Name: Il Xenopus Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Impara la tecnica cut-open Vaseline gap per registrare correnti ioniche a basso rumore in oociti di Xenopus. Questo metodo elettrofisiologico offe alta risoluzione temporale per studiare la cinetica dei canali ionici.

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Tutti i membri della Washington University di St. Louis Cardiac molecolare Engineering Lab. Un Burroughs Welcome Fondo Premio alla Carriera al Interface scientifico - 1010299 (JS).

<ol><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+KV+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).</li>
<li>Stefani, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut-open+oocyte+voltage-clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cut-open oocyte voltage-clamp technique.</a> Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).</li>
<li>Muroi, Y., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+anesthetics+disrupt+energetic+coupling+between+the+voltage-sensing+segments+of+a+sodium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel.</a> J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).</li>
<li>Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+Shaker+K%2B+channels%3A+I.+Ionic+and+gating+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents.</a> Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).</li>
<li>Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+the+activation+and+inactivation+kinetics+of+HERG+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiolt%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).</li>
<li>Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+active+calcium+channel+beta%281b%29+-subunit+by+size-exclusion+chromatography+and+its+role+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function.</a> J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).</li>
<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+I%3A+wild-type+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Na%28V%291.4.+J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle.</a> Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).</li>
<li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+II%3A+a+periodic+paralysis+mutation+in+Na%28V%291.4+%28L689I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I).</a> J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).</li>
<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
<li>Clare, J. J., Trezise, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClare%2C+JJ+%22Expression+and+analysis+of+recombinant+ion+channels+%3A+from+structural+studies+to+pharmacological+screening%22">Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening</a>. , Wiley-VCH. (2006).</li>
<li>Susan, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCha%2C+A+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 296, Academic Press. 566-578 (1998).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy.+3rd+edn%22">Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K%2B+channel+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li>
<li>Richards, R., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+conformational+dynamics+of+membrane+proteins+in+situ+with+site-directed+fluorescence+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
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 <a target="_blank" href="http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf">http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf</a> (1999).</li>
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<li>Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+disulfide+bridge+linking+the+fourth+and+the+seventh+extracellular+loops+of+the+Na%2B%2Fglucose+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter.</a> J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).</li>
<li>Pantazis, A., Olcese, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPantazis%2C+A+%22Cut-Open+Oocyte+Voltage-Clamp+Technique.+In%3A+Roberts+G.+%28Ed.%29+Encyclopedia+of+Biophysics%3A+SpringerReference%22">Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference</a>. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;ovocita vaselina tensione gap clamp cut-open consente una rapida risoluzione dei dati, a basso rumore, aumentato il controllo sulla soluzione interna e la composizione soluzione esterna, e registrazioni stabili nel relativamente lunghi protocolli 19. Questi vantaggi impostate questa tecnica a parte il voltage clamp a due elettrodi standard e le tecniche di patch clamp. Sebbene attrezzature specializzate è necessaria e il protocollo è relativamente difficile, molto pochi problemi si verificano quando il ...

