Drosophila IHC larvale

<em>Drosophila</em> Larval IHC

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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Drosophila Larval IHC

3.9: C. elegans Development and Reproduction

3.13: Yeast Transformation and Cloning

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08:29 min

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April 30, 2023

Overview

L’immunoistochimica (IHC) è una tecnica utilizzata per visualizzare la presenza e la posizione delle proteine all’interno dei tessuti. Le larve di Drosophila sono particolarmente suscettibili all’IHC a causa della facilità con cui possono essere lavorate per la colorazione. Inoltre, le larve sono trasparenti, il che significa che alcuni tessuti possono essere visualizzati senza la necessità di dissezione.

In IHC, le proteine vengono infine rilevate con anticorpi che si legano specificamente agli “epitopi” all’interno della proteina di interesse. Al fine di preservare questi epitopi, i tessuti devono essere fissati prima della colorazione. Inoltre, affinché gli anticorpi penetrino nelle membrane, le cellule devono essere permeabilizzate con detergenti. Questo articolo video offre una visione dettagliata dei reagenti, degli strumenti e delle procedure necessarie per la colorazione dei tessuti larvali sezionati, comprese le fasi di fissazione, blocco e colorazione. È stata inoltre presentata una dimostrazione delle tecniche di montaggio dei tessuti per la microscopia a fluorescenza. Infine, vengono forniti esempi dell’ampia gamma di applicazioni per queste tecniche (e alcune variazioni su di esse).

Procedure

Drosophila melanogaster è un organismo modello ampiamente studiato grazie alla sua versatilità e facilità d’uso.

L’immunoistochimica eseguita su preparati larvali di Drosophila è un metodo inestimabile in grado di fornire informazioni sulla presenza, la posizione e la co-localizzazione delle proteine.

Questo video coprirà i metodi essenziali per la dissezione, la fissazione, il blocco e il montaggio del tessuto larvale di Drosophila ed esempi delle loro applicazioni.

L’immunoistochimica è un processo che utilizza anticorpi modificati per colpire, legare e infine visualizzare proteine specifiche nei tessuti.

L’immunoistochimica della larva di Drosophila dipende da una corretta dissezione, che richiede precisione e tempestività a causa della sensibilità del tessuto larvale.

La dissezione viene in genere eseguita in soluzione salina tamponata con fosfato, o “PBS” in breve.

Al momento dell’estrazione gli organi vengono temporaneamente posti in PBS – una soluzione salina con lo stesso pH del pH interno della larva.

Dopo la dissezione il passo successivo nella larva di Drosophila IHC è la fissazione.

La fissazione è un processo in cui il tessuto viene posto in una soluzione diluita a base di formaldeide, che preserva il tessuto.

Questa soluzione fissanti previene la degradazione enzimatica delle proteine nei tessuti.

Dopo la fissazione, si verificano diverse fasi di lavaggio durante il processo di immunocolorazione utilizzando PBS contenente Triton-X, chiamato PBST.

Triton-X100 fornisce una piccola quantità di detergente che funge da interruttore di tensione superficiale e permeabilizza la cellula, consentendo l’ingresso di anticorpi e altri reagenti.

Dopo la fissazione e il lavaggio, il tessuto è pronto per il blocco.

La soluzione bloccante contiene proteine che si legano ai tessuti e occupano siti di legame non specifici a cui gli anticorpi specifici del bersaglio aderirebbero altrimenti. Il blocco aiuta a prevenire un segnale proteico falso positivo.

Dopo aver bloccato il tessuto viene preparato per la colorazione.

La colorazione incorpora un anticorpo “primario” altamente specifico che si lega a una proteina bersaglio chiamata antigene.

Un anticorpo “secondario” coniugato a una molecola reporter lega l’anticorpo primario.

La molecola reporter emette un segnale localizzato che può essere visualizzato, che è spesso di natura fluorescente.

Dopo ogni fase di incubazione degli anticorpi, l’eccesso di anticorpi viene lavato via per rimuovere eventuali anticorpi che si sono legati in modo non specifico.

Dopo il processo di colorazione, il campione deve essere montato.

Per vedere i risultati della colorazione, il tessuto deve essere attentamente montato su vetrini.

Un reagente spesso o un mezzo di montaggio viene utilizzato per racchiudere il tessuto.

Il campione è quindi pronto per essere visualizzato al microscopio.

Ora che abbiamo esaminato i principi dell’immunoistochimica della Drosophila, siamo pronti a vedere come è fatto.

In questo video ci concentreremo sui reagenti, gli strumenti e i processi utilizzati nell’immunoistochimica del cervello larvale della Drosophila a partire dalla fissazione.

