Name: Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Scopri come costruire patch ingegnerizzati con fogli cellulari usando polimeri termosensibili pNIPAM. Questo metodo preserva l'integrità cellulare per impianti tessutali avanzati.

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Questo lavoro è stato finanziato da un New Faculty Award II del California Institute of Regenerative Medicine (CIRM; RN2-00921-1), il National Research Award (F32-HL104924) finanziato dal NIH e il CIRM Training Grant (TG21163). I materiali sono stati forniti da: Glycosan Biosystems Inc / BioTime e Dr. Stephen Badylak (Università di Pittsburgh)

1 Creazione di piatti pNIPAAM rivestite <ol><li> Sciogliere 2.6 g di pNIPAAM in 2 ml di una soluzione di esano al 60% di toluene / 40%. </li><li> Riscaldare la miscela a 60 ° C per 10 min agitati, finché il pNIPAAM è disciolto. </li><li> Tagliare carta da filtro in un cerchio di diametro di 60 mm e carta posto in imbuto Buchner. </li><li> Filtrare la soluzione attraverso imbuto Buchner nel bicchiere di vetro pre-pesato (non usare la plastica, come esano si scioglierà la plastica). </li><li> Porre il bicchiere e contenuto in un vuoto campana (24 psi) O / N (16 ore). Nota: Fino a quando il residuo viene fatto reagire con isopropilico esso si ossida in modo da assicurarsi che non venga a contatto con l&#39;ossigeno. </li><li> Pesare il becher per stabilire il peso del pNIPAAM. </li><li> Aggiungere alcool isopropilico al pNIPAAM, creando un 50/50 w / w soluzione. </li><li> Inserire 2 ml della soluzione sulla superficie della piastra di coltura tissutale, e cappotto per 5 min sotto luce UV. </li><li> Lavare la piastra con 2 ml di PBS caldo due volteprima di utilizzare per la coltura cellulare. </li></ol> 2 Creazione di fogli Cellulari Nota: fogli di cellule primarie per l&#39;organo bersaglio possono essere creati utilizzando una serie di metodi diversi, o da rivestimento di superfici di coltura di tessuti con polimero termo-sensibile come descritto qui. Lastre termo-sensibile pre-rivestiti sono offerti anche da un certo numero di fornitori. Nota: Questo protocollo è per la cultura con un piatto da 35 mm. Brevemente, le cellule vengono incubate a 37 ° C per un minimo di 24 ore a confluenza per stabilire connessioni laterali tra celle adiacenti. Per rilasciare fogli cellulari, piastre vengono sottoposti a temperature inferiori a 32 ° C. Il foglio cella viene poi trasferito al forte matrice fibrosa base contenente un idrogel permissiva neovascolare con cellule endoteliali vascolari. <ol><li> Isolare la popolazione cellulare. Nota: questo metodo dipende dai singoli procedimenti di derivazione e del tipo di cellule. Rat aortica mu lisciacellule SCLE (RASMC) sono utilizzati in questo esempio. Queste sono cellule muscolari lisce primarie isolate dall&#39;aorta addominale di un topo. </li><li> Lavare le cellule con 2 ml di PBS caldo. </li><li> Aggiungere 3 ml di tripsina (o altro / soluzione dissociare scissione) alle cellule per 5 min. </li><li> Inibire la tripsina con l&#39;aggiunta di 3 ml di terreno di coltura, o soluzione tampone fosfato (PBS) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS). </li><li> Raccogliere le cellule in un tubo conico e contare una aliquota. </li><li> Spin le cellule a 1000 rpm (228 xg) per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in loro mezzi di crescita (SmGM2 più kit proiettile terreno di coltura viene utilizzato per RASMC). </li><li> Posizionare i supporti contenenti le cellule su un piatto di 35 millimetri termo-sensibili - piastra rivestita pNIPAAM ad una concentrazione che permetterà di conseguire il 100% di confluenza. Nota: Per RASMCs quel numero è stato determinato in 100.000 cellule / cm 2. Tuttavia, a causa della perdita di cellule durante il passaggio, 120% di detto va<html> viene utilizzato lue. </li><li> Mettere in un incubatore a 37 ° CO / N. Nota: È importante mantenere le cellule a 37 ° C per mantenere l&#39;adesione delle cellule alla piastra. </li></ol> 3 Preparazione di Matrix Foundational Nota: Vari matrici fibrosi 3D possono essere usati per sovrapporre forte matrice fibrosa tra i fogli di cellule delicate. Alcuni esempi includono: Gelfoam, Bioglass, materiali naturali acellularized 26 o nanospun materiali 27,28 Il suina matrice vescica urinaria (UBM) utilizzati in questi studi è stato generosamente fornito dal nostro collaboratore, il dott Badylak 29. <ol><li> Prima dell&#39;uso, determinare le caratteristiche della matrice, tra cui la mancanza di contenuto cellulare se si utilizza matrice decellularized, 27,28 cellulare vitalità specifico, e lo spazio vuoto. 