Name: Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni Listeria monocytogenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-19T22:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Impara a quantificare l'invasione cellulare da Listeria monocytogenes usando l'etichettatura fluorescente di InlC. Questo metodo di microscopia ad alto rendimento identifica fattori dell'ospite coinvolti nell'infezione batterica.

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La ricerca in laboratorio P. Cossart è supportata dall&#39;Istituto Pasteur, l&#39;Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, l&#39;Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), l&#39;Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), la Fondazione Louis-Jeantet e la Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK è un destinatario di una borsa di studio dal Pasteur-Parigi Università internazionali Dottorato / Institut Carnot Maladies infectieuses. Ringraziamo Jason Mercer per ottimizzare il protocollo di trasfezione cellulare.

1. Preparazione di cellulare e batteriche culture, Strumenti di trasfezione e primari Anticorpi <ol><li> Preparare un piatto fresco agar per isolare singoli L. monocytogenes le colonie da uno stock di glicerolo batterica (50% glycerol/50% satura di cultura durante la notte liquida batterica) conservato a -80 ° C. <ol><li> Utilizzando un rack in alluminio (conservato a -80 ° C) per il trasporto di un congelati glicerolo batteriche archivi, batteri striscia su un Brain Heart Infusion (BHI) piastra di agar. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C durante 48 ore (o fino singole colonie batteriche possono essere isolati). </li><li> Tenere questo piano di lavoro in seguito a 4 ° C per un tempo massimo di 1 mese (sarà usato per seminare colture liquide). </li><li> Nel nostro protocollo, usiamo la L. monocytogenes sierotipo 1/2a EGDe.PrfA * ceppo, ma come illustrato in Figura 1, il L. monocytogenes sierotipo 4b P14.PrfA * ceppo dà risultati simili. </li></ol></li><li> LuiCellule CCL2 La ATCC sono coltivate in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) in assenza di antibiotici. </li><li> Piscine indipendenti strapazzate (controllo) e anti-Met siRNA sono caricati in 384 pozzetti piastre di coltura di cellule al microscopio nero. <ol><li> Diluire 160 pmol di siRNA in 500 ml di acqua RNase-free e aggiungere 5 ml di questa soluzione per pozzetto (concentrazione finale: 1,6 pmol). </li><li> Mantenere questo piatto a -20 ° C per un periodo massimo di 1 anno. </li></ol></li><li> Anticorpi policlonali di coniglio contro la proteina batterica InlC ottenuto mediante immunizzazione utilizzando una proteina ricombinante GST-InlC come descritto in precedenza 25. </li></ol> 2. Reverse siRNA Transfection cellulare <ol><li> 72 ore prima dell&#39;infezione portare a temperatura ambiente a 384 pozzetti piastra di coltura di cellule al microscopio nero contenente 1,6 pmol siRNA in 5 ml di acqua RNase-free in ogni pozzetto. </li><li> Centrifugare la piastra per 3 min a 300RCF a temperatura ambiente per abbattere siRNA che avrebbero potuto essere depositato nelle pareti dei pozzetti. </li><li> Preparare temperatura ambiente DMEM supplementato con 0,4% Lipofectamine RNAiMAX. </li><li> Aggiungere 25 ml di medium trasfezione DMEM / RNAiMAX a ciascun pozzetto (non incubare il mezzo trasfezione più di 20 minuti prima di aggiungere il siRNA). </li><li> Spostare la piastra avanti e indietro per mescolare il siRNA con la soluzione di trasfezione, quindi tenere la piastra per 1 ora a temperatura ambiente per consentire complessi siRNA-Lipofectamine per formare. </li><li> Lavare le cellule HeLa da un pallone-confluenti o coltura cellulare sub-confluenti una volta con 10 ml 37 ° C preriscaldata PBS. </li><li> Staccare cellule HeLa aggiungendo 1 ml 37 ° C preriscaldata tripsina al pallone di coltura cellulare e incubare per 3 a 5 min a 37 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in 10 ml 37 ° C preriscaldata DMEM supplementato con 16% FBS. </li><li> Contare le celle e preparare una sospensione cellulare di 12.000 cellule per ml in DMEM supplementato con16% FBS. </li><li> Aggiungere 50 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto nella piastra a 384 