Il processo che stiamo seguendo utilizza l’intero cervello ed è noto come colorazione dell’intero monte.

Mentre la procedura di dissezione differisce a seconda del tipo di tessuto utilizzato per l’esperimento, i passaggi principali di IHC rimangono gli stessi, quindi salteremo alla fase di fissazione.

Una volta completata la dissezione del cervello larvale, rimuovere PBS con una pipetta.

Aggiungi fissativo e incuba secondo il tuo protocollo specifico, per l’uso del cervello 23 min.

Dopo la fissazione, lavare i campioni quattro volte in PBST.

Incubare i campioni in soluzione bloccante per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.

Utilizzando le diluizioni appropriate, incubare in soluzione anticorpale primaria durante la notte a 4 °C.

Dopo il periodo di incubazione lavare i cervelli quattro volte in PBST con una punta di pipetta a temperatura ambiente.

Incubare i campioni in anticorpi secondari durante la notte a 4 °C al buio per evitare che i fluorofori si sbianchino.

Ancora una volta, lava il cervello quattro volte in PBST.

Equilibrare il cervello nel mezzo di montaggio per un’ora.

Dopo l’equilibrio trasferire il cervello su una diapositiva usando una pipetta p200 con la punta tagliata.

Posizionare i distanziatori attorno al campione per evitare che venga schiacciato.

Posizionare una coverslip sopra i campioni.

Sigillare i bordi antiscivolo con lo smalto per unghie. I cervelli larvali sono ora pronti per essere visualizzati con l’immunoistochimica

Ora che abbiamo trattato l’immunoistochimica del cervello di Drosophila, esaminiamo alcuni modi alternativi di applicare le procedure IHC.

Tecniche alternative di dissezione e fissazione possono essere utilizzate per preparare la larva di Drosophila per l’imaging.

In questo esperimento, i ricercatori vogliono imparare come le cellule generano forme specifiche.

Lo fanno tracciando le morfologie delle cellule terminali tracheali larvali.

I ricercatori sfruttano una linea di mosca mutante che esprime GFP.

L’espressione GFP è indotta dall’esposizione al calore a bagnomaria

Le larve sono selezionate al microscopio di dissezione con fluorescenza.

Le mosche che emettono fluorescenza indicano un’attivazione riuscita della GFP.

Queste mosche sono sottoposte a una forma alternativa di fissazione per calore; non è necessaria alcuna dissezione.

Dopo aver utilizzato il software per aiutare il tracciamento, vengono identificate le morfologie cellulari dei rami tracheali e del lume.

L’ovaio Drosophila è un modello eccellente per capire come le cellule staminali interagiscono con il loro ambiente cellulare.

L’IHC delle ovaie di Drosophila inizia identificando le femmine di Drosophila per presenza di ovaie rispetto ai testicoli, che sono evidenti nei maschi.

Le larve femminili raccolte vengono trasferite in singoli pozzi dove vengono accuratamente sezionate per ottenere una struttura nota come corpo grasso, che ospita le ovaie.

I corpi grassi sono fissi e macchiati, e quindi – dopo aver posizionato il tessuto su vetrini – le ovaie vengono separate dal tessuto corporeo grasso. Dopo aver montato e visualizzato i vetrini, la colorazione fluorescente rivela la posizione delle cellule somatiche e delle cellule germinali primordiali nell’ovaio larvale .

L’immunoistochimica delle larve di Drosophila ha molti paralleli con l’IHC pupale e adulto.

Ad esempio, i ricercatori possono utilizzare IHC per esaminare le retine di Drosophila in diversi stadi di sviluppo: larvale, pupale e adulto, illustrando così la differenza tra le procedure immunoistochimiche pupali, larvali e adulte.

I risultati mostrano le varie fasi di sviluppo delle retine di Drosophila.

L’immunoistochimica della larva di Drosophila è uno strumento con una grande quantità di applicazioni e variazioni. In questo video abbiamo trattato le procedure per immunocolorare le larve tra cui dissezione, fissazione, colorazione e montaggio. Grazie per l’attenzione!

Transcript

Drosophila melanogaster is a widely studied model organism due to its versatility and facility of use.

Immunohistochemistry performed on Drosophila larval preparations is an invaluable method that can provide information on the presence, location, and the co-localization of proteins.

This video will cover the essential methods for the dissection, fixation, blocking, and mounting of Drosophila larval tissue and examples of their applications.

Immunohistochemistry is a process that uses modified antibodies to target, bind, and ultimately visualize specific proteins in tissue.

Immunohistochemistry of Drosophila larva hinges on proper dissection, which demands accuracy and timeliness due to the sensitivity of larval tissue.