Tecniche tensione di serraggio specializzati permettono la registrazione di correnti ioniche a potenziali di membrana controllate. Ampiamente usato voltage clamp a due elettrodi (TEVC) e tecniche di patch clamp forniscono informazioni elettrofisiologiche attendibili sulle proprietà di molti canali ionici. Tuttavia, entrambi questi metodi hanno inconvenienti che impediscono l&#39;acquisizione di dati affidabili per i canali del sodio voltaggio-dipendenti veloci e altri canali attivanti veloce nelle membrane come quelle di ovociti di Xenopus. I laboratori Bezanilla e Stefani quindi sviluppato la tecnica del clamp di tensione gap vaselina cut-open (COVG) per ovociti 2. La tecnica è stata ampiamente applicata per registrare, Na +, K + e Ca 2 + canali 3-8. Durante la registrazione COVG, una membrana dell&#39;oocita-proteina eterologa esprimere è diviso in tre regioni. I dati corrente ionica viene registrata dalla regione superiore del ovocita comebagno circonda la regione superiore è fissata ad un potenziale di comando, che può essere cambiata facilmente e rapidamente. Le guardie regione del Medio contro le correnti di dispersione di essere bloccato allo stesso potenziale come la regione top 9. La regione inferiore è dove apertura ovocita (cut-open) avviene mediante l&#39;utilizzo di una soluzione di saponina o una cannula. Chimica o apertura manuale della membrana nella regione inferiore permette il controllo del potenziale interno, che viene fissato al terreno, e rende l&#39;interno della cellula contigua con la soluzione camera inferiore. Perfusione di soluzioni nella camera inferiore può regolare le proprietà dell&#39;ambiente interno, mentre lo scambio di soluzione nella camera superiore altera l&#39;ambiente esterno. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Ovociti Cut-Open Voltage-Clamp Bath Diagramma di installazione. (A) Topdown vista di tre bagni separati l&#39;uno dall&#39;altro. Le dimensioni delle camere per COVG vengono visualizzati sulla figura. (B) Vista laterale della configurazione bagni in posizione di prova. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . I vantaggi della tecnica COVG includono basso rumore corrente (1 nA a 3 kHz), il controllo della composizione ionica del supporto esterno, la capacità di modulare il supporto interno, risoluzione temporale veloce (20-100 costante msec tempo di decadimento della capacità transitorio), e le registrazioni stabili per diverse ore 9. Gli svantaggi sono che richiede attrezzature specializzate ed è più difficile da eseguire rispetto a due serraggio tensione elettrodo (TEVC) 10. Mentre l&#39;approccio COVG richiede attrezzature altamente specializzate e elementi procedurali complessi, può consentire l&#39;acquisizione di Valudati elettrofisiologici grado. Questi dati, come gating correnti con cinetica veloce e correnti di coda 4, può essere registrata senza alcuni dei problemi associati con altri protocolli tensione di chiusura comprese canale run-down. Piccole modifiche alla configurazione COVG possono consentire l&#39;uso di regolatori di temperatura e morsetto di tensione fluorometria (VCF). L&#39;inclusione di tensione morsetto elementi fluorometria all&#39;interno dell&#39;assembly COVG può aumentare output di dati conferendo la possibilità di monitorare cambiamenti conformazionali proteiche e contemporaneamente la registrazione corrente 11-13.

