Drosophila melanogaster è un organismo modello ampiamente studiato grazie alla sua versatilità e facilità d'uso.
L'immunoistochimica eseguita su preparati larvali di Drosophila è un metodo inestimabile in grado di fornire informazioni sulla presenza, la posizione e la co-localizzazione delle proteine.
Questo video coprirà i metodi essenziali per la dissezione, la fissazione, il blocco e il montaggio del tessuto larvale di Drosophila ed esempi delle loro applicazioni.
L'immunoistochimica è un processo che utilizza anticorpi modificati per colpire, legare e infine visualizzare proteine specifiche nei tessuti.
L'immunoistochimica della larva di Drosophila dipende da una corretta dissezione, che richiede precisione e tempestività a causa della sensibilità del tessuto larvale.
La dissezione viene in genere eseguita in soluzione salina tamponata con fosfato, o "PBS" in breve.
Al momento dell'estrazione gli organi vengono temporaneamente posti in PBS - una soluzione salina con lo stesso pH del pH interno della larva.
Dopo la dissezione il passo successivo nella larva di Drosophila IHC è la fissazione.
La fissazione è un processo in cui il tessuto viene posto in una soluzione diluita a base di formaldeide, che preserva il tessuto.
Questa soluzione fissanti previene la degradazione enzimatica delle proteine nei tessuti.
Dopo la fissazione, si verificano diverse fasi di lavaggio durante il processo di immunocolorazione utilizzando PBS contenente Triton-X, chiamato PBST.
Triton-X100 fornisce una piccola quantità di detergente che funge da interruttore di tensione superficiale e permeabilizza la cellula, consentendo l'ingresso di anticorpi e altri reagenti.
Dopo la fissazione e il lavaggio, il tessuto è pronto per il blocco.
La soluzione bloccante contiene proteine che si legano ai tessuti e occupano siti di legame non specifici a cui gli anticorpi specifici del bersaglio aderirebbero altrimenti. Il blocco aiuta a prevenire un segnale proteico falso positivo.
Dopo aver bloccato il tessuto viene preparato per la colorazione.
La colorazione incorpora un anticorpo "primario" altamente specifico che si lega a una proteina bersaglio chiamata antigene.
Un anticorpo "secondario" coniugato a una molecola reporter lega l'anticorpo primario.
La molecola reporter emette un segnale localizzato che può essere visualizzato, che è spesso di natura fluorescente.
Dopo ogni fase di incubazione degli anticorpi, l'eccesso di anticorpi viene lavato via per rimuovere eventuali anticorpi che si sono legati in modo non specifico.
Dopo il processo di colorazione, il campione deve essere montato.
Per vedere i risultati della colorazione, il tessuto deve essere attentamente montato su vetrini.
Un reagente spesso o un mezzo di montaggio viene utilizzato per racchiudere il tessuto.
Il campione è quindi pronto per essere visualizzato al microscopio.
Ora che abbiamo esaminato i principi dell'immunoistochimica della Drosophila, siamo pronti a vedere come è fatto.
In questo video ci concentreremo sui reagenti, gli strumenti e i processi utilizzati nell'immunoistochimica del cervello larvale della Drosophila a partire dalla fissazione.
Il processo che stiamo seguendo utilizza l'intero cervello ed è noto come colorazione dell'intero monte.
Mentre la procedura di dissezione differisce a seconda del tipo di tessuto utilizzato per l'esperimento, i passaggi principali di IHC rimangono gli stessi, quindi salteremo alla fase di fissazione.
Una volta completata la dissezione del cervello larvale, rimuovere PBS con una pipetta.
Aggiungi fissativo e incuba secondo il tuo protocollo specifico, per l'uso del cervello 23 min.
Dopo la fissazione, lavare i campioni quattro volte in PBST.
Incubare i campioni in soluzione bloccante per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
Utilizzando le diluizioni appropriate, incubare in soluzione anticorpale primaria durante la notte a 4 °C.
Dopo il periodo di incubazione lavare i cervelli quattro volte in PBST con una punta di pipetta a temperatura ambiente.
Incubare i campioni in anticorpi secondari durante la notte a 4 °C al buio per evitare che i fluorofori si sbianchino.