Dissection is typically done in phosphate buffered saline, or “PBS” for short.

Upon extraction organs are temporarily placed in PBS – a saline solution with the same pH as the internal pH of the larva.

After dissection the next step in Drosophila larva IHC is fixation.

Fixation is a process where tissue is placed in a diluted formaldehyde-based solution, which preserves tissue.

This fixing solution prevents the enzymatic breakdown of proteins in tissue.

Following fixation, several washing steps occur throughout the immunostaining process using PBS containing Triton-X, called PBST.

Triton-X100 provides a small amount of detergent that serves as a surface tension breaker and permeabilizes the cell, allowing antibodies and other reagents to enter.

After fixation and washing, the tissue is ready for blocking.

Blocking solution contains proteins that bind to tissue and occupy non-specific binding sites to which the target-specific antibodies would otherwise adhere. Blocking helps to prevent a false positive protein signal.

After blocking the tissue is prepared for staining.

Staining incorporates highly-specific “primary” antibody that binds to a target protein called an antigen.

A “secondary” antibody conjugated to a reporter molecule binds the primary antibody.

The reporter molecule emits a localized signal that can be visualized, which is often fluorescent in nature.

Following each antibody incubation step, excess antibody is washed off to remove any antibodies that have bound nonspecifically.

After the staining process, the sample must be mounted.

In order to see the results of staining, the tissue must be carefully mounted onto slides.

A thick reagent or mounting medium is used to encase the tissue.

The sample is then ready to be viewed under the microscope.

Now that we’ve gone through the principles of Drosophila immunohistochemistry, we’re ready to see how it’s done.

In this video we’ll focus on the reagents, tools, and processes used in the immunohistochemistry of the Drosophila larval brain beginning with fixation.

The process we are following uses the entire brain and is known as whole mount staining.

While the dissection procedure differs depending on the tissue type used for the experiment, the major steps of IHC remain the same so we’ll skip to the fixation step.

Once dissection of larval brains is complete, remove PBS with a pipette.

Add fixative and incubate for according to your specific protocol, for brains use 23 min.

Following fixation, wash samples four times in PBST.

Incubate samples in blocking solution for at least 30 min room temperature.

Using the appropriate dilutions, incubate in primary antibody solution overnight at 4 °C.

After the incubation period wash brains four times in PBST with a pipette tip at room temperature.

Incubate the samples in secondary antibody overnight at 4 °C in the dark to prevent the fluorophores from bleaching.

Again, wash brains four times in PBST.

Equilibrate the brains in mounting medium for one hour.

After equilibration transfer the brains to a slide using a p200 pipette with the tip cut off.

Place spacers around the sample to prevent it from being crushed.

Place a coverslip over the samples.

Seal the slip edges with nail polish. Larval brains are now ready to be visualized with immunohistochemistry

Now that we’ve covered the immunohistochemistry of Drosophila brains, let’s go through some alternative ways of applying IHC procedures.

Alternative dissection and fixation techniques can be used to prepare Drosophila larva for imaging.

In this experiment, researchers want to learn how cells generate specific shapes.

They do this by tracing the morphologies of larval tracheal terminal cells.

The researchers take advantage of a mutant fly line that expresses GFP.

The GFP expression is induced by exposure to heat in a water bath

Larvae are selected under a dissection microscope with fluorescence.

Flies emitting fluorescence indicate successful activation of GFP.

These flies are submitted to an alternative form of fixation by heat; no dissection is necessary.

After using software to assist tracing, cellular morphologies of tracheal branches and lumen are identified .

The Drosophila ovary is an excellent model for understanding how stem cells interact with their cellular environment.

IHC of Drosophila ovaries begins by identifying Drosophila females by presence of ovaries versus testes, which are apparent in males.

Collected female larvae are transferred to individual wells where they are carefully dissected to obtain a structure known as the fat body, which houses the ovaries.

Fat bodies are fixed and stained, and then – after placing the tissue on slides – the ovaries are separated from fat body tissue. After mounting and visualizing the slides, fluorescent staining reveals the location of somatic cells and primordial germ cells in the larval ovary .

Immunohistochemistry of Drosophila larvae has many parallels to pupal and adult IHC.

For example, researchers can use IHC to look at Drosophila retinas at different developmental stages: larval, pupal, and adult, thereby illustrating the difference between pupal, larval, and adult immunohistochemistry procedures.

Results show the various stages of development of Drosophila retinas.

Immunohistochemistry of Drosophila larva is a tool with a large amount of applications and variations. In this video we covered the procedures for immunostaining larvae including dissection, fixation, staining, and mounting. Thanks for watching!