possono essere messi a tacere singolarmente in circa due o tre settimane e la loro rilevanza nella resistenza nonhost contro diversi batteri patogeni nonhost può essere studiato in una settimana dopo. In questo manoscritto, annoveriamo i passaggi dettagliati coinvolti in questo screening. VIGS-mediata genetica diretta screening approccio può essere esteso non solo ai geni coinvolti nella resistenza identificativi nonhost ma anche per studiare geni impartendo diverse tolleranze di stress biotico e abiotico in diverse specie vegetali.

Scopo principale di questo studio è quello di dimostrare un metodo per l&#39;identificazione facile e precisa di gene silenziato N. piante benthamiana che sono compromesse per la resistenza nonhost. Ci sono quattro fasi principali di questa metodologia. Il primo passo è quello di mettere a tacere individualmente gran numero di geni che utilizzano TRV-VIGS. Avevamo silenziato circa 5.000 geni 6,18 su un periodo di circa 1,5 anni usando il protocollo illustrato nella Figura 1....

Indotta da virus silenziamento genico è uno strumento utile per identificare geni coinvolti nella resistenza nonhost delle piante. Dimostriamo l&#39;uso di agenti patogeni batterici che esprimono GFPuv nell&#39;identificazione di geni silenziati piante suscettibili ai patogeni nonhost. Questo approccio è semplice, veloce e facilita lo screening su larga scala e di protocollo simili possono essere applicati a studiare varie altre interazioni pianta-microbo.

VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

L'obiettivo generale è dimostrare la metodologia che utilizza il silenziamento genico indotto da virus per identificare geni coinvolti nella resistenza non ospite, al fine di ottenere VIGs della pianta endogena. Inoculare piante di nicotiana hamama con costrutti di virus del mosaico della rucola del tabacco contenenti un frammento del gene bersaglio, preparare e inoculare colture del patogeno non ospite che esprimono la proteina fluorescente verde sulle foglie delle piante in cui il gene è stato silenziato. Successivamente, valutare le colonie verdi fluorescenti del patogeno non ospite sotto luce UV al buio.Per identificare piante con geni silenziati che compromettono la resistenza verso organismi non ospiti, occorre identificare il gene bersaglio mediante il sequenziamento dell'inserto nel vettore virale. Nel complesso, questa metodologia di screening genetico diretto mediato da VIX consente ai ricercatori di identificare facilmente i geni coinvolti nella resistenza verso organismi non ospiti delle piante contro patogeni batterici. In un breve periodo di tempo, abbiamo compreso l'importanza di combinare la genetica diretta mediata dal silenziamento genico indotto da virus con pato

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Descrizione di un virus-indotto silenziamento genico (VIGS) metodo per knock-down di espressione genica...

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

La genetica in avanti è un potente approccio per identificare i geni nei patogeni intracellulari importanti per la resistenza all'immunità autonoma cellulare. L'approccio attuale utilizza cellule immunitarie innate, in particolare macrofagi, per identificare nuovi geni Toxoplasma gondii importanti per l'evasione immunitaria.

Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; geni importanti per la Resistenza di IFN-γ-Dependent cellulare Immunità autonoma

La resistenza ai farmaci per terapie mirate è molto diffusa e la necessità di individuare meccanismi di resistenza - prima o dopo l'insorgenza clinica - è fondamentale per guidare le strategie alternative di gestione clinica. Qui, presentiamo un protocollo per accoppiare derivazione di linee farmaco-resistenti in vitro con sequenziamento per accelerare scoperta di questi meccanismi.

Implementazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance saggi: massimizzare il potenziale per scoprire clinicamente rilevanti Resistenza Meccanismi

Resistenza allo stress è uno dei tratti distintivi per la longevità ed è conosciuto per essere geneticamente governati. Qui, abbiamo sviluppato un metodo high-throughput imparziale per lo screening di mutazioni che conferiscono resistenza allo stress in cellule ES con cui sviluppare modelli murini per gli studi di longevità.

Approccio genetico in avanti per scoprire la resistenza allo stress geni nei topi - Uno Schermo high-throughput in cellule ES

Sono mostrati i dettagli su come mappare QTL con una mappa genetica basata su una sequenza intero di genoma può essere utilizzata per identificare un gene di resistenza alla droga in Toxoplasma gondii e come questo può essere verificato con il sistema CRISPR / Cas9 che modifica in modo efficiente un obiettivo genomico, in questo caso il Gene di resistenza alla droga.

Mapping QTL e modifica CRISPR / Cas9 per identificare un gene di resistenza alla droga in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Qui descriviamo un protocollo per impiegando HTS RNAi per scoprire destinazioni di host che possono essere manipolate per migliorare la terapia virus oncolytic, specificamente terapia del rhabodvirus e del vaccinia virus, ma può essere facilmente adattata ad altri oncolytic piattaforme di virus o di scoperta di geni ospitanti che modulano la replicazione del virus in generale.

Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic

Qui, presentiamo i protocolli per identificare gli immunomodulatori 1) virus-messo che promuovono la replica da arbovirus e fattori ospite 2) eucariotica che limitano la replica da arbovirus. Questi metodi basati su fluorescenza e luminescenza permettono ai ricercatori di ottenere rapidamente letture quantitative della replica da arbovirus nelle analisi semplicistiche con bassi rapporti segnale-rumore.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

Vi presentiamo un protocollo utilizzando un approccio genetico in avanti allo screening per i mutanti che mostrano neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Incorpora un saggio di arrampicata, analisi istologica, mappatura genica e sequenziamento del DNA per identificare in ultima analisi nuovi geni legati al processo di neuroprotezione.

In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

La mutagenesi inserzionale è uno strumento essenziale nella genetica avanzata per identificare gli elementi genomici funzionali. Qui, descriviamo l'Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), un metodo per rilevare i siti di integrazione dei lentivirus all'interno di una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale basata su lentivirus.

Identificazione di siti di integrazione di lentivirus funzionalmente rilevanti in una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale

Fattori dell'ospite romanzo coinvolti nella infezione virale può essere identificato tramite cell-based genome-wide perdita della funzione di screening RNAi.

Lo screening RNAi per fattori di accoglienza che partecipano Vaccinia Infezione da virus utilizzando Drosophila Celle

Scopri la metodologia VIGS per identificare geni coinvolti nella resistenza nonhost nelle piante. Questo protocollo utilizza patogeni batterici esprimenti GFPuv per screening visivo rapido ed efficiente.

VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost

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