Ancora una volta, lava il cervello quattro volte in PBST.
Equilibrare il cervello nel mezzo di montaggio per un'ora.
Dopo l'equilibrio trasferire il cervello su una diapositiva usando una pipetta p200 con la punta tagliata.
Posizionare i distanziatori attorno al campione per evitare che venga schiacciato.
Posizionare una coverslip sopra i campioni.
Sigillare i bordi antiscivolo con lo smalto per unghie. I cervelli larvali sono ora pronti per essere visualizzati con l'immunoistochimica
Ora che abbiamo trattato l'immunoistochimica del cervello di Drosophila, esaminiamo alcuni modi alternativi di applicare le procedure IHC.
Tecniche alternative di dissezione e fissazione possono essere utilizzate per preparare la larva di Drosophila per l'imaging.
In questo esperimento, i ricercatori vogliono imparare come le cellule generano forme specifiche.
Lo fanno tracciando le morfologie delle cellule terminali tracheali larvali.
I ricercatori sfruttano una linea di mosca mutante che esprime GFP.
L'espressione GFP è indotta dall'esposizione al calore a bagnomaria
Le larve sono selezionate al microscopio di dissezione con fluorescenza.
Le mosche che emettono fluorescenza indicano un'attivazione riuscita della GFP.
Queste mosche sono sottoposte a una forma alternativa di fissazione per calore; non è necessaria alcuna dissezione.
Dopo aver utilizzato il software per aiutare il tracciamento, vengono identificate le morfologie cellulari dei rami tracheali e del lume.
L'ovaio Drosophila è un modello eccellente per capire come le cellule staminali interagiscono con il loro ambiente cellulare.
L'IHC delle ovaie di Drosophila inizia identificando le femmine di Drosophila per presenza di ovaie rispetto ai testicoli, che sono evidenti nei maschi.
Le larve femminili raccolte vengono trasferite in singoli pozzi dove vengono accuratamente sezionate per ottenere una struttura nota come corpo grasso, che ospita le ovaie.
I corpi grassi sono fissi e macchiati, e quindi - dopo aver posizionato il tessuto su vetrini - le ovaie vengono separate dal tessuto corporeo grasso. Dopo aver montato e visualizzato i vetrini, la colorazione fluorescente rivela la posizione delle cellule somatiche e delle cellule germinali primordiali nell'ovaio larvale .
L'immunoistochimica delle larve di Drosophila ha molti paralleli con l'IHC pupale e adulto.
Ad esempio, i ricercatori possono utilizzare IHC per esaminare le retine di Drosophila in diversi stadi di sviluppo: larvale, pupale e adulto, illustrando così la differenza tra le procedure immunoistochimiche pupali, larvali e adulte.
I risultati mostrano le varie fasi di sviluppo delle retine di Drosophila.
L'immunoistochimica della larva di Drosophila è uno strumento con una grande quantità di applicazioni e variazioni. In questo video abbiamo trattato le procedure per immunocolorare le larve tra cui dissezione, fissazione, colorazione e montaggio. Grazie per l'attenzione!
L'immunoistochimica (IHC) è una tecnica utilizzata per visualizzare la presenza e la posizione delle proteine all'interno dei tessuti. Le larve di Dro…
Drosophila melanogaster è un organismo modello ampiamente studiato grazie alla sua versatilità e facilità d'uso.
L'immunoistochimica eseguita su preparati larvali di Drosophila è un metodo inestimabile in grado di fornire informazioni sulla presenza, la posizione e la co-localizzazione delle proteine.
Questo video coprirà i metodi essenziali per la dissezione, la fissazione, il blocco e il montaggio del tessuto larvale di Drosophila ed esempi delle loro applicazioni.
L'immunoistochimica è un processo che utilizza anticorpi modificati per colpire, legare e infine visualizzare proteine specifiche nei tessuti.
L'immunoistochimica della larva di Drosophila dipende da una corretta dissezione, che richiede precisione e tempestività a causa della sensibilità del tessuto larvale.
La dissezione viene in genere eseguita in soluzione salina tamponata con fosfato, o "PBS" in breve.
