Simulazione pancreatica neuroplasticità:

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare le alterazioni reattive dei neuroni periferici in risposta a diversi microambienti pancreatici. Questo viene ottenuto innanzitutto generando lisati di tessuto intero da pancreas umano normale e da tessuto pancreatico malato. In un secondo passaggio, le cellule dei gangli della radice dorsale (DRG) vengono isolate da ratti neonati e successivamente trattate con i lisati tissutali isolati.

Successivamente, dopo un'incubazione di 48 ore, le cellule vengono fissate per una successiva colorazione a immunofluorescenza doppia. I risultati mostrano le differenze nel modello di ramificazione della densità delle neuriti e nella densità gliale dei neuroni coltivati in diversi estratti tissutali. Questo metodo può contribuire a facilitare studi nel campo della neurogastroenterologia, come il ruolo dei mediatori molecolari e delle alterazioni neuroplastiche in diverse malattie gastrointestinali.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle diverse proprietà neurotrofiche delle malattie pancreatiche, può essere applicato anche ad altri sistemi, come i tumori o gli stati infiammatori dell'intero tratto gastrointestinale. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di utilizzare questo metodo quando abbiamo iniziato le nostre collaborazioni con ricercatori nel campo delle malattie neuropatiche del sistema pediatrico, come la malattia di Ong, adattandolo poi alle nostre esigenze per omogeneizzare il tessuto pancreatico umano. Trasferire cubi di tessuto pancreatico di cinque per cinque per cinque millimetri direttamente da meno 80 gradi Celsius all'azoto liquido.

Quindi posizionare i blocchi congelati prima in tubi per omogeneizzazione che contengono una sfera metallica di dissociazione, quindi inserirli nell'omogeneizzatore tissutale e omogeneizzare senza permettere al tessuto di scongelarsi immediatamente dopo la dissociazione. Risurendere la polvere solida simile a un omogeneato in 300-500 microlitri di PBS 0,1 X ghiacciato. Non utilizzare alcun buffer di lisi poiché ciò potrebbe.

Trasferire i neuroni quindi centrifugare l'omogenato a 21.130 ×g a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti. Raccogliere il soprannatante limpido, che contiene l'estratto tissutale, per raccogliere il soprannatante di linea cellulare da linee cellulari pancreatiche umane. Coltivare le cellule fino a una confluenza del 70-80% in un mezzo di crescita normale.

Quando sono pronte, lavare le cellule almeno tre volte con PBS di grado per colture cellulari e coltivarle in mezzo privo di siero per un massimo di 48 ore. Successivamente, misurare la concentrazione proteica dell'omogenato tissutale o dei supernatanti della linea cellulare mediante il saggio proteico di Bradford. Quindi, aliquotare gli estratti tissutali e i supernatanti della linea cellulare in modo che la concentrazione finale dell'estratto o del supernatante nel mezzo neuronale sia di 100 microgrammi per millilitro.

E conservarli a meno 80 gradi Celsius. Utilizzando un ratto neonato decapitato da P2 a P12, tagliare la pelle ed esporre la colonna vertebrale. Quindi eseguire una laminectomia anteriore per esporre il midollo spinale.

Successivamente, esporre e rimuovere i gangli delle radici dorsali o dRRG. Posizionare il GDR in MEM freddo su ghiaccio, integrato con gentamicina e metronidazolo. Continuare a raccogliere GDR, iniziando dai GDR lombari e procedendo verso i GDR cervicali superiori.

Una volta terminato, vengono raccolti 52 gangli della radice dorsale sufficienti per una piastra a 24 pozzetti. Successivamente, utilizzare forbici microchirurgiche per separare i gangli della radice dorsale dalle rispettive radici e nervi. Quindi rimuovere eventuali proiezioni periferiche e centrali residue.

Dopo il prelievo dei gangli radicolari posteriori (DRG), incubarli in HBSS aggiunto di collagenasi di tipo due a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti. Al termine dell'incubazione, triturare i DRG utilizzando siringhe con diametro decrescente.

Si noti che un'eccessiva tri può distruggere i neuroni ma è meno distruttiva per le cellule gliali. Una volta che il mezzo contenente i gangli della radice dorsale è diventato torbido, centrifugare la sospensione a 93,9 ×g per cinque minuti. Quindi scartare il mezzo e risospendere.

