Name: Lanalisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di Drosophila Testicoli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Impara a dissecare e preparare testicoli di Drosophila per microscopia. Questo metodo consente di osservare le diverse fasi della spermatogenesi e identificare difetti cellulari con tecniche di immunofluorescenza.

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Gli autori desiderano ringraziare Michael Anderson per stabilire in laboratorio Lee questi metodi accettati per lo studio della spermatogenesi con la consulenza di esperti da Karen Hales. H. Oda e Y. Akiyama-Oda generosamente fornito la γ-tubulina-GFP volare stock. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione NIH R01 al LAL (GM074044).

1. Testicoli Dissection <ol><li> Anestetizzare mosche in una bottiglia o flacone utilizzando un flusso di CO 2 e trasferire ad un pad mosca. </li><li> In ordine mosche sotto un microscopio da dissezione utilizzando un pennello piccolo, e raccogliere un numero appropriato (seconda dell&#39;esperimento) di maschi di Drosophila dei genotipi desiderati. I maschi giovani (0-2 giorni) sono l&#39;ideale per l&#39;esame delle cellule durante i primi stadi della spermatogenesi (ad esempio spermatogoni, spermatociti e spermatidi precoci post-meiotiche), mentre i maschi leggermente più anziani (2-5 giorni) sono l&#39;ideale per l&#39;esame di cellule nelle fasi finali della spermatogenesi (in particolare, maturo sperma). </li><li> Usare pinze per rimuovere le ali di ogni volo (per evitare che le mosche dal galleggiante nel liquido durante la dissezione). </li><li> Aggiungere ~ 500 ml di tampone fosfato salino (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4; PBS) in una goccia di un piatto dissezione siliconata suuno sfondo nero. Altre soluzioni acquose sono state usate con successo per testicoli dissezione 3. </li><li> Punto pinza verso la parte anteriore della mosca, afferrarlo dal torace, ed immergerlo nella goccia PBS. Durante la visualizzazione attraverso il microscopio da dissezione, utilizzare un altro paio di pinze per afferrare e tirare la genitali esterni (struttura marrone scuro che si trova alla fine posteriore dell&#39;addome ventrale) posteriormente fino a quando si stacca dall&#39;addome. Nella maggior parte dei casi, i testicoli, vescicole seminali e ghiandole accessorie verranno rimossi dall&#39;addome insieme ai genitali esterni, se necessario, introdurre una sola coppia di pinze in addome e giro fuori testicoli. </li><li> Testicoli separati da ghiandole accessorie e genitali esterni con due coppie di pinze nei menu PBS (Figura 2). Wild-type testicoli sono facilmente distinguibili dai tessuti bianchi vicini per il loro colore giallo. Procedere immediatamente alla fase 2. </li><li> Per isolare testicoli dai maschi pharate (i.. E racchiuso nel bozzolo), una fase aggiuntiva deve essere eseguita prima che comporta la rimozione della mosca dal bozzolo; questo passo è stato precedentemente descritto altrove 31. Procedere con dissezione come per i testicoli adulti che iniziano nella fase 1.2. </li><li> Per isolare testicoli dai maschi larvali, eseguire una modifica di un protocollo per isolare ovaie larve di Drosophila 32. Brevemente, larve maschio può essere distinto da larve femmina dalla presenza di una coppia di grandi strutture chiare ovali (testicoli larvali) incorporati nel terzo posteriore del corpo grasso. Per isolare testicoli larvali, parzialmente scorticato aprire la larva maschio per isolare i testicoli