Al momento dell'estrazione gli organi vengono temporaneamente posti in PBS - una soluzione salina con lo stesso pH del pH interno della larva.
Dopo la dissezione il passo successivo nella larva di Drosophila IHC è la fissazione.
La fissazione è un processo in cui il tessuto viene posto in una soluzione diluita a base di formaldeide, che preserva il tessuto.
Questa soluzione fissanti previene la degradazione enzimatica delle proteine nei tessuti.
Dopo la fissazione, si verificano diverse fasi di lavaggio durante il processo di immunocolorazione utilizzando PBS contenente Triton-X, chiamato PBST.
Triton-X100 fornisce una piccola quantità di detergente che funge da interruttore di tensione superficiale e permeabilizza la cellula, consentendo l'ingresso di anticorpi e altri reagenti.
Dopo la fissazione e il lavaggio, il tessuto è pronto per il blocco.
La soluzione bloccante contiene proteine che si legano ai tessuti e occupano siti di legame non specifici a cui gli anticorpi specifici del bersaglio aderirebbero altrimenti. Il blocco aiuta a prevenire un segnale proteico falso positivo.
Dopo aver bloccato il tessuto viene preparato per la colorazione.
La colorazione incorpora un anticorpo "primario" altamente specifico che si lega a una proteina bersaglio chiamata antigene.
Un anticorpo "secondario" coniugato a una molecola reporter lega l'anticorpo primario.
La molecola reporter emette un segnale localizzato che può essere visualizzato, che è spesso di natura fluorescente.
Dopo ogni fase di incubazione degli anticorpi, l'eccesso di anticorpi viene lavato via per rimuovere eventuali anticorpi che si sono legati in modo non specifico.
Dopo il processo di colorazione, il campione deve essere montato.
Per vedere i risultati della colorazione, il tessuto deve essere attentamente montato su vetrini.
Un reagente spesso o un mezzo di montaggio viene utilizzato per racchiudere il tessuto.
Il campione è quindi pronto per essere visualizzato al microscopio.
Ora che abbiamo esaminato i principi dell'immunoistochimica della Drosophila, siamo pronti a vedere come è fatto.
In questo video ci concentreremo sui reagenti, gli strumenti e i processi utilizzati nell'immunoistochimica del cervello larvale della Drosophila a partire dalla fissazione.
Il processo che stiamo seguendo utilizza l'intero cervello ed è noto come colorazione dell'intero monte.
Mentre la procedura di dissezione differisce a seconda del tipo di tessuto utilizzato per l'esperimento, i passaggi principali di IHC rimangono gli stessi, quindi salteremo alla fase di fissazione.
Una volta completata la dissezione del cervello larvale, rimuovere PBS con una pipetta.
Aggiungi fissativo e incuba secondo il tuo protocollo specifico, per l'uso del cervello 23 min.
Dopo la fissazione, lavare i campioni quattro volte in PBST.
Incubare i campioni in soluzione bloccante per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
Utilizzando le diluizioni appropriate, incubare in soluzione anticorpale primaria durante la notte a 4 °C.
Dopo il periodo di incubazione lavare i cervelli quattro volte in PBST con una punta di pipetta a temperatura ambiente.
Incubare i campioni in anticorpi secondari durante la notte a 4 °C al buio per evitare che i fluorofori si sbianchino.
Ancora una volta, lava il cervello quattro volte in PBST.
Equilibrare il cervello nel mezzo di montaggio per un'ora.
Dopo l'equilibrio trasferire il cervello su una diapositiva usando una pipetta p200 con la punta tagliata.
Posizionare i distanziatori attorno al campione per evitare che venga schiacciato.
Posizionare una coverslip sopra i campioni.
Sigillare i bordi antiscivolo con lo smalto per unghie. I cervelli larvali sono ora pronti per essere visualizzati con l'immunoistochimica
Ora che abbiamo trattato l'immunoistochimica del cervello di Drosophila, esaminiamo alcuni modi alternativi di applicare le procedure IHC.
Tecniche alternative di dissezione e fissazione possono essere utilizzate per preparare la larva di Drosophila per l'imaging.