Sospendere le cellule in mezzo basale per neurocolture per prepararle alla coltura. Utilizzare un emocitometro per stimare il numero totale di neuroni e cellule gliali. Quindi seminare le cellule su coprovetrini pre-ricoperti da 13 millimetri.

In una piastra a 24 pozzetti, il rivestimento utilizzato dipende dagli obiettivi sperimentali. Successivamente, aggiungere nei pozzetti il mezzo basale per neuroni e lasciare attaccare le cellule ai pozzetti per tutta la notte. Il giorno seguente, scongelare il mezzo integrato con estratto di tessuto o il mezzo integrato con sopranatante di linea cellulare.

Successivamente, aspirare il mezzo di semina dai gangli radicolari dorsali ed eseguire un eventuale lavaggio molto delicato con PBS. Quindi pipettare lentamente il tessuto, il mezzo supplementato con estratto tessutale o il mezzo sovranatante della linea cellulare supplementato sulle cellule, ottenendo una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro. Lasciare ora crescere le cellelle per 48 ore a 37 gradi Celsius nel mezzo arricchito con estratto tessutale o sovranatante della linea cellulare dopo 48 ore.

Aspirare il mezzo e fissare con paraformaldeide al 4% per la colorazione immunoistochimica. Per la doppia colorazione immunofluorescente, utilizzare marcatori specifici per i neuroni e specifici per la glia per la morfogeometria. Utilizzare un microscopio ottico invertito dotato di una telecamera CCD in combinazione con un software automatizzato per misurare la densità dei neuriti mediante un ingrandimento di 200 x.

Misurare la densità dei neuriti nelle colture neuronali sovrapponendo una griglia di 50 per 50 micron e contando la densità delle fibre per quadrato, misurata in base alle fibre intersecanti. Ripetere questa analisi su quattro diverse regioni con la crescita più densa, su quattro o cinque microfotografie rappresentative per ogni coprislido. Misurare l’outgrowth medio dei neuriti, il numero medio di ramificazioni per neurone, la lunghezza media delle ramificazioni e la dimensione perineuronale, selezionando casualmente 30 neuroni isolati per ogni coprislido, marcando i neuriti e i neuroni peric DRG coltivati con un estratto tissutale da un pancreas normale, come mostrato qui.

Al contrario, i neuroni del ganglio della radice dorsale coltivati con estratti di tessuto di pancreatite cronica o di cancro del pancreas mostrano una densità maggiore di neuriti. Ecco neuroni del plesso mienterico coltivati con vari estratti di tessuto pancreatico umano.

I neuroni del plesso mienterico coltivati in estratti provenienti da pancreatite cronica o da cancro del pancreas sviluppano assoni più lunghi e mostrano un modello di ramificazione più complesso rispetto a quelli coltivati in estratti da pancreas normale. Quando i neuroni dei gangli della radice dorsale sono stati coltivati con il surnatante derivato da cellule tumorali del pancreas, si è osservato un aumento della densità nervosa simile a quello riscontrato con gli estratti tissutali. Tuttavia, tale aumento risultava reversibile quando specifici fattori neurotrofici, come la nostra teina o il fattore di crescita nervosa, venivano rimossi o bloccati.

Le cellule Ggl rispondono inoltre in modo diverso a diversi estratti di tessuto pancreatico, in particolare agli estratti provenienti da pancreatite cronica o da cancro del pancreas, che potenziano la crescita e il conteggio delle cellule gliali nei coltivi di cellule gliali derivati dai gangli della radice dorsale (DRG). Sebbene l'effetto sia più pronunciato con gli estratti di cancro del pancreas rispetto a quelli di pancreatite cronica, una volta acquisita la padronanza della tecnica, questa può essere eseguita in quattro o cinque ore se realizzata correttamente dopo il suo sviluppo.

Questo metodo ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurogastroenterologia per esplorare i meccanismi di neuroplasticità in diverse malattie gastrointestinali, inclusi disturbi infiammatori e maligni dell'apparato digerente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come isolare neuroni periferici per studiare la neuroplasticità pancreatica nel pancreas e di come implementare tale sistema e altre alterazioni neurali, nonché altri saggi di neuroplasticità, nei disturbi gastrointestinali.