e il corpo grasso circostante dall&#39;addome come descritto per l&#39;isolamento delle ovaie larvali. Procedere immediatamente alla fase 2 del protocollo qui descritto, i testicoli possono poi essere rimossi dal corpo grasso appena prima del montaggio (passi 2.3 o 3.14) come descritto per le ovaie 32. </li></ol><ol><li> Utilizzare un paio di pinze per inserire delicatamente 2-3 paia di testicoli in una goccia di 4-5 ml di PBS in una piazza copertura in vetro antiscivolo. Si noti che il rapporto tra numero di testicoli di volume di PBS può essere necessario regolare: troppo liquido impedire alle cellule di diffondere correttamente quando schiacciato, mentre troppo poco liquido indurre le cellule a scoppiare quando schiacciato. Facoltativo: Utilizzare copertura siliconata scivola per ridurre al minimo l&#39;aderenza del tessuto per coprire scivolare nella fase 3.2. </li><li> Usare un paio di pinze per lacerare ogni testicolo in una posizione appropriata in modo da massimizzare la presenza dei tipi di cellule germinali desiderati nella preparazione (si noti che il contenuto del testicolo saranno principalmente uscita dalla regione lacerata sul vetrino durante lo schiacciamento passo.) Per arricchire di spermatogoni e spermatociti, strappare aprire il testicolo adiacente alla sua estremità apicale (livello 1, Figura 2B). Per arricchire di spermatociti e spermatidi, strappo aprire il testicolo in un position leggermente basale al livello 1 (livello 2, Figura 2B). Per arricchire le cellule germinali più mature, strappare aperto il testicolo più vicino a dove la curvatura inizia (livello 3, Figura 2B). </li><li> Posizionare delicatamente un vetrino per microscopio sul vetrino di schiacciare i testicoli; non applicare pressione manualmente come il solo peso della copertura antiscivolo è sufficiente per ottenere un campione correttamente schiacciata. Cercate di evitare di intrappolare bolle d&#39;aria. Facoltativo: Utilizzo poli-L-lisina rivestite vetrini da microscopio per promuovere l&#39;adesione del tessuto a scorrere nel passaggio 3.2. </li><li> Utilizzare preparazione immediatamente (idealmente entro 15 minuti dalla preparazione) per osservare cellule vive mediante microscopia a contrasto di fase, per le mosche transgeniche con l&#39;espressione di proteine ​​con targhetta modo fluorescente nei testicoli, cellule vive possono essere esaminate al microscopio a fluorescenza in questa fase. In alternativa, procedere alla fissazione e colorazione anticorpo (Protocol 3). </li><li> Stoppino delicatamente il liquido in eccesso da sotto il vetrino con una pulizia wipe consentire appiattimento della preparazione finché le cellule germinali sono chiaramente a fuoco. </li></ol> 3. Formaldeide fissazione e colorazione anticorpale <ol><li> Snap congelare ogni diapositiva contenente testicoli schiacciati (dal protocollo 2) usando un paio di pinze di metallo per immergere brevemente in azoto liquido (fino azoto liquido si ferma bubbling). </li><li> Rimuovere immediatamente la polizza di copertura con una lama di rasoio. </li><li> Utilizzare pinze di metallo per trasferire le diapositive in una prechilled portavetrini bicchiere pieno di ghiaccio-freddo etanolo al 95% (grado spettrofotometrica, privo di metanolo). Conservare a -20 ° C per 10 min. </li><li> Utilizzare metallo molle a trasferire vetrini per un rack scorrevole in vetro riempita con formaldeide al 4% in PBS più 0,1% Triton X-100 (PBS-T). Conservare a temperatura ambiente per 7 min. </li><li> Utilizzare pinze di metallo per