pozzetti. </li><li> Spostare la piastra rapidamente avanti e indietro per distribuire le cellule e lasciare che le cellule stabilirsi per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sigillare la piastra con Parafilm e tenerlo per 72 ore in un umidificata al 5% CO 2 contenente l&#39;atmosfera a 37 ° C. </li></ol> 3. Infezione cellulare e colorazione <ol><li> Il giorno prima infezione, prendere una singola colonia di L. monocytogenes dalla piastra BHI agar e risospendere in 5 ml di terreno BHI liquido in provette di polistirene 15 ml. </li><li> Incubare per una notte a 37 ° C in un dispositivo Shacking per consentire la crescita batterica. </li><li> Il giorno di infezione, lavare 1 ml della notte L. monocytogenes cultura mediante centrifugazione 2 min a 10,600 rcf in una centrifuga da tavolo. </li><li> Scartare il surnatante (che contiene il secreto citotossina listeriolysin O) e risospendere il pellet in 1 ml di PBS (ripett la fase di lavaggio altre 3 volte). </li><li> Leggere la densità ottica a 600 nm batterica e stimare il numero di batteri (OD = 1 corrisponde a 1E9 batteri / ml). </li><li> Preparare l&#39;adeguato L. monocytogenes diluizione in DMEM supplementato con 1% FBS: utilizzando ceppi altamente invasive come EGDe.PrfA *, si consiglia l&#39;uso di batteri 5E4 in 30 ml di mezzo per pozzetto (la molteplicità di infezione è stimato al 25 per 2.000 celle). </li><li> Rimuovere il terreno di coltura cellulare in ciascun pozzetto (80 microlitri) e sostituirlo con l&#39;aggiunta di 30 ml di L. monocytogenes contenenti medie. </li><li> Centrifugare la piastra a 200 rcf per 5 min a temperatura ambiente per sincronizzare il processo di infezione. </li><li> Incubare la piastra per 1 ora in un umidificata al 5% CO 2 contenente atmosfera a 37 ° C su un blocco di alluminio preriscaldata. </li><li> Rimuovere la L. monocytogenes contenente medio di ogni bene e aggiungere 30 ml di DMEM preriscaldata supplementato con 10% FBS e40 mg / ml di gentamicina per uccidere extracellulare L. monocytogenes. </li><li> Incubare per 4 ore in un CO 2-atmosfera contenente 5% a 37 ° C su un blocco di metallo preriscaldato. </li><li> Preparare una soluzione di PBS supplementato con 8% di formaldeide (questa soluzione deve essere preparato fresco in modo che i monomeri formaldeide, piuttosto che i polimeri paraformaldeide, vengono utilizzati). </li><li> Senza scartare il mezzo di coltura cellulare, aggiungere 30 ml di PBS addizionato con 8% di formaldeide (concentrazione finale: 4%) e incubare per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il fissativo e lavare le cellule tre volte con 80 ml di PBS per pozzetto (mantenere le cellule in un volume finale di 80 ml di PBS per pozzetto). </li><li> Preparare una diluizione 1:250 del coniglio anti-InlC siero in PBS completato con 0,2% di saponina. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione di anticorpo primario a ciascun pozzetto dopo aver rimosso il PBS e incubare per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Scartare il primariosoluzione di anticorpi e lavare quattro volte con 40 ml di PBS per pozzetto. </li><li> Diluire il Alexa Fluor 546-coupled anticorpo secondario anti-coniglio (1:250), la soluzione DAPI (1:1,500), e falloidina-Dy647 (1:150) in PBS integrato con 0,2% saponina. </li><li> Aggiungere 10 ml di questa soluzione colorante secondario in ciascun pozzetto ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare la soluzione colorante secondario e lavare quattro volte con 40 ml di PBS per pozzetto (lasciare un volume finale di 40 microlitri in ciascun pozzetto e sigillare la piastra). </li><li> La piastra può essere ripreso immediatamente o può essere conservato a 4 ° C al riparo dalla luce (coprire con un foglio di alluminio) per successive analisi. </li></ol> 4. Image Acquisition and Analysis <ol><li> Acquisire immagini in tre diversi canali (350 nm, 546 nm e 647 nm) con un obiettivo 10X montato su un microscopio automatizzato (acquisire preferenzialmente 9 immagini per bene). </li><li> Il segnale InlC può essere misurata con immaginesoftware di analisi come CellProfiler che consente la segmentazione automatica di nuclei e corpi cellulari che utilizzano il DAPI e la colorazione falloidina, rispettivamente. </li></ol>

