Name: Il Xenopus Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Impara la tecnica cut-open Vaseline gap per registrare correnti ioniche a basso rumore in oociti di Xenopus. Questo metodo elettrofisiologico offe alta risoluzione temporale per studiare la cinetica dei canali ionici.

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Tutti i membri della Washington University di St. Louis Cardiac molecolare Engineering Lab. Un Burroughs Welcome Fondo Premio alla Carriera al Interface scientifico - 1010299 (JS).

<ol><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+KV+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).</li>
<li>Stefani, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut-open+oocyte+voltage-clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cut-open oocyte voltage-clamp technique.</a> Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).</li>
<li>Muroi, Y., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+anesthetics+disrupt+energetic+coupling+between+the+voltage-sensing+segments+of+a+sodium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel.</a> J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).</li>
<li>Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+Shaker+K%2B+channels%3A+I.+Ionic+and+gating+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents.</a> Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).</li>
<li>Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+the+activation+and+inactivation+kinetics+of+HERG+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiolt%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).</li>
<li>Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+active+calcium+channel+beta%281b%29+-subunit+by+size-exclusion+chromatography+and+its+role+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function.</a> J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).</li>
<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+I%3A+wild-type+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Na%28V%291.4.+J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle.</a> Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).</li>
<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+II%3A+a+periodic+paralysis+mutation+in+Na%28V%291.4+%28L689I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I).</a> J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).</li>
<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
<li>Clare, J. J., Trezise, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClare%2C+JJ+%22Expression+and+analysis+of+recombinant+ion+channels+%3A+from+structural+studies+to+pharmacological+screening%22">Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening</a>. , Wiley-VCH. (2006).</li>
<li>Susan, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCha%2C+A+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 296, Academic Press. 566-578 (1998).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy.+3rd+edn%22">Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K%2B+channel+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li>
<li>Richards, R., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+conformational+dynamics+of+membrane+proteins+in+situ+with+site-directed+fluorescence+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Techniques for Chloriding Silver Wires. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf">http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf</a> (1999).</li>
<li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silver-silver+chloride+electrode%3A+a+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The silver-silver chloride electrode: a possible generator of offset voltages and currents.</a> J. Neurosci. Methods. 19, 249-255 (1987).</li>
<li>Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+disulfide+bridge+linking+the+fourth+and+the+seventh+extracellular+loops+of+the+Na%2B%2Fglucose+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter.</a> J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).</li>
<li>Pantazis, A., Olcese, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPantazis%2C+A+%22Cut-Open+Oocyte+Voltage-Clamp+Technique.+In%3A+Roberts+G.+%28Ed.%29+Encyclopedia+of+Biophysics%3A+SpringerReference%22">Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference</a>. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;ovocita vaselina tensione gap clamp cut-open consente una rapida risoluzione dei dati, a basso rumore, aumentato il controllo sulla soluzione interna e la composizione soluzione esterna, e registrazioni stabili nel relativamente lunghi protocolli 19. Questi vantaggi impostate questa tecnica a parte il voltage clamp a due elettrodi standard e le tecniche di patch clamp. Sebbene attrezzature specializzate è necessaria e il protocollo è relativamente difficile, molto pochi problemi si verificano quando il ...

