Il Xenopus Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere registrazioni a basso rumore di correnti ioniche e di gating da canali ionici voltaggio-dipendenti espressi in citi zap con alta risoluzione temporale della cinetica del canale veloce. Ciò si ottiene iniettando prima l'mRNA del canale ionico registrato negli ovociti della rana. Il secondo passo consiste nel creare ponti di agar modellando il tubo capillare e quindi riempiendo il tubo con una soluzione di sale contenente agar.

Successivamente, il carro aperto viene preparato per la sperimentazione posizionando tutti i componenti, compreso il sito UO e i ponti di agar, in posizioni designate. Il passaggio finale consiste nell'inserire il microelettrodo nel sito UO per consentire le registrazioni del morsetto di tensione. In definitiva, il protocollo di registrazione viene utilizzato per mostrare le correnti ioniche provenienti dai canali ionici situati nella membrana dell'ovocita.

Il vantaggio principale della tecnica del morsetto di tensione a taglio aperto è che consente registrazioni stabili a basso rumore di una popolazione molto ampia di canali ionici. Consente inoltre una rapida risoluzione della cinetica del canale. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto alcuni passaggi come il posizionamento del sito O, la camera superiore e i ponti di agar sono difficili da imparare.

In questa procedura, realizzare almeno sei ponti di agar riscaldando un'estremità di un tubo capillare di silicato di boro a fuoco medio. Per ognuno di loro. Assicurarsi che l'estremità del tubo capillare si trovi nella parte superiore della fiamma blu.

Una volta che il tubo capillare si è riscaldato, utilizzare la pinza per eseguire una curva di 90 gradi. Il sito di curvatura dovrebbe avere una curvatura regolare piuttosto che un angolo brusco, altrimenti potrebbe ridurre significativamente il diametro interno del vetro, il che rende più difficile il riempimento e aumenta la resistenza del ponte. Successivamente, riscaldare il tubo capillare a circa 25 millimetri dall'estremità non piegata.

Eseguire una seconda curva a 90 gradi in questa posizione nella stessa direzione della prima piega. Dopo che i tubi capillari si sono raffreddati, utilizzare un tagliavetro con punta di diamante per tagliare le gambe del ponte a circa cinque millimetri. Quindi, inserire i fili di platino nei tubi capillari dei tre ponti di alimentazione della corrente.

Tagliare il filo di platino in eccesso in modo che non vi siano fili esposti all'esterno del tubo. Spingere ulteriormente il filo di platino nel tubo capillare con un attrezzo a punta fine in modo che il filo sia più corto di un millimetro rispetto al vetro su entrambe le estremità del tubo capillare. Quindi aggiungere i ponti capillari uno alla volta a una soluzione di agar preconfezionata con le gambe rivolte verso l'alto.

Una volta che non ci sono bolle d'aria o sacche nei ponti, recupera i ponti dalla soluzione di agar e posiziona i ponti su un tovagliolo di carta ad asciugare. In alternativa, riempire i ponti spingendo la soluzione di agar attraverso una siringa collegata a un piccolo puntale di pipetta. Successivamente, preparare il rig tagliato aperto al microscopio da dissezione applicando una piccola quantità di vaselina attorno al bordo del foro sul lato superiore della camera centrale e sul lato inferiore della camera superiore con un oggetto con punta molto fine.

Quindi a tre molari soluzione di cloruro di potassio nelle fessure del collettore che contengono argento, pellet di cloruro d'argento. In questo passaggio, installare la camera superiore senza un sito UO. Far scorrere la camera superiore fuori centro in modo che i fori nelle due camere non si sovrappongano.

Quindi riempire tutte le camere con soluzione esterna e posizionare tutti i ponti nelle rispettive camere. Successivamente, assicurati che il comando esterno ed entrambi i morsetti siano disattivati. Controllare la lettura della corrente sull'amplificatore e regolare la P impostata sul retro dello stadio della testa di protezione del bagno a corrente zero con un piccolo cacciavite.

Successivamente, attivare l'interruttore di protezione del bagno sull'amplificatore. Quindi regolare l'offset GS sullo stadio della testa di protezione del bagno per ottenere corrente zero con un piccolo cacciavite, ripetere tra attivo e passivo fino a quando entrambi non sono ragionevolmente vicini allo zero. Quindi, rimuovere le estremità del ponte di agar e la camera superiore.

Trasferire un sito UO nella camera centrale del bagno utilizzando una pompa per pipette, assicurarsi che il sito UO sia posizionato sopra il foro al centro del bagno. Quindi rimuovere la soluzione esterna in eccesso dal bagno inferiore utilizzando una pompa a pipetta per creare una tenuta tra il sito UO e la superficie del bagno. Ora, posiziona la camera da bagno superiore sopra il sito UO in modo che il foro nella camera sia centrato sopra il sito UO.