<ol><li>Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells%3A+an+updated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).</li>
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<li>Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+L.+monocytogenes+into+cells+is+mediated+by+internalin%2C+a+repeat+protein+reminiscent+of+surface+antigens+from+gram-positive+cocci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci.</a> Cell. 65, 1127-1141 (1991).</li>
<li>Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+control+of+Listeria+monocytogenes+virulence+factors+by+a+gene+that+is+autoregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated.</a> Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).</li>
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<li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+landscape+of+host-pathogen+interactions+with+the+bacterium+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).</li>
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<li>Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha-and+beta-catenins+in+bacterial+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).</li>
<li>Ireton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion.</a> Science. 274, 780-782 (1996).</li>
<li>Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+protein+InlB+is+an+agonist+of+mammalian+phosphoinositide+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+patterns+associated+with+Listeria+monocytogenes+InlA-+or+InlB+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes.</a> Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+phosphatidylinositol+4-kinases+promote+Listeria+monocytogenes+entry+into+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells.</a> Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).</li>
<li>Hamon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+induced+by+a+family+of+bacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Histone modifications induced by a family of bacterial toxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).</li>
<li>Ribet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+impairs+SUMOylation+for+efficient+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection.</a> Nature. 464, 1192-1195 (2010).</li>
<li>Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416, 644-648 (2002).</li>
<li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
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<li>Gouin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+InlC+protein+interferes+with+innate+immune+responses+by+targeting+the+I%CE%BAB+kinase+subinit+IKK%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+analysing+invasion+of+mammalian+cells+by+bacterial+pathogens%3A+the+Listeria+monocytogenes+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system.</a> Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).</li>
<li>Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Diversi parametri sono fondamentali per il successo del nostro protocollo InlC rilevamento, compreso l&#39;uso di linee di cellule sane visualizzazione sufficientemente grande citoplasma per consentire una rilevazione univoca del segnale InlC. Nel saggio che presentiamo in questo articolo vi proponiamo l&#39;uso di cellule HeLa CCL2, che sono particolarmente adatti per la nostra analisi a causa della estensione del loro spazio citosolico; altri cloni HeLa come le cellule HeLa Kyoto mostrano un citoplasma più piccolo, ma...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51043">Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes</a>. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Z&#252;rich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

A correction to author list has been made for the article Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication.

Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Il batterio Gram positivi Listeria monocytogenes è un patogeno di origine alimentare che invade cellule ospiti, interrompe la sua vacuolo interiorizzazione e replica nel citoplasma delle cellule ospiti 1. L. monocytogenes facilità di manipolazione nel contesto laboratorio (rapida crescita, bassa tossicità per gli individui sani) associato con la persistenza di tratti di virulenza batterica osservati nei modelli cellulari e animali (attività emolitica, leucocitosi) ha permesso l&#39;uso iniziale nel 1960 come un modello importante per lo studio del parassitismo intracellulare e per l&#39;istituzione dei fondamenti teorici della immunità cellulare contro l&#39;infezione 2. Alla fine del 1980 e all&#39;inizio del 1990, la dissezione del ciclo intracellulare batterica 3, nonché la caratterizzazione molecolare dei più importanti fattori di virulenza batterica 4-7 favorito l&#39;uso di L. monocytogenes come strumento molecolare fondamentale per la manipolazione e studY di funzioni della cellula ospite. La presenza di virulenti (L. innocua) e virulenti (L. monocytogenes) specie del genere Listeria aperto la strada a studi di genomica comparativa 8 che, assieme alla recente istituzione del completo L. monocytogenes trascrittoma 9, hanno aumentato la nostra comprensione dell&#39;evoluzione del L. monocytogenes come agente patogeno umano e come sistema modello per l&#39;infezione Studi 10. L. monocytogenes induce la sua internalizzazione nelle cellule ospiti su interazione delle proteine ​​di superficie batterica dell&#39;INLA e InlB con i loro recettori della cellula ospite E-caderina e Met, rispettivamente, 11-12. Studi basati candidati-iniziali hanno portato all&#39;identificazione del collegamento catenine-actina α / β come componente significativa del percorso inlA-invasione 13 e del phosphoinositide 3-chinasi (PI 3-K) come effettore critica del InlB- dipendente invasione Cascade 14-15. Analisi proteomica e basati funzionale successivamente consentito l&#39;identificazione degli elementi del citoscheletro nuovi 16 e secondi messaggeri lipidici 17 necessari per l&#39;invasione della cellula ospite. Studi trascrizionali 18 e di massa a base di spettrometria di proteomica quantitativa 19 hanno recentemente gettato nuova luce concernente l&#39;attivazione di accoglienza cascate di segnalazione e la repressione delle risposte immunitarie durante L. monocytogenes infezione. La biologia dei sistemi si avvicina basato sulla inattivazione di grandi insiemi di geni (kinomes, genomi completi) da piccoli RNA interferenti (siRNA) silenziamento hanno recentemente aperto nuove strade per l&#39;analisi di accoglienza globale cascate di segnalazione nel contesto di specifiche funzioni cellulari, tra cui la fagocitosi e patogeno interiorizzazione 20. Schermi siRNA genome-wide sono stati precedentemente eseguiti per studiare cascate cellulari necessarie per l&#39;infezione di L. monocytogenes in phagocytic Drosophila </em&gt; cellule S2 21-22, ma questo tipo di analisi non è stata eseguita in cellule non fagocitarie, che rappresentano bersagli critici per l&#39;infezione in vivo. Abbiamo ottimizzato un protocollo per la rilevazione microscopica delle ultime fasi di infezione da L. monocytogenes che è adatto per gli studi high-throughput siRNA di entrata batterica all&#39;interno delle cellule epiteliali. La nostra analisi si avvale di una L. altamente invasiva monocytogenes che presenta una mutazione puntiforme nel PrfA, il regolatore trascrizionale maggiore di L. monocytogenes fattori di virulenza 6: questa mutazione (denominata PrfA *) rende PrfA costitutivamente attivo 23 e porta ad un aumento dell&#39;espressione delle proteine ​​invasione dell&#39;INLA e InlB, quindi favorendo l&#39;ingresso di batteri in cellule non fagocitarie altrimenti poco infetti. La nostra lettura di infezione si basa sulla rilevazione dell&#39;accumulo citosolica della proteina secreta batterica InlC: questa molecola èun effettore pleiotropici che si esprime preferenzialmente da intra-citoplasmatica L. monocytogenes 9 e che partecipa non solo nella cella cellula-batterica distribuite 24, ma che modula anche la risposta immunitaria 25. La marcatura fluorescente di InlC secrezione da batteri intracellulari permette non solo di distinguere chiaramente infetto da cellule non infette, ma rappresenta anche una lettura end-point che può essere utilizzato per analizzare successivamente infezione nelle sue diverse fasi: entrata, fuga vacuolare, citosolica batterica proliferazione e diffusione cellula-cellula. Questo protocollo basato microscopia può essere accoppiato a schermi siRNA quindi studiare vie cellulari coinvolti nella infezione di cellule ospiti di L. monocytogenes.

<table><tbody><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>237500</td><td>Per la preparazione di BHI liquido</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Integratore di BHI liquido per piastre di agar BHI </td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato a caldo</td><td>Biowest</td><td>51830-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778-100</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1397-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>Preparare fresco prima di ogni esperimento</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina Dy647</td><td>Dyomics</td><td>647-33</td><td></td></tr><tr><td>siRNA Scramble</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>siRNA Met</td><td>Dharmacon</td><td>L-003156-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare per microscopia a 384 pozzetti</td><td>nera Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio AxioObserver Z1</td><td>Fotocamera Zeiss</td><td>431007 9901</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera sCMOS</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi CellProfiler</td><td>Software</td><td>pubblico Broad Institute disponibile all'indirizzo <a href="http://www.cellprofiler.org/" target="_blank">http://www.cellprofiler.org/</a></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging inlc secrezione per indagare infezione cellular dalla batterica patogeni<em&gt; listeria monocytogenes</em