<table><tbody><tr><td>Soluzione esterna</td><td>Marca</td><td>Numero di catalogo</td><td>[Finale], peso o volume</td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>25mM</td></tr><tr><td>MES Sale di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>90mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Idrossido di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabile (pH fino a 7,4)</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td><td></td>interna</tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>105mM</td></tr><tr><td>MES Sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>10mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabile (pH fino a 7,4)</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td><td></td>depolarizzante</tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>110mM</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>1,5mM</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Cassone</td><td>C021</td><td>0.8mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td><td></td>di pipetta</tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>3M</td></tr><tr><td>Soluzione di saponina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>0.125g</td></tr><tr><td>Interno Soluzione</td><td>Vedi sopra</td><td></td><td>50 ml Soluzione</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>ponte di agar</td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>100 ml di 1 M</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>1,2 g</td></tr><tr><td>MES idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variabile (pH fino a 7,4)</td></tr><tr>Prodotti di ricerca <td>Agar granulato</td><td> International</td><td>A20250</td><td>3%</td></tr><tr><td>NMDG Soluzione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>di stoccaggio NMDG, HEPES, MES Soluzione idrato</td><td>vedi sopra</td><td></td><td>40 ml</td></tr><tr><td>di acqua</td><td></td><td></td><td>60 ml</td></tr><tr><td>Nome del materiale/attrezzatura Numero di</td><td>catalogo</td><td>dell'azienda</td><td>Commenti/Descrizione</td></tr><tr><td>Morsetto per ovociti ad alte prestazioni</td><td>Dagan</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati</td><td>Axon CNS</td><td>&nbsp; Oscilloscopio Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix</td><td>TDS 210</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di alimentazione a rack</td><td>APC&nbsp;</td><td>G5</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura del bagno di riscaldamento/raffreddamento</td><td>Dagan</td><td>HCC-100A</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Dell</td><td>Optiplex 990</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.3 Morsetto di tensione Software</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>pCLAMP10.3</td><td></td></tr><tr><td>TMC Controllo delle vibrazioni Piattaforma da tavolo</td><td>TMC</td><td>SERIE</td><td></td>64</tr><tr><td>TMC Controllo delle vibrazioni Tavolo d'aria</td><td>TMC</td><td><a name="RANGE! Serie C10">20&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>V1/I Raccoglitore di dati dell'elettrodo</td><td>Dagan</td> parte del micromanipolatore <td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>MX10L</td><td>Siskiyou</td><td>MX10L</td><td></td></tr><tr><td>Bagno/Guardia (I/V) Headstage (con connettori appropriati)</td><td>Dagan</td><td>parte del microscopio CA-1B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Omano</td><td>OM2300S-JW11</td><td></td></tr><tr><td>Bagno di controllo della temperatura</td><td>personalizzato o Dagan</td><td>personalizzato o Camera personalizzata HE-204C</td><td>realizzata con materiali di Cool Polymers (serie D). Dagan fornisce anche uno stadio pre-feabricato (HE-204C).</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Contenitore per pellet AgCl personalizzato Elettrodo</td> Ag/AgCl <td>personalizzato lavorato su misura</td></tr><tr><td>, pellet, 2,0 mm</td><td>Warner</td><td>E-206</td><td></td></tr><tr><td>Bagno di ovociti esterno</td><td>Personalizzato o Dagan</td><td>personalizzato o CC-1-T-LB</td><td>lavorato su misura o acquistato da Dagan</td></tr><tr><td>Bagno interno di ovociti</td><td>personalizzato o Dagan</td><td>personalizzato o CC-TG-ND</td><td>lavorato su misura o acquistato da Dagan</td></tr><tr><td>Capillari per ponti di agar ed elettrodi tirati</td><td>Warner</td><td>G150T-4</td><td></td></tr><tr><td>Supporti girevoli per microscopio, micromanipolatore e bagno</td><td>Siskiyou</td><td>SD-1280P</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>LMI-600</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina regolare</td><td>Clorox</td><td>470174-764</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis Ovociti</td><td>Nasco</td><td>LM535M (femmine sessualmente mature)</td><td></td></tr><tr><td>90 Na+ Soluzione esterna</td><td>Vedere la scheda</td><td></td><td></td>delle soluzioni</tr><tr><td>10 Na+ Soluzione interna</td><td>Vedere la scheda</td><td></td><td></td>delle soluzioni</tr><tr><td>3 M KCL</td><td>Vedere la scheda</td><td></td><td></td>delle soluzioni</tr> Soluzione di stoccaggio <tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>NMDG Vedere</td><td>la scheda delle soluzioni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento da 5 ml</td><td>SciMart</td><td>GS-52</td><td></td></tr><tr><td>Iniettore di elettrodi KCl modificato</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Punta della siringa in plastica fusa per consentire l'iniezione della soluzione negli elettrodi. In alternativa è possibile acquistare un Microfil di WPI.</td></tr><tr><td>Microvaccum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom Custom Pinze</td><td>VWR</td><td>63040-458</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti per la manipolazione degli ovociti (pompa per pipette)</td><td>VWR</td><td>53502-222</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia di acqua deionizzata</td><td>VWR</td><td>16649-911</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina Vaselina Vaselina</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Materiali aggiuntivi necessari per le registrazioni VCF:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Microscopio VCF</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon CFI APO 40XW Obiettivo NIR</td><td>Nikon</td><td>N40X-NIR</td><td></td></tr><tr><td>X-Y Sistema di traslazione per microscopi verticali a stadio fisso</td><td>Sutter Instruments</td><td>MT500-586</td><td></td></tr><tr><td>Bagno di ovociti VCF esterno</td><td>personalizzato</td><td></td><td>Lavorato su misura. Le dimensioni della camera sono 2,7 x 1,9 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Bagno di ovociti VCF interno</td> lavorato <td>su misura</td><td></td><td>. Le dimensioni della camera sono 1,6 x 1,6 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Bagno di controllo della temperatura modificato Camera</td><td></td><td></td><td>personalizzata realizzata con materiali di Cool Polymers (serie D). Le dimensioni della camera del bagno del regolatore di temperatura modificato sono 2,7 x 1,9 x 0,3 cm per la camera orizzontale e 1 x 2,5 x 0,5 cm per la camera verticale.</td></tr></tbody></table>

il<em&gt; xenopus</em&gt; ovociti cut-open vaselina gap tecnica voltage-clamp con fluorometria