Tecniche tensione di serraggio specializzati permettono la registrazione di correnti ioniche a potenziali di membrana controllate. Ampiamente usato voltage clamp a due elettrodi (TEVC) e tecniche di patch clamp forniscono informazioni elettrofisiologiche attendibili sulle proprietà di molti canali ionici. Tuttavia, entrambi questi metodi hanno inconvenienti che impediscono l&#39;acquisizione di dati affidabili per i canali del sodio voltaggio-dipendenti veloci e altri canali attivanti veloce nelle membrane come quelle di ovociti di Xenopus. I laboratori Bezanilla e Stefani quindi sviluppato la tecnica del clamp di tensione gap vaselina cut-open (COVG) per ovociti 2. La tecnica è stata ampiamente applicata per registrare, Na +, K + e Ca 2 + canali 3-8. Durante la registrazione COVG, una membrana dell&#39;oocita-proteina eterologa esprimere è diviso in tre regioni. I dati corrente ionica viene registrata dalla regione superiore del ovocita comebagno circonda la regione superiore è fissata ad un potenziale di comando, che può essere cambiata facilmente e rapidamente. Le guardie regione del Medio contro le correnti di dispersione di essere bloccato allo stesso potenziale come la regione top 9. La regione inferiore è dove apertura ovocita (cut-open) avviene mediante l&#39;utilizzo di una soluzione di saponina o una cannula. Chimica o apertura manuale della membrana nella regione inferiore permette il controllo del potenziale interno, che viene fissato al terreno, e rende l&#39;interno della cellula contigua con la soluzione camera inferiore. Perfusione di soluzioni nella camera inferiore può regolare le proprietà dell&#39;ambiente interno, mentre lo scambio di soluzione nella camera superiore altera l&#39;ambiente esterno. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Ovociti Cut-Open Voltage-Clamp Bath Diagramma di installazione. (A) Topdown vista di tre bagni separati l&#39;uno dall&#39;altro. Le dimensioni delle camere per COVG vengono visualizzati sulla figura. (B) Vista laterale della configurazione bagni in posizione di prova. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . I vantaggi della tecnica COVG includono basso rumore corrente (1 nA a 3 kHz), il controllo della composizione ionica del supporto esterno, la capacità di modulare il supporto interno, risoluzione temporale veloce (20-100 costante msec tempo di decadimento della capacità transitorio), e le registrazioni stabili per diverse ore 9. Gli svantaggi sono che richiede attrezzature specializzate ed è più difficile da eseguire rispetto a due serraggio tensione elettrodo (TEVC) 10. Mentre l&#39;approccio COVG richiede attrezzature altamente specializzate e elementi procedurali complessi, può consentire l&#39;acquisizione di Valudati elettrofisiologici grado. Questi dati, come gating correnti con cinetica veloce e correnti di coda 4, può essere registrata senza alcuni dei problemi associati con altri protocolli tensione di chiusura comprese canale run-down. Piccole modifiche alla configurazione COVG possono consentire l&#39;uso di regolatori di temperatura e morsetto di tensione fluorometria (VCF). L&#39;inclusione di tensione morsetto elementi fluorometria all&#39;interno dell&#39;assembly COVG può aumentare output di dati conferendo la possibilità di monitorare cambiamenti conformazionali proteiche e contemporaneamente la registrazione corrente 11-13.