22 </li><li> Tagliare la matrice pre-sterilizzato in una dimensione e forma desiderata. Nota: Qui, un foro-perforazione è utilizzata per tagliare un cerchio del diametro di 4 mm. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 4. Semina cellule endoteliali in un Neovascolare Permissivo Hydrogel Nota: Le cellule endoteliali possono essere ottenuti da una varietà di fonti, tra cui la differenziazione da cellule staminali o progenitrici. Qui, vengono utilizzati HUVECs. <ol><li> Utilizzare qualsiasi idrogel permissiva (fibrina, gel di collagene) fintanto che il tempo di reticolazione è abbastanza breve da consentire alle cellule rimangono vitali. Nota: Qui, un gel Hyaluronan (HA) basato reticolato con viene utilizzato un ponte disolfuro. </li><li> Preparare l&#39;idrogel HA in conformità con il protocollo aziendale. </li><li> Raccogliere le cellule endoteliali e disperdersi in una soluzione singola cella utilizzando tripsina 1x. Nota: Accutase o cellulare Dissociazione Buffer potrebbero essere utilizzati anche per la dispersione singola cellula. </li><li> Disattivare l&#39;enzima tripsina utilizzando una pari quantità di inibitore della tripsina di soia (se è importante che le cellule non vengano a contatto con il siero) o 10% FBS in PBS, raccogliendo la soluzione / cellule in un tubo da 15 ml. </li><li> Count le cellule, e calcolare il volume necessario per le dimensioni delle patch (precedentemente quantificato). Nota: Per una patch a 4 mm, sono usati qui 2 milioni di cellule endoteliali. </li><li> Estrarre 2 milioni di cellule, e inserire in un nuovo tubo da 15 ml. </li><li> Spin a (228 xg) per 5 min. </li><li> Aspirare il supernatante, lasciando le cellule come pellet in un tubo conico. </li><li> Mescolare i materiali liquidi HA e la gelatina in un 1: 1 razione. Aggiungere quindi 80% del volume totale nel tubo conico contenente il pellet. </li><li> Risospendere le cellule endoteliali nella miscela 1: 1 HA / gelatina </li><li> Posizionare le cellule in sospensione nella miscela HA / gelatina nella base matrice fibrosa dal punto 2. </li><li> Aggiungere 1/5 (20 percento) del volume totale desiderata del cross-linker </li><li> Incubare per 1 ora a 37 ° C. </li></ol> 5 Isolamento di fogli Cellulari <ol><li> Rimuovere le piastre 35 millimetri pNIPAAM trattati contenenti le cellule dal incubatore e posto in una cappa di coltura cellulare aRT. </li><li> Aspirare rapidamente il supporto dalle cellule, e aggiungere 2 ml di 6% di gelatina normale che è stato riscaldato a 37 ° C. </li><li> Mentre la gelatina è ancora caldo, posizionare il reticolo di metallo nella gelatina, immergendo sotto la superficie della gelatina normale (Film 1). </li><li> Inserire l&#39;intera piastra su ghiaccio per 5 a 7 minuti, consentendo la gelatina per indurire. </li><li> Dopo 7 minuti, utilizzare una spatola per separare accuratamente i bordi gelatina dal lato della piastra, e quindi utilizzare pinze per sollevare la grata metallica dalla piastra Nota: La gelatina 6%, e il foglio di cella deve sollevare con il reticolo. </li><li> Spostare il foglio cella al piatto e posto sulla sommità della combinazione matrice idrogel di base fibrosa, impostando attentamente il reticolo sopra il costrutto. Nota: La parte apicale dello strato di cellule sarà ancora in prima posizione. </li><li> Aggiungere 2 ml di supporti caldo (37 ° C). </li><li> Incubare O / N consentendo il foglio di cellule di aderire alla superficie idrogel. </li><li> Rimuovere tegli reticolo di metallo dopo la soluzione si riscalda (circa 1 ora), o il giorno successivo. </li></ol>

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Non abbiamo nulla da rivelare.