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

L&#39;ovocita vaselina gap cut-open (COVG) clamp di tensione permette l&#39;analisi delle proprietà elettrofisiologiche e cinetiche dei canali ionici eterologa in oociti. Registrazioni dalla configurazione cut-open sono particolarmente utili per risolvere basse correnti di magnitudo gating, rapida attivazione corrente ionica e disattivazione. I principali vantaggi rispetto al morsetto di tensione a due elettrodi (TEVC) tecnica includono maggiore velocità morsetto, miglior rapporto segnale-rumore, e la capacità di modulare la intracellulare ed extracellulare. Qui, impieghiamo canale del sodio cardiaco umano (HNA 1,5 V), espresso in oociti di Xenopus, per dimostrare la configurazione e protocollo cut-open nonché modifiche necessarie per aggiungere capacità fluorometria morsetto di tensione. Le proprietà dei canali ionici veloci attivanti, come HNA 1,5 V, non possono essere completamente risolti a temperatura ambiente usando TEVC, in which la totalità della membrana dell&#39;oocita è serrato, rendendo difficile il controllo della tensione. Tuttavia, nella tecnica cut-aperto, separazione di solo una piccola porzione della membrana cellulare consente il bloccaggio rapido necessaria per registrare accuratamente cinetica veloce evitando canale run-down associato a tecniche di patch clamp. In concomitanza con la tecnica COVG, cinetica del canale ionico e proprietà elettrofisiologiche possono essere ulteriormente analizzati mediante morsetto fluorometria tensione, in cui il movimento proteina viene monitorato tramite cisteina coniugazione di fluorofori applicate extracellulare, inserimento di proteine ​​fluorescenti geneticamente codificati, o l&#39;incorporazione di amminoacidi non naturali nella regione di interesse 1. Questi dati aggiuntivi produce informazioni cinetiche su voltaggio-dipendenti riarrangiamenti conformazionali della proteina attraverso cambiamenti nel microambiente circostante la molecola fluorescente.

Figura 4 mostra la variazione di permeabilità del ovocita come soluzione saponina viene applicata alla parte inferiore della ovocita. Figura 5 mostra il tasso di conversione soluzione intracellulare per diffusione seguente permeabilizzazione saponina. 20-40 min sono tenuti a venire a uno stato stazionario 2,18. Figura 6A mostra tracce generate dal protocollo di registrazione. La figura mostra correnti ioniche (dopo P/-8 perdita so...

L&#39;approccio gap vaselina cut-aperto viene utilizzato per ottenere bassi registrazioni sonore di correnti ioniche e gating di canali ionici voltaggio-dipendenti espressi in oociti di Xenopus con alta risoluzione di canale cinetiche veloci. Con piccola modifica, morsetto di tensione fluorometria può essere accoppiato al protocollo ovocita cut-open.

Il<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere registrazioni a basso rumore di correnti ioniche e di correnti di attivazione da canali ionici attivati da voltaggio espressi in cellule zap, con elevata risoluzione temporale della cinetica rapida del canale. Questo risultato si ottiene innanzitutto iniettando l'mRNA del canale ionico registrato negli oociti di rana. Il secondo passaggio consiste nella creazione di ponti di agar, modellando i tubi capillari e successivamente riempiendoli con una soluzione di agar contenente sali.Successivamente, il preparato aperto viene preparato per l'esperimento posizionando tutti i componenti, inclusi il sito UO e i ponti di agarosio, nelle rispettive posizioni. L'ultimo passaggio consiste nell'inserire l'elettrodo microscopico nel sito UO per consentire registrazioni in voltage clamp. Infine, il protocollo di registrazione viene utilizzato per mostrare le correnti ioniche provenienti dai canali ionici localizzati nella membrana dell'oocita.Il principale vantaggio della tecnica del voltage clamp con preparazione aperta è che consente registrazioni stabili con basso rumore di una popolazione molto ampia di canali ionici. Permette inoltre una r