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Patogeni intracellulari batteriche possono essere concepite come strumenti molecolari per sezionare cascate di segnalazione cellulare a causa della loro capacità di manipolare squisitamente e sovvertire le funzioni cellulari che sono necessarie per l&#39;infezione dei tessuti bersaglio ospitanti. Tra questi batteri patogeni, Listeria monocytogenes è un microrganismo Gram positivo che è stato usato come paradigma per parassitismo intracellulare nella caratterizzazione delle risposte immunitarie cellulari, e che ha avuto un ruolo strumentale nella scoperta di percorsi molecolari che controllano citoscheletro e membrana dinamiche di traffico. In questo articolo descriviamo un saggio microscopica robusto per l&#39;individuazione di fasi tardive infezione cellulare di L. monocytogenes basano sulla marcatura fluorescente di InlC, una proteina batterica secreto che si accumula nel citoplasma delle cellule infette; questo dosaggio può essere accoppiato ad alto throughput schermi piccoli RNA interferenti automatizzati per charziazioni che caratterizzano vie di segnalazione cellulari coinvolti nella up o down-regulation di infezione.

Marcatura fluorescente di citoplasmatica InlC fornisce una lettura affidabile per l&#39;infezione delle cellule di L. monocytogenes, come illustrato in Figura 1: la cella centrale nella micrografia è altamente infettati dal ceppo P14.PrfA * 23 come si può osservare l&#39;immagine a contrasto di fase (frecce, figura 1A) e viene confermata dal segnale DAPI dove i singoli batteri possono essere chiaramente distinti (Figura 1B). La colorazione InlC (sovr...

Listeria monocytogenes è un batterio patogeno Gram positivi frequentemente usato come modello importante per lo studio di parassitismo intracellulare. Imaging tardi L. monocytogenes fasi di infezione nel contesto di schermi piccole interferenti RNA permette per lo studio globale di vie cellulari necessarie per infezione batterica delle cellule ospiti bersaglio.

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare l'invasione cellulare da parte del patogeno Listeria monocytogenes nel contesto di saggi di RNAi, al fine di individuare nuove funzioni cellulari necessarie per l'infezione batterica. Tale obiettivo viene raggiunto innanzitutto eseguendo un'infezione inversa cellulare mediata da RNAi per inattivare specifiche funzioni della cellula ospite. In un secondo passaggio, le cellule vengono inoculate con Listeria monocytogenes, che infetterà in modo differenziale le cellule a seconda delle funzioni cellulari alterate dal trattamento con siRNA.Successivamente, le cellule infette vengono trattate mediante immunofluorescenza per etichettare i nuclei cellulari. L'actina del citoscheletro e la proteina batterica INLC producono risultati che consentono di identificare le cellule infette e di distinguerle da quelle non infette, in base all'analisi microscopica della distribuzione della proteina INLC all'interno delle singole cellule. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi di invasione con Gentamicina, è che può essere utilizzata in maniera FU.Pertanto, questo metodo potrebbe aiutare a rispon

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Misurazione della carica batterica e Risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes</em

Fonte: Chetrit, D., et al. Applicazione di imaging a cellule vive e tomografia crioelettronica per risolvere le caratteristiche spaziotemporali del sistema di secrezione dot/ icm di Legionella pneumophila . J. Vis. Esp. (2020).Questo video mostra la preparazione e l'imaging di batteri patogeni marcati con fluorescenza. I cuscinetti di agarosio vengono prima preparati e posizionati all'interno di una cornice adesiva. Una sospensione di batteri geneticamente modificati che esprimono una proteina...

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Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes

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Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

Impara a quantificare l'invasione cellulare da Listeria monocytogenes usando l'etichettatura fluorescente di InlC. Questo metodo di microscopia ad alto rendimento identifica fattori dell'ospite coinvolti nell'infezione batterica.

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni

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