I passaggi critici nel protocollo comprendono: rivestimento delle superfici delle piastre con il polimero thermoresponsive e manipolare i fogli di cellule dopo il raffreddamento delle piastre. Poiché le cellule differenti presentano differenti proprietà fisiche, come adesività, il tempo di sollevamento deve essere ottimizzata per ogni tipo di cellula diversa. Il secondo, e più significativamente impegnativo componente di questo protocollo, incentrata sulla manipolazione dello strato di cellule, un aspetto critico di met...

L'iniezione di cellule e/o singoli materiali da sola ha mostrato un successo variabile in altri sistemi di organi e un successo limitato nella rigenerazione cardiaca. 5,7-12 Attualmente, le cellule derivate da cellule staminali vengono consegnate ai tessuti danneggiati utilizzando una varietà di metodi di consegna, tra cui: iniezione diretta di cellule nei tessuti e perfusione nell'afflusso di sangue. Altri hanno impiantato cellule da sole, materiali da soli e/o in combinazione con trasportatori di materiali per aiutare a rigenerare gli organi danneggiati. 18-21 Questo design combina più strategie che forniscono resistenza del materiale, modelli in più materiali e più tipi di celle. 
In particolare, la matrice fibrosa acellularizzata di base fornisce la forza fisica fondamentale al costrutto, rendendolo adatto per la sutura nel paziente, se necessario. Gli spazi vuoti nella matrice di base sono riempiti con cellule endoteliali in un idrogel neovascolare permissivo22 per stabilire rapidamente la vascolarizzazione del costrutto impiantato. Questo composito viene quindi integrato con fogli cellulari pre-modellati che consentono una migliore comunicazione da cellula a cellula, imitando più da vicino il tessuto nativo. 1,23-25 Il processo di produzione complessivo per il cerotto cellulare stratificato è delineato dal diagramma di flusso nella Figura 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>Cell tracker / live dye</td></tr><tr><td>Lysotracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>Cell tracker</td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma</td><td>N7005</td><td>Visible Cell dye</td></tr><tr><td>pNIPAAM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>412780250</td><td>Poly(N-isopropylacrylamide)</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>RAOSMC</td><td>Lonza</td><td>R-ASM-580</td><td>Cellule muscolari lisce dell'aorta di ratto</td></tr><tr><td>SmGM2</td><td>Lonza</td><td>CC-4149</td><td>Media muscolare liscia</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td>Cellule endoteliali venose umane</td></tr><tr><td>HyStem</td><td>Glycosan/ Biotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>VWR International</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-C1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Attrezzatura specifica</td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Ahlstrom&nbsp;</td><td>6310-0900&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imbuto Buchner&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Z247308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piastre UpCell&nbsp;</td><td>Nunc&nbsp;</td><td>2014-11&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luce UV</td><td>Jelight Company&nbsp;</td><td>Pulitore UVO Modello n.42</td><td></td></tr></tbody></table>

ingegneria dei tessuti: costruzione di un multicellulare 3d ponteggio per la consegna di layered fogli cellulari

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Molti tessuti, come i cuori umani adulti, non sono in grado di rigenerarsi in modo adeguato dopo un danno. 2,3 Strategie di ingegneria dei tessuti propongono innovazioni per aiutare il corpo nel recupero e riparazione. Ad esempio, gli approcci TE possono essere in grado di attenuare il rimodellamento cardiaco dopo infarto miocardico (MI) e possibilmente aumentare la funzione cardiaca totale a un livello normale di MI-pre vicino. 4 Come con qualsiasi tessuto funzionale, la rigenerazione del tessuto cardiaco di successo comporta la corretta consegna dei più tipi di cellule con stimoli ambientali che favoriscono l&#39;integrazione e la sopravvivenza del trapianto di cellule / tessuti impiantati. Tessuti ingegnerizzati dovrebbero affrontare più parametri tra cui: segnali solubili, cell-to-cell interazioni e materiali a matrice, calcolati come veicoli per le consegne, i loro effetti sulla sopravvivenza delle cellule, la forza materiale, e la facilitazione di organizzazione cellula-tessuto. Gli studi che utilizzano l&#39;iniezione diretta di cellule madri per marze ignorare solo questi elementi essenziali. 2,5,6Un design di tessuto che unisce questi ingredienti deve ancora essere sviluppato. Qui, presentiamo un esempio di design integrate con stratificazione di fogli di cellule fantasia con due tipi distinti di materiali biologici di derivazione contenenti il ​​tipo di cellule dell&#39;organo bersaglio e le cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi nel &quot;tessuto&quot;. Sebbene questi studi si concentrano sulla generazione di tessuto cardiaco-like, questo disegno tessuto può essere applicato a molti altri organi oltre cuore con minimi cambiamenti di design e materiali, ed è pensato per essere un prodotto off-the-shelf per terapie rigenerative. Il protocollo contiene cinque passaggi dettagliati. Una temperatura sensibile Poli (N -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) viene utilizzato per tessuti cappotto coltura piatti. Poi, le cellule del tessuto specifico sono coltivate sulla superficie delle piastre rivestite / superfici micropattern per formare fogli di cellule con forti aderenze laterali. In terzo luogo, una matrice di supporto è per il tessuto combinando matrice porosa con Permissi neovascolareve idrogel e cellule endoteliali. Infine, i fogli di cellule vengono sollevati dai piatti pNIPAAM rivestiti e trasferiti all&#39;elemento di base, rendendo il costrutto completo.

