Question 1

Come funziona l'interferenza dell'RNA per silenziare i geni in C. elegans?

Accepted Answer

Il RNA a doppio filamento entra nelle cellule di C. elegans dopo l'ingestione. L'enzima Dicer taglia il dsRNA in brevi RNA interferenti (siRNA), lunghi 21-23 nucleotidi. Il siRNA si associa al complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) e si lega all'mRNA bersaglio tramite accoppiamento di basi complementari, portando alla degradazione dell'mRNA e al knockdown del gene.

Question 2

Qual è il primo passo nella preparazione dei batteri per gli esperimenti di RNAi?

Accepted Answer

Trasforma il plasmide che codifica il tuo dsRNA bersaglio nell'ceppo di E. coli HT115(DE3), che manca di RNA polimerasi III e contiene un gene della T7 DNA polimerasi inducibile da IPTG. Trasforma anche i batteri con un plasmide vuoto come controllo. Stendi i batteri trasformati su piastre di agar LB contenenti tetraciclina e carbenicillina, poi incubali tutta la notte a 37°C.

Question 3

Perché la sincronizzazione dei vermi è importante prima del trattamento RNAi?

Accepted Answer

La sincronizzazione delle fasi di sviluppo garantisce che le differenze fenotipiche osservate siano il risultato del knockdown genico piuttosto che della variazione dello sviluppo. Trasferire i vermi L4 sulle piastre RNAi durante la notte a 20°C per diventare giovani adulti, quindi spostarli su nuove piastre per 6-8 ore per deporre le uova. Questo produce progenie sincronizzata per lo sviluppo per l'analisi.

Question 4

Come utilizzano i ricercatori l'RNAi per eseguire schermature genetiche inverse?

Accepted Answer

Gli screening genetici inversi disattivano geni noti da una libreria e valutano i risultati fenotipici per scoprire la funzione genica. I ricercatori coltivano batteri che esprimono dsRNA per molti geni di C. elegans su piastre con molte pozzette e li alimentano ai vermi. Gli effetti fenotipici rivelano le normali funzioni geniche in vivo e possono essere automatizzati per l'analisi ad alto rendimento di migliaia di geni.

Question 5

Che cosa succede durante la fase di preparazione della coltura batterica?

Accepted Answer

Selezionare una singola colonia batterica e aggiungerla a 1 ml di brodo LB con 100 μg/ml di ampicillina. Incubare durante la notte a 37°C con agitazione. Quindi aggiungere 5 ml di brodo LB fresco con ampicillina e incubare 4-6 ore a 37°C. Questa coltura viene poi aggiunta a piastre di vermi RNAi e incubata durante la notte a 37°C per creare un tappeto batterico.

Question 6

Quali fenotipi possono essere osservati quando si analizzano i vermi trattati con RNAi?

Accepted Answer

Confronta i vermi con knockdown di RNAi con i controlli e nota le differenze nelle dimensioni, nello stadio di sviluppo, nella morfologia e nei modelli di localizzazione delle proteine marcate con fluorofori. Gli scienziati possono anche valutare gli effetti sui tempi di sviluppo, come i geni che ritardano lo sviluppo quando vengono silenziati, o i geni coinvolti nell'organo sviluppo e altri processi biologici.

Question 7

Come viene preparata una lastra per microscopio per visualizzare C. elegans?

Accepted Answer

Incollare due vetrini di vetro con del nastro adesivo per etichette come distanziali. Posizionare un vetrino pulito tra di essi e pipettare 150 μl di agar fuso al 4% su di esso. Coprire con un vetrino perpendicolare, quindi separare delicatamente. Aggiungere 10 μl di anestetico azide sodico al cuscinetto di agar, trasferire i vermi utilizzando una bacchetta di platino, aggiungere un vetrino di copertura e osservare al microscopio.

RNAi in C. elegans - Quiz di valutazione