trasferire le diapositive di un rack scorrevole in vetro riempita con PBS. Lavare i vetrini in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere 1x. Eseguire tutti i lavaggi scartando la soluzione nel rack vetrino ( <em&gt; Ie. versando fuori) e sostituzione con soluzione fresca. </li><li> Eliminare il PBS e immergere i vetrini in PBS-T per 30 min a temperatura ambiente per permeabilize membrane cellulari. </li><li> Lavare i vetrini in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere 2x. </li><li> Blocco passo (opzionale): Immergere i vetrini in PBS più 1% BSA per 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio sul vetrino intorno tessuto schiacciato (facilmente visibile a occhio) al fine di limitare le soluzioni di anticorpi (aggiunte in fasi 3.9 e 3.11). Il tessuto deve essere tenuto umido in ogni momento durante l&#39;esecuzione di immunoistochimica. </li><li> Aggiungere 30-40 ml di anticorpo primario (diluito in PBS-T, 1:400 a 1:50, secondo anticorpo) al tessuto all&#39;interno del cerchio. Se è stato eseguito il blocco, diluire l&#39;anticorpo primario in PBS-T più 1% BSA. Anti-gamma-tubulina anticorpo (per la colorazione di cntrosome in Figura 4) è stato diluito 1:100. Incubare in un umido, camera oscura (scatola di plastica per es. Chiusocon asciugamani umidi di carta) per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C. </li><li> Lavare i vetrini in PBS per 5 min a 3x camera di temperatura. Se è effettuata blocco, lavare due volte in PBS-T e una volta in PBS (5 min a temperatura ambiente ciascuna). </li><li> Aggiungere 30-40 ml di anticorpo secondario coniugato con fluoroforo (diluito 1:400 in PBS) per il tessuto e incubare al buio per 1-2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere 2x. </li><li> Aggiungere 30-40 ml di soluzione di DAPI (0,2 mg / ml in PBS) per il tessuto all&#39;interno del cerchio. </li><li> Posizionare delicatamente una scivolata copertura in vetro sopra il tessuto, avendo cura di evitare di intrappolare bolle d&#39;aria. Se devono apparire bolle d&#39;aria, muoversi con attenzione intorno la polizza di copertura senza distruggere la zucca fino a quando le bolle sfuggire ai lati del vetrino. </li><li> Utilizzare una pulizia wipe per cancellare l&#39;eccesso DAPI dai bordi della diapositiva. </li><li> Sigillare la polizza di copertura al vetrino con smalto trasparente. </li><li> Utilizzare questa preparazioneentro i prossimi 3-4 ore per vedere le cellule immunostained mediante microscopia a fluorescenza. Per la conservazione a lungo termine di diapositive (almeno fino a diverse settimane), utilizzare un supporto di montaggio dura a base di glicerolo-con DAPI, e conservare i vetrini a -20 ˚ C. </li><li> In alternativa, i campioni fissare in metanolo al posto di formaldeide (secondo l&#39;antigene). Dopo aver completato l&#39;intero protocollo di passaggio 3.2, immergere i vetrini di testicoli schiacciati in metanolo per 10 minuti a -20 ° C e procedere con passo 3.5 in poi. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Anche se i testicoli di wild-type mosche possono essere facilmente identificati grazie al loro colore giallo (in contrasto con i tessuti bianchi vicini), i testicoli di mosche mutanti bianchi sono bianchi e quindi può occasionalmente essere confusi con l&#39;intestino. Ceppi più transgenici, tipicamente in uno sfondo bianco, hanno anche testicoli bianchi perché il mini-bianco gene trovato P-elementi non promuove l&#39;accumulo di pigmento nei testicoli. Quando testicoli Drosophila...