In questo esperimento, i ricercatori vogliono imparare come le cellule generano forme specifiche.
Lo fanno tracciando le morfologie delle cellule terminali tracheali larvali.
I ricercatori sfruttano una linea di mosca mutante che esprime GFP.
L'espressione GFP è indotta dall'esposizione al calore a bagnomaria
Le larve sono selezionate al microscopio di dissezione con fluorescenza.
Le mosche che emettono fluorescenza indicano un'attivazione riuscita della GFP.
Queste mosche sono sottoposte a una forma alternativa di fissazione per calore; non è necessaria alcuna dissezione.
Dopo aver utilizzato il software per aiutare il tracciamento, vengono identificate le morfologie cellulari dei rami tracheali e del lume.
L'ovaio Drosophila è un modello eccellente per capire come le cellule staminali interagiscono con il loro ambiente cellulare.
L'IHC delle ovaie di Drosophila inizia identificando le femmine di Drosophila per presenza di ovaie rispetto ai testicoli, che sono evidenti nei maschi.
Le larve femminili raccolte vengono trasferite in singoli pozzi dove vengono accuratamente sezionate per ottenere una struttura nota come corpo grasso, che ospita le ovaie.
I corpi grassi sono fissi e macchiati, e quindi - dopo aver posizionato il tessuto su vetrini - le ovaie vengono separate dal tessuto corporeo grasso. Dopo aver montato e visualizzato i vetrini, la colorazione fluorescente rivela la posizione delle cellule somatiche e delle cellule germinali primordiali nell'ovaio larvale .
L'immunoistochimica delle larve di Drosophila ha molti paralleli con l'IHC pupale e adulto.
Ad esempio, i ricercatori possono utilizzare IHC per esaminare le retine di Drosophila in diversi stadi di sviluppo: larvale, pupale e adulto, illustrando così la differenza tra le procedure immunoistochimiche pupali, larvali e adulte.
I risultati mostrano le varie fasi di sviluppo delle retine di Drosophila.
L'immunoistochimica della larva di Drosophila è uno strumento con una grande quantità di applicazioni e variazioni. In questo video abbiamo trattato le procedure per immunocolorare le larve tra cui dissezione, fissazione, colorazione e montaggio. Grazie per l'attenzione!
Drosophila melanogaster è un organismo modello ampiamente studiato grazie alla sua versatilità e facilità d'uso.
L'immunoistochimica eseguita su preparati larvali di Drosophila è un metodo inestimabile in grado di fornire informazioni sulla presenza, la posizione e la co-localizzazione delle proteine.
Questo video coprirà i metodi essenziali per la dissezione, la fissazione, il blocco e il montaggio del tessuto larvale di Drosophila ed esempi delle loro applicazioni.
L'immunoistochimica è un processo che utilizza anticorpi modificati per colpire, legare e infine visualizzare proteine specifiche nei tessuti.
L'immunoistochimica della larva di Drosophila dipende da una corretta dissezione, che richiede precisione e tempestività a causa della sensibilità del tessuto larvale.
La dissezione viene in genere eseguita in soluzione salina tamponata con fosfato, o "PBS" in breve.
Al momento dell'estrazione gli organi vengono temporaneamente posti in PBS - una soluzione salina con lo stesso pH del pH interno della larva.
Dopo la dissezione il passo successivo nella larva di Drosophila IHC è la fissazione.
La fissazione è un processo in cui il tessuto viene posto in una soluzione diluita a base di formaldeide, che preserva il tessuto.
Questa soluzione fissanti previene la degradazione enzimatica delle proteine nei tessuti.
Dopo la fissazione, si verificano diverse fasi di lavaggio durante il processo di immunocolorazione utilizzando PBS contenente Triton-X, chiamato PBST.
Triton-X100 fornisce una piccola quantità di detergente che funge da interruttore di tensione superficiale e permeabilizza la cellula, consentendo l'ingresso di anticorpi e altri reagenti.
Dopo la fissazione e il lavaggio, il tessuto è pronto per il blocco.
La soluzione bloccante contiene proteine che si legano ai tessuti e occupano siti di legame non specifici a cui gli anticorpi specifici del bersaglio aderirebbero altrimenti. Il blocco aiuta a prevenire un segnale proteico falso positivo.