Usando un pollice, il dito medio e una pinzetta, applicare lentamente una pressione sulla camera fino a quando non viene premuta saldamente contro l'ovocita per esporre solo una piccola parte della membrana al bagno superiore attraverso il foro, quindi aggiungere una soluzione esterna ai bagni superiore e inferiore fino a quando non sono quasi pieni. Quindi posizionare le gambe libere dei ponti di agar nella soluzione esterna di ogni bagno. Assicurarsi che ogni ponte poggi nella posizione corretta della vasca.

Avviare un protocollo di test nel software di registrazione, verificare che lo spostamento verticale della sezione orizzontale tra i due picchi dell'impulso di test sia inferiore o uguale a 100 nano ampere. Se la sezione orizzontale mostra uno spostamento verticale superiore a 100 nano ampere come mostrato, aumentare la tenuta della camera superiore sul cito. Successivamente, attivare l'interruttore di protezione del bagno sull'amplificatore.

Quindi, rimuovere la soluzione esterna nel bagno inferiore e sostituirla con una soluzione di saponina. Dopo che la soluzione di saponina è stata aggiunta, osservare l'impulso di prova ripetuto sul monitor del computer. Se il picco del protocollo di test si riduce o scompare, indica che c'è una bolla sottostante.

Il cita in questo caso ha sostituito completamente la soluzione di saponina. Con la nuova soluzione di saponina, il cita è stato permeato. Quando la pendenza discendente del picco di corrente nel protocollo di test diminuisce.

Una volta che la cella è rimossa la soluzione di saponina e riempire il bagno con la soluzione interna. Quindi interrompere il protocollo di test. Successivamente, verificare la presenza di eventuali contatti tra le soluzioni in bagni diversi e cristallizzare il cloruro di potassio tra i pozzetti del collettore in quanto ciò può causare cortocircuiti e comportamenti irregolari.

Se c'è soluzione, il contatto tra i bagni aspira le soluzioni in eccesso dai due bagni. Per cloruro di potassio cristallizzato. Usa il flacone a spruzzo per lavare via il cloruro di potassio cristallizzato e poi aspirare l'acqua rimanente.

Quindi utilizzare una siringa modificata per iniettare tre molari di cloruro di potassio in un microelettrodo. Muovere più volte il microelettrodo. Ora, montare l'elettrodo riempito di cloruro di potassio sul braccio del micromanipolatore inserendo il filamento del filo nell'estremità aperta del microelettrodo.

Spingere l'estremità del microelettrodo nel supporto del filamento e assicurarsi che l'elettrodo non sia allentato. Successivamente, serrare il dispositivo di fissaggio dell'elettrodo. Quindi ruotare il braccio del micromanipolatore in posizione sopra i bagni di citi e serrare i morsetti per evitare ulteriori movimenti del braccio.

Abbassare l'elettrodo fino a quando la punta dell'elettrodo non rompe appena la superficie del liquido nel bagno. Premere il pulsante V one sul cyte voltage clamp e quindi regolare la manopola di offset V one per ridurre la tensione V one a zero. Eseguire la stessa regolazione per V due.

La differenza di potenziale V uno meno V due dovrebbe indicare zero millivolt sul display della pinza di tensione. Dopodiché, continuare ad abbassare l'elettrodo verso la zona visibile del sito UO nel bagno superiore mentre si guarda attraverso il microscopio. Una volta che il micro elettrodo è molto vicino al sito UO, osservare la lettura V uno meno V due per vedere quando l'elettrodo entra nel sito UOC.

La tensione V uno meno V due diventerà negativa quando il microelettrodo entra nella cella. A questo punto, aprire il protocollo di raccolta dati nel software di registrazione. Spostare l'interruttore a morsetto sul sito uoc voltage clamp amplifier sull'impostazione on.

Quindi, regolare il potenziale in modo che corrisponda al comando regolando la manopola situata sullo stadio di testa I. Quindi iniziare a registrare le correnti avviando il protocollo di registrazione dei dati. Di seguito sono riportate le tracce degli impulsi di prova selezionate.

Durante la permeabilità agli ovociti, l'aumento della costante di tempo di decadimento osservata nelle tracce dimostra un aumento della permeabilità agli ovociti. Questa figura mostra i risultati del canale del sodio di tipo selvaggio dal bloccaggio della tensione aperta tagliata. Ecco le tracce di corrente registrata da diversi stimoli di tensione.

La curva di tensione di corrente mostrata qui rappresenta la dipendenza dalla tensione della corrente di picco. Durante il tentativo di questa tecnica, è importante ricordare di avere la pinza di tensione spenta prima di entrare nella cella e di spegnere la pinza di tensione prima di uscire dalla cella. In caso contrario, i ponti agricoli possono essere danneggiati e probabilmente dovranno essere sostituiti.