Testicoli Drosophila sono un sistema modello ideale per lo studio di molti processi biologici che comprendono la regolazione delle cellule staminali, meiosi e sviluppo dello sperma 13-18. Gli spermatociti ed i loro fusi meiotiche sono grandi e quindi conveniente per l&#39;analisi citologica e rilassato checkpoint del ciclo cellulare durante la spermatogenesi facilitano lo studio delle mutazioni nei geni del ciclo cellulare. Diversi tipi di cellule possono essere osservati in progressione ordinata lungo la lunghezza dei testicoli, e qualsiasi problema nella spermatogenesi può portare a cambiamenti in questa disposizione complessiva. Queste caratteristiche combinate con strumenti genetici Drosophila hanno facilitato l&#39;analisi mutazionale della spermatogenesi 21-23. Le fasi di spermatogenesi Drosophila sono stati ben definiti. Cellule germinali che si sviluppano all&#39;interno sincrono cisti progrediscono sequenzialmente attraverso le fasi della spermatogenesi lungo la lunghezza del testicolo. Durante both mitotico e divisioni meiotica delle cellule germinali maschili, citochinesi si verifica incompleto tale che le cellule figlie rimangono collegati da ponti citoplasmatici noti come canale chiamato (Figura 1). La punta apicale del testicolo contiene una popolazione di cellule staminali germinali che dà origine a spermatogoni, che subiscono quattro divisioni mitotiche con citochinesi incompleto per generare cisti 16 cellule di spermatociti primari. Dopo la fase di premeiotic S, spermatociti primari entrano G2, un periodo di crescita prolungato di ~ 90 ore durante il quale aumenta il volume cellulare ~ 25 volte. Progressione attraverso meiosi I e meiosi II porta alla formazione di cisti 32 cellulari di spermatociti secondari e cisti 64 cellulari di spermatidi aploidi, rispettivamente. I, spermatidi rotondi immaturi sottoposti a numerosi rimodellamento cellulare per formare spermatozoi maturi. Cellule post-meiotiche, in particolare i fasci di allungamento e spermatidi maturi, occupano gran parte del volume del testicolo. Tegli trasporto successo di sperma funzionale alla linea femminile richiede un coordinamento tra le diverse parti del sistema riproduttivo maschile, che è composto da varie strutture accoppiati (i testicoli, vescicole seminali e ghiandole accessorie) e un unico condotto eiaculatorio (Figura 2). Spermatozoi sono prodotti nei testicoli e memorizzati all&#39;interno delle vescicole seminali fino copulazione 24. Le ghiandole accessorie contengono cellule secretorie che producono liquido seminale. Lo sperma migrazione dalle vescicole seminali sono mescolati con liquido seminale all&#39;interno del condotto eiaculatorio, che è collegato ad entrambe le vescicole seminali e ghiandole accessorie. Questa miscela di sperma e fluido seminale viene infine pompato fuori del maschio nella vagina della femmina volare attraverso il bulbo eiaculatorio situato all&#39;estremità posteriore del maschio addome 25. Le proteine ​​all&#39;interno del liquido seminale sono essenziali per la conservazione prolungata di spermatozoi all&#39;interno degli organi specializzati noto come spermateche in reptratto roductive di Drosophila femmine 26. Metodi eccellenti per l&#39;isolamento dei testicoli Drosophila e visualizzazione delle cellule nelle varie fasi della spermatogenesi sono disponibili nella letteratura scientifica 3-12. Noi qui aggiungiamo a questo corpo di conoscenze con la presentazione di esempi di questi protocolli con un video dimostrativo di accompagnamento. Il protocollo per la preparazione dei testicoli vivi campioni per la microscopia a contrasto di fase si basa su un metodo precedentemente descritto 27. Il protocollo per formaldeide fissazione e immunocolorazione di testicoli si basa su un metodo descritto in precedenza 28. I metodi qui descritti sono stati utilizzati in molti studi di Drosophila spermatogenesi (ad esempio, per valutare i ruoli di dineina, un motore microtubuli Minus estremità rivolta, durante la spermatogenesi Drosophila). Oltre ai protocolli di base, suggerimenti riportati varying la dissezione per arricchire di spermatogoni, spermatociti, o spermatozoi maturi. Diversi metodi di elaborazione dei testicoli tali che le cisti sia rimangono intatti o sono interrotti come necessario descritti. Un vantaggio nell&#39;uso testicoli Drosophila come sistema modello è che, rispetto ai ovociti ed embrioni di Drosophila, anticorpi e coloranti possono facilmente penetrare nelle cellule dopo la loro dispersione dai testicoli, e sono necessarie meno fasi di lavaggio, quindi, protocolli possono essere effettuate in un tempo relativamente breve tempo.