Il diagramma di flusso (figura 1) illustra il metodo generale di rendere la patch multistrato. Fogli cellulari sono staccati dalla piastra trattata pNIPAAM facendo cadere la temperatura sotto i 32 ° C. Poi il foglio cella è posto in cima al idrogel reticolato contenente le cellule endoteliali seminate nella matrice fibrosa sottostante (Figura 1). Le piastre termosensibili pretrattati possono essere utilizzati anche per creare i fogli di cellule. Superfici speciali topologiche sono usati...

Per la creazione di strutture altamente organizzate di tessuti complessi, è necessario assemblare più materiali e tipi di cellule in un composito integrato. Questo design combinatorio incorpora fogli cellulari stratificati specifici per organo con due materiali distinti di derivazione biologica contenenti una forte base di matrice fibrosa e cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi.

Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare fogli cellulari per costruire una toppa ingegnerizzata di tessuto. Questo viene ottenuto innanzitutto trattando la superficie della coltura cellulare con il polimero termosensibile polipropil acrilamide, noto anche come p nipam. Il secondo passaggio consiste nel coltivare le cellule di interesse in alta densità su una superficie rivestita con polimero per creare fogli cellulari.Successivamente, i foglietti vengono sollevati abbassando la temperatura della piastra, il che permette alle cellule di staccarsi dalla piastra sotto forma di un foglietto cellulare. L'ultimo passaggio consiste nel trasferire i foglietti cellulari integri senza strapparli su un costrutto destinato all'impianto. In definitiva, una semplice microscopia ottica può essere utilizzata per dimostrare che il foglietto cellulare è stato creato e mantenuto durante le manipolazioni necessarie alla realizzazione di un materiale tessutale ingegnerizzato impiantabile.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, che incorporano le cellule in matrici simili a idrogeli, è che con questa tecnica i bordi laterali delle cellule possono essere generati e mantenuti come un tessuto funzionale. Questi metodi possono inoltre permettere ulteriori studi nel campo dell'ingegneria tissutale. Ad esempio, quanto bene sopravvivono le cellule dopo il trapianto quando si trovano in questo stato organizzato?Questa procedura sarà dimostrata dal dottor William Turner, ricercatore postdottorato nel mio laboratorio, e da Ms. Snapshot Sand Do. Per iniziare la procedura, sciogliere 2,6 grammi di P nipam in due millilitri di una soluzione al 60% di toluene e al 40% di esano. Successivamente, riscaldare la miscela a 60 gradi Celsius per 10 minuti e mescolare fino a quando il P nipam è completamente sciolto.Quindi tagliare la carta da filtro in un cerchio di 60 millimetri di diametro e posizionarlo in un imbuto di Buchner. Filtrare la soluzione attraverso l'imbuto di Buchner in un becher di vetro precedentemente pesato. Lasciare il becher e il contenuto sotto vuoto in una campana per tutta la notte.Successivamente, pesare il becher con p nipam. Aggiungere poi alcol isopropilico a P nipam per ottenere una soluzione al 50 50 peso peso. Successivamente, versare due millilitri della soluzione sulla superficie della piastra per colture cellulari e ricoprire per cinque minuti sotto luce UV.Quindi lavare la piastra con due millilitri di PBS caldo due volte prima di utilizzarla per la coltura cellulare. In questo procedimento, isolare innanzitutto le cellule muscolari lisce aortiche del ratto lavando le cellule con due millilitri di PBS caldo. Successivamente, aggiungere tre millilitri di tripsina o un’altra soluzione dissociante tagliante alle cellule e incubare per cinque minuti.Quindi aggiungere tre millilitri di terreno di coltura o PBS contenente FBS al 10% alle cellule. Successivamente, raccogliere le cellule in un tubo conico e contarle. In seguito, centrifugare le cellule a 1000 giri al minuto per cinque minuti.Aspirare il soprannatante e risospendere le cellule nel mezzo di crescita. Successivamente, posizionare il mezzo contenente le cellule su una piastra da 35 millimetri sensibile alla temperatura a una concentrazione che consenta di raggiungere una confluenza del 100%, quindi incubare a 37 gradi Celsius durante la notte per mantenere l'adesione cellulare alla piastra. Ora raccogliere le cellule endoteliali e disperderle in