Dopo aver bloccato il tessuto viene preparato per la colorazione.
La colorazione incorpora un anticorpo "primario" altamente specifico che si lega a una proteina bersaglio chiamata antigene.
Un anticorpo "secondario" coniugato a una molecola reporter lega l'anticorpo primario.
La molecola reporter emette un segnale localizzato che può essere visualizzato, che è spesso di natura fluorescente.
Dopo ogni fase di incubazione degli anticorpi, l'eccesso di anticorpi viene lavato via per rimuovere eventuali anticorpi che si sono legati in modo non specifico.
Dopo il processo di colorazione, il campione deve essere montato.
Per vedere i risultati della colorazione, il tessuto deve essere attentamente montato su vetrini.
Un reagente spesso o un mezzo di montaggio viene utilizzato per racchiudere il tessuto.
Il campione è quindi pronto per essere visualizzato al microscopio.
Ora che abbiamo esaminato i principi dell'immunoistochimica della Drosophila, siamo pronti a vedere come è fatto.
In questo video ci concentreremo sui reagenti, gli strumenti e i processi utilizzati nell'immunoistochimica del cervello larvale della Drosophila a partire dalla fissazione.
Il processo che stiamo seguendo utilizza l'intero cervello ed è noto come colorazione dell'intero monte.
Mentre la procedura di dissezione differisce a seconda del tipo di tessuto utilizzato per l'esperimento, i passaggi principali di IHC rimangono gli stessi, quindi salteremo alla fase di fissazione.
Una volta completata la dissezione del cervello larvale, rimuovere PBS con una pipetta.
Aggiungi fissativo e incuba secondo il tuo protocollo specifico, per l'uso del cervello 23 min.
Dopo la fissazione, lavare i campioni quattro volte in PBST.
Incubare i campioni in soluzione bloccante per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
Utilizzando le diluizioni appropriate, incubare in soluzione anticorpale primaria durante la notte a 4 °C.
Dopo il periodo di incubazione lavare i cervelli quattro volte in PBST con una punta di pipetta a temperatura ambiente.
Incubare i campioni in anticorpi secondari durante la notte a 4 °C al buio per evitare che i fluorofori si sbianchino.
Ancora una volta, lava il cervello quattro volte in PBST.
Equilibrare il cervello nel mezzo di montaggio per un'ora.
Dopo l'equilibrio trasferire il cervello su una diapositiva usando una pipetta p200 con la punta tagliata.
Posizionare i distanziatori attorno al campione per evitare che venga schiacciato.
Posizionare una coverslip sopra i campioni.
Sigillare i bordi antiscivolo con lo smalto per unghie. I cervelli larvali sono ora pronti per essere visualizzati con l'immunoistochimica
Ora che abbiamo trattato l'immunoistochimica del cervello di Drosophila, esaminiamo alcuni modi alternativi di applicare le procedure IHC.
Tecniche alternative di dissezione e fissazione possono essere utilizzate per preparare la larva di Drosophila per l'imaging.
In questo esperimento, i ricercatori vogliono imparare come le cellule generano forme specifiche.
Lo fanno tracciando le morfologie delle cellule terminali tracheali larvali.
I ricercatori sfruttano una linea di mosca mutante che esprime GFP.
L'espressione GFP è indotta dall'esposizione al calore a bagnomaria
Le larve sono selezionate al microscopio di dissezione con fluorescenza.
Le mosche che emettono fluorescenza indicano un'attivazione riuscita della GFP.
Queste mosche sono sottoposte a una forma alternativa di fissazione per calore; non è necessaria alcuna dissezione.
Dopo aver utilizzato il software per aiutare il tracciamento, vengono identificate le morfologie cellulari dei rami tracheali e del lume.
L'ovaio Drosophila è un modello eccellente per capire come le cellule staminali interagiscono con il loro ambiente cellulare.
L'IHC delle ovaie di Drosophila inizia identificando le femmine di Drosophila per presenza di ovaie rispetto ai testicoli, che sono evidenti nei maschi.
