Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un In Vitro Aderenza Assay

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare la capacità di un levario cellulare di streptococco probiotico di inibire l'aderenza pneumococcica a una linea cellulare epiteliale. Ciò si ottiene preparando prima i monostrati di cellule epiteliali CCL 23. In una piastra a 24 pozzetti, successivamente slovar e pneumococchi vengono aggiunti al monostrato in sequenza e le cellule vengono incubate.

Nella fase finale, i pozzetti vengono lavati per rimuovere i batteri non aderenti. Le cellule epiteliali CCL 23 vengono lisate e il contenuto del pozzetto viene raccolto. In definitiva, l'impatto del salivarius sull'aderenza allo pneumococco può essere valutato quantificando il numero di pneumococchi associati alle cellule.

Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie infettive, come ad esempio se i probiotici possono inibire l'adesione di agenti patogeni batterici come lo pneumococco. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a studiare il potenziale uso dell'ipnosi del lactobacillus, del GG e di altri probiotici nel tratto respiratorio. A dimostrare questa procedura saranno Jane Manning e Zen agli studenti di dottorato del nostro laboratorio Il giorno prima dell'esperimento dividere in coltura di confluenza, CCL 23 cellule epiteliali, e poi diluirle in terreno di preriscaldamento a una concentrazione di 150.000 cellule per millilitro in una provetta sterile da 50 millilitri.

Successivamente, seminare, un millilitro di cellule per pozzetto in una piastra di coltura tissutale trattata a 24 pozzetti e incubare le cellule durante la notte. Quindi, utilizzando un inoculo ad ansa da 10 microlitri, da 10 a 12 colonie ben separate di ciascuna coltura batterica in un'aliquota da 10 millilitri di brodo Todd Hewitt più lo 0,5% di estratto di lievito. Agitare brevemente e incubare le colture per 14-16 ore il giorno dell'esperimento.

Agitare ciascuna delle colture batteriche per tre-cinque secondi, quindi aggiungere 100 microlitri di pneumococchi e 100 microlitri di salivario in provette di preriscaldamento etichettate, contenenti 10 millilitri di brodo. Agitare le provette inoculate per tre-cinque secondi e incubare a 37 gradi Celsius per far crescere le colture fino alla fase di log centrale. Dopo aver confermato la fluenza di almeno l'80% di co della coltura cellulare CCL 23, utilizzare la pipetta di trasferimento per rimuovere il terreno da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti, inclinando leggermente la piastra per evitare di disturbare il monostrato cellulare, quindi lavare i pozzetti due volte aggiungendo circa 500 microlitri di PBS preriscaldato e rimuovendo delicatamente il liquido con una pipetta di trasferimento.

Inclinare la piastra durante i lavaggi per preservare il monostrato dopo il secondo lavaggio. Aggiungere 500 microlitri di terreno di preriscaldamento a ciascun pozzetto e rimettere la piastra nell'incubatore mentre si preparano le colture batteriche. Innanzitutto, misurare la densità ottica di un millilitro della coltura di levarius ad un assorbente 600.

Quindi trasferire cinque millilitri di coltura di Sal Levarius in una provetta da 10 millilitri e centrifugare in provetta per quattro minuti a 1.870 g a temperatura ambiente. Dopo aver scartato la trappola Resus, sospendere il pellet in 200-1000 microlitri di punto 85% cloruro di sodio a seconda della lettura OD a una concentrazione finale di circa 1,5 volte 10 alla nona unità formante colonia per millilitro. L'aggiunta del numero corretto di batteri è la parte più complicata dell'esperimento, poiché il numero effettivo di batteri aggiunti non viene determinato fino a quando il conteggio delle colonie non viene eseguito il giorno successivo.

Ora trasferisci l'inoculo salivare risospeso in una provetta per micro fuge etichettata alta. Diluire l'alta concentrazione da uno a 10 e da uno a 100 in più punto 85% di cloruro di sodio per ottenere concentrazioni medie e basse di alvar per le provette a vortice del saggio tra le diluizioni per creare i pozzetti di controllo dell'eparina. Rimuovere 40 microlitri di terreno da ciascun pozzetto di controllo e aggiungere 50 microlitri di eparina a una concentrazione finale di 100 unità per millilitro per pozzetto.