una soluzione di singole cellule.Per la dispersione in singole cellule, si può utilizzare anche un buffer di tripsina, acuato o di dissociazione cellulare. Successivamente, disattivare l'enzima tripsina con un volume equivalente di inibitore della tripsina da soia o con FBS al 10% in PBS. Quindi raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 millilitri.Contare le cellule con un emocitometro e calcolare il volume necessario in base alle dimensioni della zona da trattare; per una zona di quattro millimetri vengono utilizzate 2 milioni di cellule endoteliali. Successivamente, prelevare 2 milioni di cellule e posizionarle in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare quindi le cellule per cinque minuti, aspirare il soprannatante lasciando il pellet cellulare nel tubo conico. Preparare ora l'idrogel ad alto contenuto di aurina seguendo il protocollo fornito dal produttore.Mescolare aurina alta e gelatina liquida in rapporto uno a uno. Successivamente, trasferire l'80% del volume finale totale nel tubo conico contenente il pellet e risospendere le cellule endoteliali nella miscela di aurina alta e gelatina. Quindi, trasferire le cellule sospese nella matrice fibrosa.Aggiungere il 20% del volume finale totale del crosslinker e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. In questo passaggio, rimuovere la piastra da 35 millimetri trattata con P nypa contenente le cellule dall'incubatore e posizionarla in una cappa da coltura cellulare. A temperatura ambiente, aspirare rapidamente il mezzo dalle cellule.Quindi aggiungere due millilitri di gelatina normale al 6% a 37 gradi Celsius alla piastra, mentre la gelatina è ancora calda; inserire il reticolo metallico nella gelatina, immergendolo al di sotto della superficie della gelatina normale. Successivamente, porre l'intera piastra su ghiaccio per cinque o sette minuti, consentendo alla gelatina di indurirsi. Dopo sette minuti, utilizzare una spatola per staccare con attenzione i bordi della gelatina dai lati della piastra.Successivamente, sollevare il reticolo metallico dalla piastra con una pinzetta. Trasferire il foglietto cellulare nella piastra e posizionarlo sulla superficie della combinazione di idrogel fibroso. Aggiungere due millilitri di mezzo a 37 gradi Celsius nella piastra per colture cellulari e incubare tutta la notte per permettere al foglietto cellulare di aderire alla superficie dell'idrogel.Nel frattempo, rimuovere il reticolo metallico dopo che la soluzione si è riscaldata. Qui, le cellule sono state coltivate su una superficie rivestita con Pippa e successivamente trasferite come un foglietto sulla superficie della matrice fibrosa. I primi tentativi, non effettuati con il reticolo metallico di gelatina, hanno prodotto piccole aree strappate.Questa immagine rappresenta un'immagine composita di un design precoce della patch che combina il marcatore mitocondriale, cellule muscolari lisce aortiche di ratto colorate in rosso, cellule endoteliali umane provenienti da vena ombelicale marcate con calcio am verde fluorescente e l'immagine in luce trasmessa. Questa è la composizione del foglietto cellulare combinato con la combinazione di idrogel a matrice fibrosa con base più resistente. L'immagine composita è stata acquisita dal fondo della patch attraverso una matrice fibrosa con base più resistente, mentre questa immagine composita dei foglietti cellulari è stata acquisita sopra la matrice fibrosa di base.Le cellule della combinazione di idrogel nel foglietto ricoprono la matrice fibrosa di base costituita da una combinazione di idrogel, che mostra un aumento della fluorescenza ai bordi a causa dell'accumulo delle cellule. Questa è un'immagine in trasmissione del costrutto e della matrice fibrosa naturale autofluorescente di base in DPI mostrata qui. Seguendo questa procedura, altri esperimenti di ingegneria tissutale possono rispondere ad altre domande, come ad esempio in che modo l'allineamento e la comunicazione cellulare influenzano il successo del trapianto.Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale di esplorare modi complessi di trapiantare più tipi cellulari. Non dimenticare che lavorare con solventi può essere estremamente pericoloso. Precauzioni, come indossare maschere adeguate e cappelle chimiche, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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