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Elastomero siliconico in due parti per la realizzazione di piastre di dissezione rivestite in silicone da Kimax Petri</td></tr><tr><td>Penna PAP</td><td>Fisher Scientific NC9888126</td><td></td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Protettore per unghie trasparente</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento ProLong Gold con DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-gamma-tubulina di topo (clone GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniIgG anti-topo di capra pura</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldeide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Utilizzare secondo le indicazioni del produttore per siliconare i vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0,5 mg/ml in etanolo al 75%; conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Tergicristalli delicati Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo per colorazione in vetro Coplin</td> di biologia molecolare, tappo a vite <td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio smerigliati singoli</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio rivestiti in poli-L-lisina Polysciences</td><td>, Inc.</td><td>22247-1</td><td>Opzionale (per sostituire i vetrini da microscopio non trattati)</td></tr> <tr><td>Vetro di copertura quadrato</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax Petri</td><td>Dish Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015 Pinza EMD</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Modello 5 INOX</td></tr><tr><td>Stereoscopio</td> <td>Stemi 2000-CSObiettivo Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Obiettivo Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analisi citologica della spermatogenesi: preparati live e fisse di<em&gt; drosophila</em&gt; testicoli

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster è un sistema potente modello che è stato ampiamente utilizzato per chiarire una varietà di processi biologici. Ad esempio, gli studi sia del femminile e linee germinali maschili di Drosophila hanno contribuito notevolmente alla comprensione corrente della meiosi e biologia delle cellule staminali. Protocolli eccellenti sono disponibili in letteratura per l&#39;isolamento e l&#39;imaging di Drosophila ovaie e testicoli 3-12. Qui, metodi per la dissezione e la preparazione dei testicoli Drosophila per l&#39;analisi microscopica sono descritti con un video dimostrativo accompagnamento. Un protocollo per isolare testicoli dall&#39;addome dei maschi adulti e preparare vetrini di tessuto reale per l&#39;analisi al microscopio a contrasto di fase e un protocollo per il fissaggio e immunocolorazione testicoli per l&#39;analisi al microscopio a fluorescenza sono rappresentati. Queste tecniche possono essere applicate nella caratterizzazione di mutanti di Drosophila che esibiscono defects nella spermatogenesi e nella visualizzazione delle localizzazioni subcellulari di proteine.

Un esempio di una coppia correttamente sezionato di organi riproduttivi maschili Drosophila è mostrato in Figura 2A. Testicoli rimossi dall&#39;addome della mosca maschio adulto sono tipicamente collegati al condotto eiaculatorio (marrone, Figura 2A &#39;) ed una coppia di ghiandole accessorie (verde, Figura 2A&#39;) tramite una coppia di vescicole seminali (blu, Figura 2A &#39;) . Per separare i testicoli dalla maggior parte del tessuto somati...

Metodi per isolare e preparare Drosophila testicoli campioni (vivere e fissa) per l&#39;imaging dal contrasto di fase e microscopia a fluorescenza sono descritte qui.