<table><tbody><tr><td>Soluzione esterna</td><td>Marca</td><td>Numero di catalogo</td><td>[Finale], peso o volume</td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>25mM</td></tr><tr><td>MES Sale di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>90mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Idrossido di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabile (pH fino a 7,4)</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td><td></td>interna</tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>105mM</td></tr><tr><td>MES Sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>10mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabile (pH fino a 7,4)</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td><td></td>depolarizzante</tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>110mM</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>1,5mM</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Cassone</td><td>C021</td><td>0.8mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td><td></td>di pipetta</tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>3M</td></tr><tr><td>Soluzione di saponina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>0.125g</td></tr><tr><td>Interno Soluzione</td><td>Vedi sopra</td><td></td><td>50 ml Soluzione</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>ponte di agar</td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>100 ml di 1 M</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>1,2 g</td></tr><tr><td>MES idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabile (pH fino a 7,4)</td></tr><tr>Prodotti di ricerca <td>Agar granulato</td><td> International</td><td>A20250</td><td>3%</td></tr><tr><td>NMDG Soluzione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>di stoccaggio NMDG, HEPES, MES Soluzione idrato</td><td>vedi sopra</td><td></td><td>40 ml</td></tr><tr><td>di acqua</td><td></td><td></td><td>60 ml</td></tr><tr><td>Nome del materiale/attrezzatura Numero di</td><td>catalogo</td><td>dell'azienda</td><td>Commenti/Descrizione</td></tr><tr><td>Morsetto per ovociti ad alte prestazioni</td><td>Dagan</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati</td><td>Axon CNS</td><td>&nbsp; Oscilloscopio Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix</td><td>TDS 210</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di alimentazione a rack</td><td>APC&nbsp;</td><td>G5</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura del bagno di riscaldamento/raffreddamento</td><td>Dagan</td><td>HCC-100A</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Dell</td><td>Optiplex 990</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.3 Morsetto di tensione Software</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>pCLAMP10.3</td><td></td></tr><tr><td>TMC Controllo delle vibrazioni Piattaforma da tavolo</td><td>TMC</td><td>SERIE</td><td></td>64</tr><tr><td>TMC Controllo delle vibrazioni Tavolo d'aria</td><td>TMC</td><td><a name="RANGE! Serie C10">20&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>V1/I Raccoglitore di dati dell'elettrodo</td><td>Dagan</td> parte del micromanipolatore <td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>MX10L</td><td>Siskiyou</td><td>MX10L</td><td></td></tr><tr><td>Bagno/Guardia (I/V) Headstage (con connettori appropriati)</td><td>Dagan</td><td>parte del microscopio CA-1B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Omano</td><td>OM2300S-JW11</td><td></td></tr><tr><td>Bagno di controllo della temperatura</td><td>personalizzato o Dagan</td><td>personalizzato o Camera personalizzata HE-204C</td><td>realizzata con materiali di Cool Polymers (serie D). Dagan fornisce anche uno stadio pre-feabricato (HE-204C).</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Contenitore per pellet AgCl personalizzato Elettrodo</td> Ag/AgCl <td>personalizzato lavorato su misura</td></tr><tr><td>, pellet, 2,0 mm</td><td>Warner</td><td>E-206</td><td></td></tr><tr><td>Bagno di ovociti esterno</td><td>Personalizzato o Dagan</td><td>personalizzato o CC-1-T-LB</td><td>lavorato su misura o acquistato da Dagan</td></tr><tr><td>Bagno interno di ovociti</td><td>personalizzato o Dagan</td><td>personalizzato o CC-TG-ND</td><td>lavorato su misura o acquistato da Dagan</td></tr><tr><td>Capillari per ponti di agar ed elettrodi tirati</td><td>Warner</td><td>G150T-4</td><td></td></tr><tr><td>Supporti girevoli per microscopio, micromanipolatore e bagno</td><td>Siskiyou</td><td>SD-1280P</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>LMI-600</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina regolare</td><td>Clorox</td><td>470174-764</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis Ovociti</td><td>Nasco</td><td>LM535M (femmine sessualmente mature)</td><td></td></tr><tr><td>90 Na+ Soluzione esterna</td><td>Vedere la scheda</td><td></td><td></td>delle soluzioni</tr><tr><td>10 Na+ Soluzione interna</td><td>Vedere la scheda</td><td></td><td></td>delle soluzioni</tr><tr><td>3 M KCL</td><td>Vedere la scheda</td><td></td><td></td>delle soluzioni</tr> Soluzione di stoccaggio <tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>NMDG Vedere</td><td>la scheda delle soluzioni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento da 5 ml</td><td>SciMart</td><td>GS-52</td><td></td></tr><tr><td>Iniettore di elettrodi KCl modificato</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Punta della siringa in plastica fusa per consentire l'iniezione della soluzione negli elettrodi. In alternativa è possibile acquistare un Microfil di WPI.</td></tr><tr><td>Microvaccum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom Custom Pinze</td><td>VWR</td><td>63040-458</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti per la manipolazione degli ovociti (pompa per pipette)</td><td>VWR</td><td>53502-222</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia di acqua deionizzata</td><td>VWR</td><td>16649-911</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina Vaselina Vaselina</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Materiali aggiuntivi necessari per le registrazioni VCF:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Microscopio VCF</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon CFI APO 40XW Obiettivo NIR</td><td>Nikon</td><td>N40X-NIR</td><td></td></tr><tr><td>X-Y Sistema di traslazione per microscopi verticali a stadio fisso</td><td>Sutter Instruments</td><td>MT500-586</td><td></td></tr><tr><td>Bagno di ovociti VCF esterno</td><td>personalizzato</td><td></td><td>Lavorato su misura. Le dimensioni della camera sono 2,7 x 1,9 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Bagno di ovociti VCF interno</td> lavorato <td>su misura</td><td></td><td>. Le dimensioni della camera sono 1,6 x 1,6 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Bagno di controllo della temperatura modificato Camera</td><td></td><td></td><td>personalizzata realizzata con materiali di Cool Polymers (serie D). Le dimensioni della camera del bagno del regolatore di temperatura modificato sono 2,7 x 1,9 x 0,3 cm per la camera orizzontale e 1 x 2,5 x 0,5 cm per la camera verticale.</td></tr></tbody></table>

il<em&gt; xenopus</em&gt; ovociti cut-open vaselina gap tecnica voltage-clamp con fluorometria