Le larve femminili raccolte vengono trasferite in singoli pozzi dove vengono accuratamente sezionate per ottenere una struttura nota come corpo grasso, che ospita le ovaie.
I corpi grassi sono fissi e macchiati, e quindi - dopo aver posizionato il tessuto su vetrini - le ovaie vengono separate dal tessuto corporeo grasso. Dopo aver montato e visualizzato i vetrini, la colorazione fluorescente rivela la posizione delle cellule somatiche e delle cellule germinali primordiali nell'ovaio larvale .
L'immunoistochimica delle larve di Drosophila ha molti paralleli con l'IHC pupale e adulto.
Ad esempio, i ricercatori possono utilizzare IHC per esaminare le retine di Drosophila in diversi stadi di sviluppo: larvale, pupale e adulto, illustrando così la differenza tra le procedure immunoistochimiche pupali, larvali e adulte.
I risultati mostrano le varie fasi di sviluppo delle retine di Drosophila.
L'immunoistochimica della larva di Drosophila è uno strumento con una grande quantità di applicazioni e variazioni. In questo video abbiamo trattato le procedure per immunocolorare le larve tra cui dissezione, fissazione, colorazione e montaggio. Grazie per l'attenzione!
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Q1: Why is dissection important in Drosophila larval immunohistochemistry?
Proper dissection is critical because larval tissue is highly sensitive and requires accuracy and timeliness. Dissection is performed in phosphate buffered saline (PBS), a saline solution matching the larva's internal pH, to preserve tissue integrity. Careful dissection ensures organs are extracted without damage, allowing subsequent fixation and staining steps to proceed effectively.
Q2: What role does fixation play in preparing Drosophila larval tissue for immunohistochemistry?
Fixation preserves tissue by placing it in a diluted formaldehyde-based solution that prevents enzymatic breakdown of proteins. This step protects epitopes—the specific binding sites on proteins—ensuring they remain intact for antibody recognition. Proper fixation is essential before permeabilization and staining to maintain tissue structure and protein integrity throughout the immunohistochemistry process.
Q3: How does blocking solution prevent false positive signals in Drosophila larval IHC?
Blocking solution contains proteins that bind to tissue and occupy non-specific binding sites where target-specific antibodies would otherwise adhere incorrectly. By saturating these sites, blocking prevents antibodies from binding to unintended locations, reducing background noise. This step is crucial for ensuring that only the target protein generates a fluorescent signal, improving the accuracy of protein localization results.
Q4: What is the function of Triton-X100 in the immunohistochemistry washing steps?
Triton-X100 is a detergent added to PBS (creating PBST) that acts as a surface tension breaker and permeabilizes cell membranes. This permeabilization allows antibodies and other reagents to penetrate cells and access target proteins inside tissue. The detergent is used throughout multiple washing steps to remove excess unbound antibodies while maintaining tissue permeability.
Q5: How do primary and secondary antibodies work together in Drosophila larval staining?
The primary antibody is highly specific and binds directly to the target protein (antigen). The secondary antibody then binds to the primary antibody and carries a reporter molecule—typically a fluorescent dye—that emits a localized signal. This two-antibody system amplifies the signal and allows visualization of protein location under fluorescence microscopy.
Q6: Why is mounting medium necessary after immunostaining Drosophila larval tissue?
Mounting medium is a thick reagent that encases the tissue on microscope slides, protecting it and preserving fluorescent signals. The medium maintains tissue transparency and prevents sample degradation, allowing clear visualization under the microscope. Proper mounting with spacers and coverslips ensures the tissue remains intact and ready for long-term fluorescence microscopy examination.
Q7: What are some alternative applications of immunohistochemistry in Drosophila research?
IHC is used to study diverse Drosophila tissues and developmental stages. Researchers trace larval tracheal terminal cell morphologies using GFP-expressing mutant lines, examine ovaries to understand stem cell interactions with their cellular environment, and compare development and reproduction across larval, pupal, and adult retinas. These applications demonstrate IHC's versatility in visualizing protein location across different tissues and developmental stages.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:41
Principles of Larval Immunohistochemistry
3:29
Immunohistochemistry Procedure
5:34
Applications
8:03
Summary
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