L&#39;analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicoli

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare e preparare i testicoli di oph per la microscopia. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando le coppie di testicoli dall'addome di moscerini maschi. Il secondo passaggio consiste nello strappare i testicoli al livello di sviluppo appropriato e nello schiacciarli per rilasciare le cellule contenute al loro interno.Successivamente, i testicoli schiacciati vengono fissati e quindi incubati con anticorpi primari e secondari. L'ultimo passaggio consiste nel montare il tessuto su un vetrino per l'analisi mediante microscopia. Infine, si utilizza la microscopia a contrasto di fase o la microscopia a immunofluorescenza per osservare le cellule in diverse fasi della spermatogenesi, valutandone difetti e morfologia, nonché le localizzazioni subcellulari di diverse proteine.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come l'identificazione dei ruoli cruciali delle proteine durante il processo di spermatogenesi. La dimostrazione visiva della dissezione dei testicoli di RAs è fondamentale perché un principiante potrebbe inizialmente avere difficoltà a localizzare i testicoli all'interno dell'addome della mosca. Inoltre, è più facile mostrare piuttosto che descrivere a parole il modo più efficace per schiacciare il tessuto.Per iniziare la dissezione, anestetizzare le mosche in un flacone o in una provetta utilizzando un flusso di anidride carbonica. Successivamente, trasferire le mosche anestetizzate su un apposito supporto per mosche. Separare le mosche al microscopio stereoscopico utilizzando un piccolo pennello per raccogliere circa sei-otto maschi oph del genotipo desiderato.Successivamente, rimuovere le ali di ciascuna mosca con una pinzetta. Questo impedirà alle mosche di galleggiare nel liquido. Durante la dissezione, aggiungere 500 microlitri di soluzione salina fosfato tampone o PBS in un'unica goccia su una piastra di dissezione rivestita in silicone su sfondo nero.Quindi orientare la pinzetta verso l'estremit&agrave; anteriore di una delle mosche prive di ali. Afferrarla per il torace ed immergerla nella goccia di PBS. Identificare la struttura marrone scuro situata all'estremit&agrave; posteriore dell'addome ventrale e utilizzare un'altra coppia di pinzette per afferrare e tirare posteriormente le genitali esterne finch&eacute; non si staccano dall'addome.Nella maggior parte dei casi, i testicoli, le vescicole seminali e la ghiandola accessoria verranno rimossi dall'addome insieme alle ghiandole genitali esterne. Tuttavia, se così non fosse, inserire una coppia di pinze nell'addome ed estrarre delicatamente i testicoli. Separare i testicoli dalle ghiandole accessorie e dalle ghiandole genitali esterne utilizzando due coppie di pinze.Individuare i testicoli di tipo selvatico rispetto ai tessuti bianchi adiacenti grazie al loro colore giallo. Per preparare il campione per l'immagine in tempo reale, utilizzare una pinzetta per posizionare delicatamente due o tre paia di testicoli in una goccia di PBS di quattro-cinque microlitri su un coprioggetto quadrato di vetro. Successivamente, strappare.Aprire ciascun testicolo con una pinzetta a un livello posizionato in modo appropriato per massimizzare la presenza dei tipi cellulari della linea germinale desiderati nel preparato. Il contenuto dei testicoli fuoriescirà dalla zona lacerata e si depositerà sul vetrino. Durante il passaggio di schiacciamento per arricchire la popolazione di spermatogoni e spermatociti, aprire i testicoli in prossimità della loro estremità apicale.Per gli spermatociti e gli spermatidi, aprire con uno strappo i testicoli in una posizione leggermente basale rispetto al livello uno, per arricchire la popolazione di cellule della linea germinale più mature. Aprire con uno strappo i testicoli più vicino al punto in cui inizia la curvatura. Il passo successivo consiste nello schiacciare i testicoli posizionando delicatamente un vetrino microscopico sopra il coprioggetto.Non applicare pressione manualmente ed evitare di intrappolare bolle d'aria. Utilizzare il campione entro 15 minuti dalla preparazione per osservare cellule vive. Mediante microscopia a contrasto di fase, rimuovere delicatamente con un fazzoletto pulito il liquido in eccesso da sotto il vetrino coprioggetto, consentendo l'appiattimento del preparato fino a quando le cellule germinali non risultano chiaramente a fuoco.Congelare rapidamente i vetrini preparati contenenti testicoli schiacciati immergendoli con una pinza metallica in azoto liquido fino a quando le bolle non cessano. Rimuovere immediatamente il coprioggetto con