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Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Analisi funzionale del circuito di alimentazione larvale in Drosophila

Full Text

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09:23 min

November 19, 2013

DOI: 10.3791/51062-v

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Il circuito di alimentazione in Drosophila melanogaster larve propone un modello semplice ma potente che consente modifiche del tasso di alimentazione per essere correlati con alterazioni della circuiti neurali stomatogastric. Questo circuito è composto di neuroni serotoninergici centrali che inviano proiezioni ai ganci bocca e foregut.

Transcript

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare il sistema modello di Drosophila per correlare gli output comportamentali con i cambiamenti nell'architettura neurale. Ciò si ottiene allestendo prima gabbie di popolazione di drosofila adulta per raccogliere le larve. Il passo successivo della procedura consiste nel valutare la capacità locomotoria delle larve di tardo secondo e inizio terzo stadio.

Il terzo passo consiste nel valutare il comportamento alimentare delle larve osservando l'estensione e la retrazione dei loro uncini per la bocca. La fase finale consiste nel sezionare e preparare campioni ventricolari comprovati da larve di terzo stadio tardivo utilizzando tecniche immunoistochimiche. In definitiva, i risultati possono mostrare come le aberrazioni nell'architettura neurale durante lo sviluppo siano correlate ai cambiamenti comportamentali attraverso l'uso combinato di saggi comportamentali e microscopia a immunofluorescenza.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una migliore comprensione dello sviluppo dell'architettura neurale, che consente di comprendere meglio il progresso delle malattie neurologiche. A dimostrare la procedura sarà prag bot, uno studente laureato nel mio laboratorio. Mantenere le gabbie della popolazione di drosophila a 25 gradi Celsius con un ciclo di luce e buio di 12 ore.

Finché i gruppi di controllo e sperimentali sono esposti alle stesse condizioni di illuminazione, questa tecnica può essere eseguita in un ambiente di laboratorio standard. Utilizzando popolazioni consolidate, le larve vengono raccolte consentendo alle femmine di deporre le uova durante la notte sul succo di mela. I piatti di agar cambiano il piatto al mattino e mettono una piccola cucchiaiata di lievito al centro del piatto raccolto.

Il lievito attirerà le larve schiuse, consentirà alle uova di svilupparsi per 24 ore a 25 gradi Celsius e, il giorno successivo, raccoglierà le prime larve di stadio dalla pasta. Usando una spatola di metallo, trasferisci le larve su un piatto di succo di mela fresco o succo d'uva. È possibile aggiungere ulteriore pasta di lievito per nutrire le larve fino a quando non vengono eseguiti i saggi per raccogliere il secondo e l'inizio del terzo stadio Le larve di stadio consentono al primo stadio di invecchiare per 40-48 ore.

Durante questo lasso di tempo, i tassi di alimentazione sono costanti da raccogliere. Le larve del terzo stadio tardivo allevano le larve in bottiglie. Allevare larve di terzo stadio tardivo su piatti di succo può essere dannoso a causa dell'accumulo di agri nel sistema gastrico somatico.

L'età delle larve può essere confermata dalla morfologia dell'uncino della bocca, poiché ci sono cambiamenti distinti in questa struttura. Con ogni muffa larvale, raccogli le larve della fine del secondo e dell'inizio del terzo stadio lavando delicatamente e ampiamente il piatto del succo con acqua e versando le larve in un filtro a rete, quindi procedi con l'analisi comportamentale. Posizionare una singola larva di stadio da tardo secondo a inizio terzo stadio su un substrato di acer al 2% in un piatto di coltura tissutale da 100 millimetri e lasciare che le larve si acclimatino per 30 secondi per esattamente un minuto.

Utilizzando un contatore di conteggio ogni movimento posteriore e anteriore sul substrato, segna ogni contrazione che si verifica su tre quarti del corpo dell'animale. Quando le larve ondeggiano da un lato all'altro, ma in realtà non cambiano posizione, questi movimenti non vengono segnati. Occasionalmente una contrazione completa da anteriore a posteriore genera un movimento all'indietro come la locomozione in avanti.

Viene valutata anche la locomozione all'indietro. Sostituire la piastra di analisi dopo che sono stati testati al massimo 10 animali. Effettuare almeno 20 registrazioni per condizione sperimentale.

Valutare ogni larva utilizzata nel test locomotore nel test di alimentazione utilizzando l'acciaio inox smussato. Numero cinque, pinzette. Trasferire con cura una larva dalla piastra agri locomotoria al centro di una piastra riempita di agri sovrapposta con cinque millilitri di una soluzione di lievito omogenea.

Nella soluzione di lievito, le larve rimarranno in gran parte sul posto e l'alimentazione del mangime è direttamente correlata al tasso di contrazioni dell'uncino della bocca, che sono viste come l'estensione e la retrazione dei diritti della scogliera faringea del cephalon Consentire alle larve di acclimatarsi per 30 secondi, quindi per un minuto, registrare il numero di contrazioni dell'uncino della bocca utilizzando un contatore. Inizia caricando la formaldeide di grado EM al 4% appena preparata in PBS in un vetro spot a tre pozzetti. Quindi trasferisci una larva errante del terzo stadio in una capsula di dissezione con PBS.

