Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare fogli cellulari per costruire un cerotto di ingegneria tissutale. Ciò si ottiene trattando prima la superficie della coltura cellulare con il polimero termosensibile polipropilacrilammide, noto anche come p nipam. Il secondo passo consiste nel coltivare le cellule di interesse ad alta densità sulla superficie rivestita di polimero per creare fogli cellulari.

Successivamente, i fogli vengono sollevati abbassando la temperatura della piastra, il che consente alle celle di staccarsi dalla piastra come un foglio di celle. Il passaggio finale consiste nello spostare i fogli cellulari intatti senza strapparli su un costrutto per l'impianto. In definitiva, la microscopia ottica semplice può essere utilizzata per dimostrare che il foglio cellulare è stato creato e mantenuto durante la sua manipolazione, creando al contempo un materiale di ingegneria tissutale impiantabile.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, che incorporano le cellule in una matrice come idrogel, è che in questa tecnica, i bordi laterali delle cellule possono essere generati e mantenuti come un tessuto funzionale. Questi metodi possono anche consentire ulteriori studi nel campo dell'ingegneria tissutale. Ad esempio, quanto bene sopravvivono le cellule dopo il trapianto quando sono in questo stato organizzato?

A dimostrare questa procedura saranno il Dr.William Turner, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio e la signora Snapshot sand do. Per iniziare questa procedura sciogliere 2,6 grammi di P nipam in due millilitri di una soluzione di 60% toluene e 40% esano. Quindi, scaldare il composto a 60 gradi Celsius per 10 minuti e mescolare fino a quando il nipam non si sarà sciolto.

Quindi tagliare la carta da filtro in un cerchio di 60 millimetri di diametro e posizionarla in un imbuto buchner. Filtrare la soluzione attraverso l'imbuto di Buchner in un becher di vetro pre-pesato. Conservare il bicchiere e il contenuto in un sottovuoto a campana per una notte.

Successivamente, pesare il bicchiere con il p nipam. Successivamente aggiungere alcol isopropilico al P nipam per creare una soluzione di peso 50 50. Successivamente, posizionare due millilitri di soluzione sulla superficie della piastra di coltura tissutale e rivestirla per cinque minuti sotto la luce UV.

Quindi lavare la piastra con due millilitri di PBS caldo due volte prima di utilizzarla per la coltura cellulare. In questa procedura, in primo luogo, isolare le cellule muscolari lisce dell'aorta di ratto lavando le cellule con due millilitri di PBS caldo. Quindi, aggiungere tre millilitri di tripsina o un'altra soluzione dissociante scissione alle cellule e incubare per cinque minuti.

Quindi aggiungere alle cellule tre millilitri di terreno di coltura o PBS contenente il 10% di FBS. Dopodiché, raccogli le cellule in una provetta conica e contale. Successivamente, far girare le celle a 1000 giri/min per cinque minuti.

Aspirare il surnatante e risospendere le cellule nel terreno di coltura. Posizionare quindi il terreno contenente le cellule su una piastra termosensibile da 35 millimetri a una concentrazione che raggiunga il 100% di confluenza, quindi incubare a 37 gradi Celsius durante la notte per mantenere l'adesione delle cellule alla piastra. Ora raccogli le cellule endoteliali e disperdile in una soluzione a cellula singola.

L'uso di un tampone x tripsina, acuato o di dissociazione cellulare potrebbe essere utilizzato anche per la dispersione di singole cellule. Successivamente, disattivare l'enzima tripsina con una quantità uguale di inibitore della tripsina di soia o il 10% di FBS nella PBS. Quindi raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 millilitri.

Contare le cellule con un emocitometro e calcolare il volume necessario per le dimensioni del cerotto per un cerotto di quattro millimetri, dopodiché vengono utilizzate 2 milioni di cellule endoteliali, estrarre 2 milioni di cellule e metterle in una nuova provetta conica da 15 millilitri. Quindi centrifugare le cellule per cinque minuti, aspirare il surnatante, lasciando le cellule come un pellet nel tubo conico. Ora prepara l'idrogel ad alto contenuto di aurin secondo il protocollo aziendale.

Mescolare l'alta aurina e la gelatina liquida in un rapporto di uno a uno. Successivamente trasferire l'80% del volume finale totale nel tubo conico contenente il pellet, risospendere le cellule endoteliali nella miscela di gelatina ad alto contenuto di aurina. Quindi, trasferire le cellule sospese nella matrice fibrosa.

Aggiungere il 20% del volume finale totale del reticolante e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. In questa fase, rimuovere la piastra trattata con P nypa da 35 millimetri contenente le cellule dall'incubatore e posizionarla in una cappa per coltura cellulare. A temperatura ambiente, aspirare rapidamente il terreno dalle celle.

Quindi aggiungere due millilitri di gelatina normale a 37 gradi Celsius, 6% mentre la gelatina è ancora calda, posizionare il reticolo metallico nella gelatina, immergendolo sotto la superficie della gelatina normale. Successivamente, metti l'intero piatto sul ghiaccio per cinque-sette minuti, lasciando indurire la gelatina. Dopo sette minuti, con una spatola separare accuratamente i bordi della gelatina dal lato del piatto.

Quindi, sollevare il reticolo metallico dalla piastra con una pinza. Trasferire il foglio cellulare nel piatto e posizionarlo sopra la combinazione di idrogel a matrice fibrosa. Aggiungere due millilitri di terreno a 37 gradi Celsius alla piastra di coltura tissutale e incubare per una notte per consentire al foglio di cellule di aderire alla superficie dell'idrogel.

Nel frattempo, rimuovere il reticolo metallico dopo che la soluzione si è riscaldata. Qui, le cellule sono state coltivate su una superficie rivestita di Pippa e poi spostate come un foglio sulla superficie della matrice fibrosa. Le prime prove che non sono state trasferite con il reticolo di gelatina metallica hanno portato a piccole chiazze a brandelli.

Questa immagine rappresenta un'immagine composita del design iniziale del cerotto che combina il mito tracker, le cellule muscolari lisce aortiche di ratto colorate di rosso, le cellule endoteliali della vena ombelicale umana fluorescente verde calcio am e l'immagine a luce trasmessa. E questo è il composito di foglio cellulare combinato con la combinazione di idrogel a matrice fibrosa di base più forte. Questa immagine composita è stata scattata dal fondo del cerotto attraverso una matrice fibrosa di base più forte, e questa immagine composita dei fogli cellulari è stata scattata sopra la matrice fibrosa di base.

Le celle combinate di idrogel nel foglio coprono la combinazione di idrogel di matrice fibrosa di base, che mostra una maggiore fluorescenza ai bordi a causa del raggruppamento delle cellule. Questa è un'immagine di trasmissione del costrutto e la matrice di base fibrosa naturale autofluorescente in DPI è mostrata qui. Dopo questa procedura, altri esperimenti di ingegneria tissutale possono rispondere ad altre domande, come ad esempio come l'allineamento e la comunicazione cellulare influenzano il successo del trapianto.

Questa tecnica consente ai ricercatori di ingegneria tissutale di esplorare modi complessi di trapiantare più tipi di cellule. Non dimenticare che lavorare con i solventi può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare maschere adeguate e cappucci chimici.