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

L&#39;ovocita vaselina gap cut-open (COVG) clamp di tensione permette l&#39;analisi delle proprietà elettrofisiologiche e cinetiche dei canali ionici eterologa in oociti. Registrazioni dalla configurazione cut-open sono particolarmente utili per risolvere basse correnti di magnitudo gating, rapida attivazione corrente ionica e disattivazione. I principali vantaggi rispetto al morsetto di tensione a due elettrodi (TEVC) tecnica includono maggiore velocità morsetto, miglior rapporto segnale-rumore, e la capacità di modulare la intracellulare ed extracellulare. Qui, impieghiamo canale del sodio cardiaco umano (HNA 1,5 V), espresso in oociti di Xenopus, per dimostrare la configurazione e protocollo cut-open nonché modifiche necessarie per aggiungere capacità fluorometria morsetto di tensione. Le proprietà dei canali ionici veloci attivanti, come HNA 1,5 V, non possono essere completamente risolti a temperatura ambiente usando TEVC, in which la totalità della membrana dell&#39;oocita è serrato, rendendo difficile il controllo della tensione. Tuttavia, nella tecnica cut-aperto, separazione di solo una piccola porzione della membrana cellulare consente il bloccaggio rapido necessaria per registrare accuratamente cinetica veloce evitando canale run-down associato a tecniche di patch clamp. In concomitanza con la tecnica COVG, cinetica del canale ionico e proprietà elettrofisiologiche possono essere ulteriormente analizzati mediante morsetto fluorometria tensione, in cui il movimento proteina viene monitorato tramite cisteina coniugazione di fluorofori applicate extracellulare, inserimento di proteine ​​fluorescenti geneticamente codificati, o l&#39;incorporazione di amminoacidi non naturali nella regione di interesse 1. Questi dati aggiuntivi produce informazioni cinetiche su voltaggio-dipendenti riarrangiamenti conformazionali della proteina attraverso cambiamenti nel microambiente circostante la molecola fluorescente.

Figura 4 mostra la variazione di permeabilità del ovocita come soluzione saponina viene applicata alla parte inferiore della ovocita. Figura 5 mostra il tasso di conversione soluzione intracellulare per diffusione seguente permeabilizzazione saponina. 20-40 min sono tenuti a venire a uno stato stazionario 2,18. Figura 6A mostra tracce generate dal protocollo di registrazione. La figura mostra correnti ioniche (dopo P/-8 perdita so...

L&#39;approccio gap vaselina cut-aperto viene utilizzato per ottenere bassi registrazioni sonore di correnti ioniche e gating di canali ionici voltaggio-dipendenti espressi in oociti di Xenopus con alta risoluzione di canale cinetiche veloci. Con piccola modifica, morsetto di tensione fluorometria può essere accoppiato al protocollo ovocita cut-open.