Con una pinza si tiene l'estremità posteriore e con l'altra si tengono i ganci della bocca tenendo immobile l'estremità posteriore. Tirare delicatamente i ganci per la bocca per accedere alle budella. Rimuovere tutti i tessuti associati come le ghiandole salivari, il cervello, il corpo grasso e così via.

Quindi trasferisci ogni budello nel piatto a tre pozzetti contenente il fix di formaldeide. Incubare le viscere a quattro gradi Celsius per una notte in una scatola di coltura di tessuti opaca. Il giorno successivo, prima di rimuovere la soluzione di fissaggio, rimuovere la seca gastrica e agganciare l'intestino medio vicino ai ventricolari collaudati in modo che le proiezioni possano essere visualizzate chiaramente senza impedimenti.

Ora, sostituire il fissativo con un XPBT e lasciare incubare i tessuti per 10 minuti con un leggero dondolio. Eseguire questo lavaggio PBT sei volte. Successivamente, aggiungi la serotonina, che migliorerà la segnalazione della serotonina senza influire sull'architettura neurale.

Quindi incubare le budella per un'ora a quattro gradi Celsius senza oscillare. Dopo un'ora, lavare accuratamente le viscere con PBT sei volte come fatto per rimuovere l'anticorpo primario. Quindi incubare le viscere durante la notte a quattro gradi Celsius con anticorpi primari anti serotonina.

Il giorno successivo, ripetere i sei lavaggi PPT e proseguire con l'incubazione secondaria degli anticorpi a quattro gradi Celsius per 90 minuti. Usa uno a 400 Alexa floor 5 68 capra anti-USA, o uno a 400 anti coniglio IgG. Rimuovere l'anticorpo secondario utilizzando il regime di lavaggio PBT e quindi incubare le viscere in quattro millimolari di carbonato di sodio con un leggero dondolo per 10 minuti.

I budelli possono quindi essere montati in gallato di propile al 4% di N con carbonato di sodio da 20 millimolari come tampone e visualizzati sotto fluorescenza a un ingrandimento di 400 x per l'analisi. Evita di scattare immagini all'estremità posteriore dei ventricoli collaudati perché queste fibre sono strettamente raggruppate. Le fibre più posteriori nell'intestino medio sono più ramificate perché si fascicolano una volta entrate nel tessuto.

Le fibre di neurite possono essere quantificate utilizzando software commerciali come neuro lucita e neuro Explorer, elaborandole manualmente o utilizzando il software disponibile gratuitamente. Semplici immagini traccianti di nerite che non sono chiare renderanno difficile distinguere tra la fibra e le varicosità e non dovrebbero essere utilizzate se l'architettura della fibra è chiaramente distinguibile dallo sfondo. E se le singole varicosità possono essere identificate lungo la lunghezza della nerite, la preparazione è appropriata per l'analisi.

Inoltre, se le singole varicosità possono essere identificate dal resto della fibra, questo è un altro indicatore di un'immagine di qualità per l'analisi. Le fibre assonali che sporgono dal cervello sono raggruppate nel nervo di recidiva e sono inappropriate per l'analisi fino a quando non raggiungono il ventricolare provato dove si separano e si innervano. L'apparato gastrico steamatico Analizza tutte le fibre ad eccezione di quelle fuori dal campo di focalizzazione.

In alcuni casi, le fibre si curvano tra più piani di messa a fuoco, tracciano le singole proiezioni delle fibre dal cervello ai ventricolari collaudati e contano le varici e i rami, quindi calcolano la frequenza di grandi varicosità per unità di lunghezza. Lo studio del circuito di alimentazione serotoninergica è efficace per analizzare l'influenza di particolari fattori sullo sviluppo del sistema nervoso. Quantificando la velocità di alimentazione, è possibile collegare l'architettura assonale del circuito di alimentazione con la sua uscita funzionale.

Il test locomotorio non mostra differenze nelle risposte locomotorie tra i genotipi di controllo e quelli mutanti. Se le mutazioni interessano solo il circuito di alimentazione, il corpo ellissoide mutante si apre. EBO tre presenta un difetto strutturale nel corpo ellissoidale del complesso centrale.

Il ceppo parentale di tipo selvatico. CSWU ha rivelato che l'EO tre provoca un'alimentazione depressa mentre la locomozione non è influenzata. I difetti di sviluppo nei mutanti EO 3 hanno influenzato l'architettura dell'urato dell'intestino.

Queste larve mostravano più ramificazioni e più varici, sia piccole che grandi, lungo la lunghezza dell'urato. Si noti che i nodi di ramificazione sono in corrispondenza delle frecce, le varicosità in corrispondenza delle punte delle frecce e le grandi varicosità in corrispondenza dell'asterisco. Questi cambiamenti nella ramificazione neurale sono stati quantificati per l'analisi statistica.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di non danneggiare le larve o i campioni di tessuto sezionati.

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