L'analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di

L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare e preparare i testicoli di oph per la microscopia. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando le coppie di testicoli dall'addome di moscerini maschi. Il secondo passaggio consiste nello strappare i testicoli al livello di sviluppo appropriato e nello schiacciarli per rilasciare le cellule contenute al loro interno.

Successivamente, i testicoli schiacciati vengono fissati e quindi incubati con anticorpi primari e secondari. L'ultimo passaggio consiste nel montare il tessuto su un vetrino per l'analisi mediante microscopia. Infine, si utilizza la microscopia a contrasto di fase o la microscopia a immunofluorescenza per osservare le cellule in diverse fasi della spermatogenesi, valutandone difetti e morfologia, nonché le localizzazioni subcellulari di diverse proteine.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come l'identificazione dei ruoli cruciali delle proteine durante il processo di spermatogenesi. La dimostrazione visiva della dissezione dei testicoli di RAs è fondamentale perché un principiante potrebbe inizialmente avere difficoltà a localizzare i testicoli all'interno dell'addome della mosca. Inoltre, è più facile mostrare piuttosto che descrivere a parole il modo più efficace per schiacciare il tessuto.

Per iniziare la dissezione, anestetizzare le mosche in un flacone o in una provetta utilizzando un flusso di anidride carbonica. Successivamente, trasferire le mosche anestetizzate su un apposito supporto per mosche. Separare le mosche al microscopio stereoscopico utilizzando un piccolo pennello per raccogliere circa sei-otto maschi oph del genotipo desiderato.

Successivamente, rimuovere le ali di ciascuna mosca con una pinzetta. Questo impedirà alle mosche di galleggiare nel liquido. Durante la dissezione, aggiungere 500 microlitri di soluzione salina fosfato tampone o PBS in un'unica goccia su una piastra di dissezione rivestita in silicone su sfondo nero.

Quindi orientare la pinzetta verso l'estremità anteriore di una delle mosche prive di ali. Afferrarla per il torace ed immergerla nella goccia di PBS. Identificare la struttura marrone scuro situata all'estremità posteriore dell'addome ventrale e utilizzare un'altra coppia di pinzette per afferrare e tirare posteriormente le genitali esterne finché non si staccano dall'addome.

Nella maggior parte dei casi, i testicoli, le vescicole seminali e la ghiandola accessoria verranno rimossi dall'addome insieme alle ghiandole genitali esterne. Tuttavia, se così non fosse, inserire una coppia di pinze nell'addome ed estrarre delicatamente i testicoli. Separare i testicoli dalle ghiandole accessorie e dalle ghiandole genitali esterne utilizzando due coppie di pinze.

Individuare i testicoli di tipo selvatico rispetto ai tessuti bianchi adiacenti grazie al loro colore giallo. Per preparare il campione per l'immagine in tempo reale, utilizzare una pinzetta per posizionare delicatamente due o tre paia di testicoli in una goccia di PBS di quattro-cinque microlitri su un coprioggetto quadrato di vetro. Successivamente, strappare.

Aprire ciascun testicolo con una pinzetta a un livello posizionato in modo appropriato per massimizzare la presenza dei tipi cellulari della linea germinale desiderati nel preparato. Il contenuto dei testicoli fuoriescirà dalla zona lacerata e si depositerà sul vetrino. Durante il passaggio di schiacciamento per arricchire la popolazione di spermatogoni e spermatociti, aprire i testicoli in prossimità della loro estremità apicale.

Per gli spermatociti e gli spermatidi, aprire con uno strappo i testicoli in una posizione leggermente basale rispetto al livello uno, per arricchire la popolazione di cellule della linea germinale più mature. Aprire con uno strappo i testicoli più vicino al punto in cui inizia la curvatura. Il passo successivo consiste nello schiacciare i testicoli posizionando delicatamente un vetrino microscopico sopra il coprioggetto.

Non applicare pressione manualmente ed evitare di intrappolare bolle d'aria. Utilizzare il campione entro 15 minuti dalla preparazione per osservare cellule vive. Mediante microscopia a contrasto di fase, rimuovere delicatamente con un fazzoletto pulito il liquido in eccesso da sotto il vetrino coprioggetto, consentendo l'appiattimento del preparato fino a quando le cellule germinali non risultano chiaramente a fuoco.