Il<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere registrazioni a basso rumore di correnti ioniche e di correnti di attivazione da canali ionici attivati da voltaggio espressi in cellule zap, con elevata risoluzione temporale della cinetica rapida del canale. Questo risultato si ottiene innanzitutto iniettando l'mRNA del canale ionico registrato negli oociti di rana. Il secondo passaggio consiste nella creazione di ponti di agar, modellando i tubi capillari e successivamente riempiendoli con una soluzione di agar contenente sali.Successivamente, il preparato aperto viene preparato per l'esperimento posizionando tutti i componenti, inclusi il sito UO e i ponti di agarosio, nelle rispettive posizioni. L'ultimo passaggio consiste nell'inserire l'elettrodo microscopico nel sito UO per consentire registrazioni in voltage clamp. Infine, il protocollo di registrazione viene utilizzato per mostrare le correnti ioniche provenienti dai canali ionici localizzati nella membrana dell'oocita.Il principale vantaggio della tecnica del voltage clamp con preparazione aperta è che consente registrazioni stabili con basso rumore di una popolazione molto ampia di canali ionici. Permette inoltre una rapida risoluzione della cinetica dei canali. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché alcuni passaggi, come il posizionamento del sito O, della camera superiore e dei ponti di agarosio, sono difficili da apprendere.In questo procedimento, preparare almeno sei ponti di agar riscaldando un'estremità di un capillare in vetro borosilicato con una fiamma media. Per ciascuno di essi, assicurarsi che l'estremità del capillare si trovi nella parte superiore della fiamma blu.Dopo che il tubo capillare si è riscaldato, utilizzare la pinzetta per eseguire una piega di 90 gradi. Il punto di piegatura deve presentare una curvatura uniforme piuttosto che un angolo brusco, altrimenti potrebbe ridurre in modo significativo il diametro interno del vetro, rendendo più difficile il riempimento e aumentando la resistenza del ponte. Successivamente, riscaldare il tubo capillare a circa 25 millimetri dall'estremità non piegata.Eseguire una seconda piegatura di 90 gradi in questo punto, nella stessa direzione della prima piegatura. Dopo che i tubi capillari si sono raffreddati, utilizzare un tagliavetro con punta di diamante per tagliare le estremità del ponte a circa cinque millimetri. Successivamente, inserire fili di platino nei tubi capillari dei tre ponti di alimentazione.Tagliare il filo di platino in eccesso in modo che non ci sia alcun filo esposto all'esterno del tubo. Spingere ulteriormente il filo di platino all'interno del tubo capillare con uno strumento dalla punta fine, in modo che il filo sia un millimetro più corto del vetro su entrambe le estremità del tubo capillare. Aggiungere quindi i ponti capillari uno alla volta a una soluzione di agar preparata in precedenza, con le estremità rivolte verso l'alto.Una volta eliminate le bolle d'aria o le sacche nei ponti, recuperare i ponti dalla soluzione di agar e posizionarli su un tovagliolo di carta per farli asciugare. In alternativa, riempire i ponti spingendo la soluzione di agar attraverso una siringa collegata a una punta di pipetta piccola. Successivamente, preparare il dispositivo aperto sotto un microscopio stereoscopico applicando una piccola quantità di vaselina lungo il bordo del foro sulla faccia superiore della camera centrale e sulla faccia inferiore della camera superiore, utilizzando un oggetto con una punta molto fine.Quindi aggiungere una soluzione tre molare di cloruro di potassio negli alloggiamenti del collettore contenenti pastiglie di argento, cloruro di argento. In questo passaggio, installare la camera superiore senza un sito UO. Spostare la camera superiore fuori centro in modo che i fori nelle due camere non si sovrappongano.Quindi riempire tutte le camere con la soluzione esterna e posizionare tutti i ponti nelle rispettive camere. Successivamente, assicurarsi che il comando esterno e entrambe le pinze siano spenti. Verificare la lettura della corrente sull'amplificatore e regolare l'impostazione P sul retro della testa del bagnoguida per azzerare la corrente, utilizzando un piccolo cacciavite.Successivamente, posizionare l'interruttore della guardia del bagno sull'amplificatore su attivo. Quindi regolare l'offset GS sulla testa dello stadio della guardia del bagno per ottenere una corrente nulla utilizzando un piccolo cacciavite; ripetere alternando tra attivo e passivo fino a quando entrambi i valori non saranno ragionevolmente vicini allo zero. Successivamente, rimuovere le estremità del ponte di agar e la camera superiore.Trasferire un sito UO nella camera centrale del bagno utilizzando una pompa per pipetta, assicurandosi che il sito UO sia posizionato sopra il foro al centro del bagno. Successivamente, rimuovere la soluzione esterna in eccesso dalla parte inferiore del bagno mediante una pompa per pipetta, in modo da creare un sigillo tra il sito UO e la superficie del bagno. Ora, posizionare la camera superiore del bagno sopra il sito UO in modo che il foro della camera sia centrato