Aggiungi 10 microlitri di cloruro di sodio puntiforme all'85% solo alle cellule CCL 23 e le cellule CCL 23 più solo pneumococchi vorticano completamente tutte le concentrazioni delle aree SIV. Quindi aggiungere 10 microlitri di concentrazioni da uno a 10 e da uno a 100 siv di varie concentrazioni nei pozzetti appropriati per favorire il contatto batterico con la cellula. Centrifugare la piastra monostrato per tre minuti a 114 Gs a temperatura ambiente e quindi incubare la piastra per un'ora mentre le cellule sono in incubazione, diluire in serie lo stock salivare in punto 85% di cloruro di sodio e utilizzare uno spalmatore sterile per disperdere 100 microlitri delle diluizioni da 10 a meno cinque, 10 da meno sei e da 10 a meno sette in doppio su piastre di agar di sangue di cavallo.

Coltivare le piastre in posizione capovolta durante la notte verso la fine del monostrato durante l'incubazione dei salvatori. Misurare la densità ottica della coltura pneumococcica e quindi centrifugare un millilitro di cellule. Resus sospendere il pellet in 300-2000 microlitri di punto 85% di cloruro di sodio a seconda della lettura OD fino a una concentrazione finale di circa 150 milioni di unità formanti colonie per millilitro.

Quindi aggiungere 10 microlitri di pneumococchi non diluiti a tutti i pozzetti, ad eccezione dei pozzetti di controllo negativo, centrifugare nuovamente la piastra da 24 pozzetti e quindi incubare le colture di co per tre ore durante la fase di incubazione. Diluire in serie e impiattare il brodo pneumococcico in modo simile al salivarius. Dopo tre ore di incubazione, controllare le cellule al microscopio per eventuali effetti citopatici.

Ora rimuovi il terreno da ogni pozzetto e lava delicatamente le colture di co tre volte con un XPBS per rimuovere i batteri non aderenti, facendo attenzione a non disturbare i monostrati. Quindi lisa le cellule con 200 microlitri di 0,1%Scavare per sette minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi, aggiungi 800 microlitri di THB a ciascuno.

Pipettare su e giù un paio di volte e raccogliere le sospensioni cellulari da ciascun pozzetto in provette per microcentrifuga etichettate. Infine, diluire in serie gli pneumococchi aderenti e poi contare le colonie il giorno successivo sulle apposite piastre di diluizione. Per quantificare gli pneumococchi e gli alvar in questa tabella, vengono mostrati i risultati di un esperimento rappresentativo in cui gli pneumococchi sono stati aggiunti a cellule CCL 23 un'ora dopo l'aggiunta di slovar.

L'aderenza pneumococcica è stata quantificata sia dalla conta vitale che dalla letteratura. I risultati A-Q-P-C-R erano coerenti tra i due metodi sia per il numero assoluto di batteri che per la percentuale di aderenza. Normalizzato al numero di pneumococchi aderenti nei pozzetti contenenti solo pneumococchi.

L'eparina è usata come controllo in quanto è nota per inibire l'aderenza pneumococcica. Pertanto, la riduzione dell'aderenza di circa il 40% o più nei campioni di pneumococchi più eparina rispetto al solo pneumococco è indicativa di un test di successo. Poiché la salivare inibisce l'aderenza pneumococcica in modo dose-dipendente, dove l'alta concentrazione di salivarius di circa 10 salivari per uno pneumococco ha determinato la più bassa aderenza pneumococcica.

Questi innesti dimostrano l'aderenza degli pneumococchi alle cellule CCL 23 quando viene aggiunto salivarius, un'ora prima degli pneumococchi contemporaneamente o un'ora dopo gli pneumococchi. Alvar è più efficace nell'inibire l'aderenza pneumococcica quando aggiunto prima degli pneumococchi, poiché sia le dosi alte che medie di Alvar hanno ridotto significativamente l'aderenza pneumococcica nel test pre-edizione. Mentre i test Coit edition e post edition solo le alte dosi di Slovar hanno inibito l'aderenza pneumococcica.

Quindi, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test in vitro per misurare l'inibizione dell'aderenza pneumococcica da parte delle aree cellulari dello streptococco probiotico.