una lametta. Successivamente trasferire i vetrini con la pinza metallica in un portavetrini di vetro preraffreddato riempito con etanolo al 95% ghiacciato e conservare il campione a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti.Trasferire i vetrini equilibrati su una griglia per vetrini in vetro riempita con formaldeide al 4% in PBS contenente 0,1% di Triton X-100 o PBST e conservare a temperatura ambiente per sette minuti. Successivamente, trasferire i vetrini su una griglia riempita con PBS. Lavare i vetrini in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente scartando la soluzione nella griglia e sostituendola con soluzione fresca di PBS.Ripetere il lavaggio una volta. Scartare il PBS e immergere i vetrini in PBST per 30 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le membrane cellulari. Quindi lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente; tracciare un cerchio attorno al tessuto schiacciato sul vetrino utilizzando una penna con barriera idrofoba, al fine di confinare le soluzioni di anticorpi e mantenere il tessuto costantemente umido durante l'esecuzione dell'immunomarcatura.Quindi aggiungere da 30 a 40 microlitri di anticorpo primario diluito in PBST al tessuto all'interno del cerchio. Incubare il vetrino in una camera umida al buio per due ore a temperatura ambiente oppure per tutta la notte a quattro gradi Celsius dopo l'incubazione con l'anticorpo primario. Lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi aggiungere da 30 a 40 microlitri di un anticorpo secondario coniugato con fluorocromo, diluito in PBS, al tessuto e incubare al buio per una o due ore a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Poi aggiungere da 30 a 40 microlitri di soluzione DAPI al tessuto all'interno del cerchio.Posizionare delicatamente un coprioggetto in vetro sul tessuto, avendo particolare cura di evitare di intrappolare bolle d'aria. Se compaiono bolle d'aria, spostare con attenzione il coprioggetto senza danneggiare il campione, finché le bolle non fuoriescono dai lati del vetrino. Asportare con un fazzoletto da pulizia l'eccesso di liquido dai bordi del vetrino.Quindi sigillare il vetrino con lo smalto per unghie ed esaminare le cellule immunoistochimiche mediante microscopio a fluorescenza entro tre o quattro ore. Questa illustrazione mostra la localizzazione dei diversi livelli di maturazione cellulare all'interno dei testicoli di Drosophila. Il livello uno contiene cellule più giovani che si trovano nelle fasi iniziali della spermatogenesi, mentre il livello tre contiene cellule spermatiche più mature.Il livello due contiene una popolazione mista di cellule germinali in mitosi e post-mitotiche. Un'immagine corrispondente in contrasto di fase mostra il rilascio di spermatogoni e di spermatociti primari precoci e tardivi quando i testicoli vengono lacerati al livello uno. La freccia gialla indica anche la fusione di due o più cellule interconnesse dovuta a una citocinesi incompleta.Un artefatto della procedura di schiacciamento mostrata qui è un'immagine corrispondente in contrasto di fase che evidenzia il rilascio di spermatociti primari tardivi e cellule post-meiotiche, inclusi spermatidi rotondi, spermatidi in allungamento e spermatozoi maturi, quando i testicoli sono stati lacerati al livello due. L'analisi in microscopia a contrasto di fase dei testicoli schiacciati può essere utilizzata anche per identificare con facilità difetti negli abbondanti spermatidi rotondi. Qui sono mostrati spermatidi di tipo selvaggio con un nucleo chiaro in fase, legati a un aggregato mitocondriale singolo scuro in fase di dimensioni approssimativamente uguali.Al contrario, gli spermatidi provenienti da testicoli Aun contengono numerosi nuclei piccoli e un grande aggregato mitocondriale a causa del fallimento della citocinesi e di errori nella segregazione dei cromosomi. Le immagini in scala di grigi mostrate qui provengono da una preparazione di testicoli schiacciati, colorati con reagenti che identificano in colore i microtubuli, il DNA e i centrosomi. Le immagini combinate mostrano uno spermatocita in divisione, un'ampia zona di spermatidi rotondi e un fascio di spermatozoi maturi. Una volta acquisita la tecnica, la preparazione dei campioni per microscopia a contrasto di fase può essere eseguita in 20-30 minuti.La preparazione dei campioni per la microscopia a fluorescenza immunologica può essere completata in sei ore se eseguita correttamente. Oltre all'elaborazione dei testicoli di oph per la microscopia, i testicoli dissecati possono essere utilizzati alternativamente per l'analisi biochimica delle proteine.

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