sulla parte superiore del sito UO.Utilizzando il pollice, il dito medio e delle pinzette, applicare lentamente pressione verso il basso sulla camera finché non sarà premuta saldamente contro l'oocita, in modo da esporre solo una piccola porzione della membrana al bagno superiore attraverso il foro. Successivamente, aggiungere la soluzione esterna ai bagni superiore e inferiore fino a quando non saranno quasi pieni. Quindi posizionare le estremità libere dei ponti di agar nella soluzione esterna di ciascun bagno. Assicurarsi che ciascun ponte sia collocato nella corretta posizione del rispettivo bagno.Avviare un protocollo di prova nel software di registrazione e verificare che lo spostamento verticale della sezione orizzontale compresa tra i due picchi dell'impulso di prova sia inferiore o uguale a 100 nanoampere. Se la sezione orizzontale mostra uno spostamento verticale superiore a 100 nanoampere, come illustrato, aumentare la pressione della camera superiore sulla cella. Successivamente, impostare l'interruttore del guardia bagno sull'amplificatore su attivo.Successivamente, rimuovere la soluzione esterna nel bagno inferiore e sostituirla con la soluzione di saponina. Dopo aver aggiunto la soluzione di saponina, osservare l'impulso di prova ripetuto sul monitor del computer. Se il picco del protocollo di prova si riduce o scompare, ciò indica la presenza di una bolla al di sotto.La cellula in questo caso ha completamente sostituito la soluzione di saponina. Con una nuova soluzione di saponina, la cellula è stata resa permeabile. Quando la pendenza discendente dell'impulso di corrente nel protocollo di prova diminuisce.Una volta rimossa la cellula, eliminare la soluzione di saponina e riempire la camera con la soluzione interna. Quindi arrestare il protocollo di prova. Successivamente, verificare la presenza di eventuali contatti tra le soluzioni nelle diverse camere e la cristallizzazione di cloruro di potassio tra i pozzetti del collettore, poiché questi possono causare cortocircuiti e comportamenti irregolari.Se è presente una soluzione, mediante contatto tra le camere asportare le soluzioni in eccesso dalle due camere. Per il cloruro di potassio cristallizzato, utilizzare la bottiglia a spruzzo per rimuovere il cloruro di potassio cristallizzato, quindi asportare l'acqua residua.Quindi utilizzare una siringa modificata per iniettare cloruro di potassio tre molare in un microelettrodo. Agitare più volte il microelettrodo. Ora, montare l'elettrodo riempito di cloruro di potassio sul braccio del micromanipolatore inserendo il filamento metallico nell'estremità aperta del microelettrodo.Inserire l'estremit&agrave; del microelettrodo nel supporto del filamento e verificare che l'elettrodo non sia allentato. Successivamente, serrare il fermo dell'elettrodo. Poi posizionare il braccio del micromanipolatore sopra le bacinelle per i citi e serrare le morse per impedire ulteriori movimenti del braccio.Abbassi l'elettrodo fino a quando la punta dell'elettrodo tocca appena la superficie del liquido nel bagno. Premere il pulsante V uno sul clamp di tensione della cellula, quindi regolare la manopola di compensazione di V uno per ridurre la tensione di V uno a zero. Eseguire la stessa regolazione per V due.La differenza di potenziale V uno meno V due deve indicare zero millivolt sul display del voltage clamp. Successivamente, continuare ad abbassare l'elettrodo verso la macchia visibile del sito UO nel bagno superiore osservando attraverso il microscopio. Una volta che l'elettrodo microscopico è molto vicino al sito UO, osservare l'indicazione di V uno meno V due per vedere quando l'elettrodo entra nel sito uoc.La tensione V uno meno V due diventerà negativa quando l'elettrodo microscopico entra nella cellula. A questo punto, aprire il protocollo di acquisizione dati nel software di registrazione. Posizionare l'interruttore di blocco sull'amplificatore di tensione del sito uoc sulla posizione di accensione.Successivamente, regolare il potenziale in modo che corrisponda al comando, agendo sulla manopola situata sullo stadio della testa I. Quindi iniziare a registrare le correnti avviando il protocollo di registrazione dei dati. Di seguito sono riportati i tracciati degli impulsi di prova selezionati.Durante la permeabilità dell'ovocita, l'aumento della costante di tempo del decadimento osservato nei tracciati dimostra un incremento della permeabilità dell'ovocita. Questa figura mostra i risultati ottenuti con il canale del sodio di tipo selvaggio mediante tecnica di voltage clamping con cellula aperta. Di seguito sono riportati i tracciati della corrente registrata in risposta a diversi stimoli di tensione.La curva tensione-corrente mostrata qui rappresenta la dipendenza della corrente di picco dalla tensione. Quando si utilizza questa tecnica, è importante ricordare di spegnere il clamp di tensione prima di entrare nella cellula e di spegnerlo nuovamente prima di uscire dalla cellula. Il mancato rispetto di questa procedura può causare danni ai ponti di argento e probabilmente sarà necessario sostituirli.

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