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Questo è inteso come una introduzione alla registrazione di patch clamp da ovociti di Xenopus laevis. Esso copre la rimozione della membrana vitellina, la formazione di un sigillo gigaohm (gigaseal), e la conversione facoltativa delle patch al di fuori-out topologia.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi...

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

Ci descrive un metodo che misura la cinetica del trasporto ionico di proteine ​​di membrana a fianco sito-specifica analisi dei cambiamenti conformazionali mediante fluorescenza su singole cellule. Questa tecnica è adattabile a canali ionici, trasportatori e pompe ioniche e può essere utilizzato per determinare vincoli di distanza tra le subunità proteiche.

Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine ​​di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

Descriviamo un metodo per quantificare l'attività delle ATPasi di tipo P che controtrasportano K+ mediante l'espressione eterologa degli enzimi negli ovociti di Xenopus e misurando l'assorbimento di Rb+ o Li+ nelle singole cellule mediante spettrofotometria di assorbimento atomico. Il metodo è un'alternativa sensibile e sicura agli esperimenti di flusso di radioisotopi, facilitando studi cinetici complessi.

Misurazione di trasporto cationico da Na, K e H, K-ATPasi<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli oociti per spettrofotometria di assorbimento atomico: una alternativa a saggi radioisotopi

Per completare i metodi comunemente usati per studiare TRPV4 di, sono descritti due metodi: la sua mechanosensitivity può essere studiato da Ca 2 + luminometria-aequorina in lievito transgenico upon sfida ipo-osmotico. Può pure esaminato TRPV4-RNA oociti di Xenopus iniettati da cellula intera clamp a due elettrodi tensione o Patch Clamp on-cella o modalità asportato.

Lievito luminometrici e Xenopus ovocita elettrofisiologiche Esami del mechanosensitivity molecolare del TRPV4

Viene descritto un metodo per l'imaging dei cambiamenti nel potenziale di membrana utilizzando indicatori di tensione geneticamente codificati.

Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

Vengono descritte procedure ottimizzate per l'isolamento di singoli follicoli, microiniezioni di RNA citoplasmatico, rimozione degli strati cellulari circostanti ed espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Inoltre, viene presentato un metodo semplice per cambi rapidi di soluzione in esperimenti elettrofisiologici con canali ionici ligando-dipendenti.

Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia

In questo articolo si descrive un miglioramento della convenzionale fluorometria a tensione di tensione (VCF) in cui vengono utilizzati fluorocinosi aminoacidi innaturali (fUAA) anziché coloranti maleimidi, per sondare i riarrangiamenti strutturali nei canali ionici. La procedura prevede l'iniezione di DNA Xenopus oocyte, la coinjection RNA / fUAA e le misure contemporanee di corrente e fluorescenza.

Fluorescenza a tensione di serraggio in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti

Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Descriviamo un metodo per la preparazione e l'imaging dal vivo di estratti citoplasmatici non diluiti da uova di Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparazione dell'estratto di uova e metodi di imaging dal vivo per la visualizzazione dell'organizzazione citoplasmatica dinamica

Qui presentiamo un protocollo per esprimere le proteine gap junction negli ovociti Xenopus e registrare la corrente giunzionale tra due ovociti apposti utilizzando un amplificatore commerciale progettato per registrazioni a doppio morsetto di tensione degli ovociti in una modalità di misurazione della corrente laterale elevata.

Registrazione della corrente di giunzione gap dagli ovociti xenopus

Impara la tecnica cut-open Vaseline gap per registrare correnti ioniche a basso rumore in oociti di Xenopus. Questo metodo elettrofisiologico offe alta risoluzione temporale per studiare la cinetica dei canali ionici.

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