Congelare rapidamente i vetrini preparati contenenti testicoli schiacciati immergendoli con una pinza metallica in azoto liquido fino a quando le bolle non cessano. Rimuovere immediatamente il coprioggetto con una lametta. Successivamente trasferire i vetrini con la pinza metallica in un portavetrini di vetro preraffreddato riempito con etanolo al 95% ghiacciato e conservare il campione a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti.

Trasferire i vetrini equilibrati su una griglia per vetrini in vetro riempita con formaldeide al 4% in PBS contenente 0,1% di Triton X-100 o PBST e conservare a temperatura ambiente per sette minuti. Successivamente, trasferire i vetrini su una griglia riempita con PBS. Lavare i vetrini in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente scartando la soluzione nella griglia e sostituendola con soluzione fresca di PBS.

Ripetere il lavaggio una volta. Scartare il PBS e immergere i vetrini in PBST per 30 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le membrane cellulari. Quindi lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente; tracciare un cerchio attorno al tessuto schiacciato sul vetrino utilizzando una penna con barriera idrofoba, al fine di confinare le soluzioni di anticorpi e mantenere il tessuto costantemente umido durante l'esecuzione dell'immunomarcatura.

Quindi aggiungere da 30 a 40 microlitri di anticorpo primario diluito in PBST al tessuto all'interno del cerchio. Incubare il vetrino in una camera umida al buio per due ore a temperatura ambiente oppure per tutta la notte a quattro gradi Celsius dopo l'incubazione con l'anticorpo primario. Lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi aggiungere da 30 a 40 microlitri di un anticorpo secondario coniugato con fluorocromo, diluito in PBS, al tessuto e incubare al buio per una o due ore a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Poi aggiungere da 30 a 40 microlitri di soluzione DAPI al tessuto all'interno del cerchio.

Posizionare delicatamente un coprioggetto in vetro sul tessuto, avendo particolare cura di evitare di intrappolare bolle d'aria. Se compaiono bolle d'aria, spostare con attenzione il coprioggetto senza danneggiare il campione, finché le bolle non fuoriescono dai lati del vetrino. Asportare con un fazzoletto da pulizia l'eccesso di liquido dai bordi del vetrino.

Quindi sigillare il vetrino con lo smalto per unghie ed esaminare le cellule immunoistochimiche mediante microscopio a fluorescenza entro tre o quattro ore. Questa illustrazione mostra la localizzazione dei diversi livelli di maturazione cellulare all'interno dei testicoli di Drosophila. Il livello uno contiene cellule più giovani che si trovano nelle fasi iniziali della spermatogenesi, mentre il livello tre contiene cellule spermatiche più mature.

Il livello due contiene una popolazione mista di cellule germinali in mitosi e post-mitotiche. Un'immagine corrispondente in contrasto di fase mostra il rilascio di spermatogoni e di spermatociti primari precoci e tardivi quando i testicoli vengono lacerati al livello uno. La freccia gialla indica anche la fusione di due o più cellule interconnesse dovuta a una citocinesi incompleta.

Un artefatto della procedura di schiacciamento mostrata qui è un'immagine corrispondente in contrasto di fase che evidenzia il rilascio di spermatociti primari tardivi e cellule post-meiotiche, inclusi spermatidi rotondi, spermatidi in allungamento e spermatozoi maturi, quando i testicoli sono stati lacerati al livello due. L'analisi in microscopia a contrasto di fase dei testicoli schiacciati può essere utilizzata anche per identificare con facilità difetti negli abbondanti spermatidi rotondi. Qui sono mostrati spermatidi di tipo selvaggio con un nucleo chiaro in fase, legati a un aggregato mitocondriale singolo scuro in fase di dimensioni approssimativamente uguali.

Al contrario, gli spermatidi provenienti da testicoli Aun contengono numerosi nuclei piccoli e un grande aggregato mitocondriale a causa del fallimento della citocinesi e di errori nella segregazione dei cromosomi. Le immagini in scala di grigi mostrate qui provengono da una preparazione di testicoli schiacciati, colorati con reagenti che identificano in colore i microtubuli, il DNA e i centrosomi. Le immagini combinate mostrano uno spermatocita in divisione, un'ampia zona di spermatidi rotondi e un fascio di spermatozoi maturi. Una volta acquisita la tecnica, la preparazione dei campioni per microscopia a contrasto di fase può essere eseguita in 20-30 minuti.

La preparazione dei campioni per la microscopia a fluorescenza immunologica può essere completata in sei ore se eseguita correttamente. Oltre all'elaborazione dei testicoli di oph per la microscopia, i testicoli dissecati possono essere utilizzati alternativamente per l'analisi biochimica delle proteine.