Name: Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un In Vitro Aderenza Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Scopri come valutare l'inibizione dell'adesione di Streptococcus pneumoniae mediante Streptococcus salivarius probiotico su monocellule epiteliali CCL 23. Questo metodo in vitro aiuta a sviluppare strategie preventive contro la colonizzazione pneumococcica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Murdoch Childrens Research Institute e Operational Support Program infrastrutture del Governo del Victoria.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una parte critica di questo saggio è l&#39;aggiunta concentrazioni appropriate di S. salivarius e pneumococchi nelle sezioni 3.1.7 e 3.1.12. Le concentrazioni sono stimate utilizzando le letture di OD, ma l&#39;inoculo esatto non sono determinati fino piastre vengono conteggiati il ​​giorno seguente. Per questo motivo, si consiglia di eseguire curve di crescita per misurare OD e conta vitali (CFU / ml) nel tempo per tutti i ceppi batterici utilizzati nel test per identificare la fase di mid-log e assistere nell...

Streptococcus pneumoniae (pneumococco) è un batterio Gram-positivi che possono causare infezioni, tra cui la polmonite, otite media, e la meningite. E &#39;una delle principali cause di malattia nei bambini nei paesi a basso reddito e responsabile di circa 800.000 decessi di bambini sotto i cinque anni ogni anno 1. Pneumococchi sono spesso effettuato nel nasofaringe dei bambini. Sebbene questa colonizzazione è generalmente considerato asintomatica, precede infezione pneumococcica e funge da serbatoio per i batteri in popolazioni umane 2. Vaccinazione pneumococcico coniugato riduce efficacemente il trasporto dei sierotipi contenuti nel vaccino. Tuttavia, ci sono più di 90 sierotipi di pneumococco, e la vaccinazione può portare alla sostituzione sierotipo, per cui l&#39;eliminazione dei sierotipi del vaccino è seguita da un aumento della carrozza e malattia causata da sierotipi non vaccinali 3. Inoltre, in alcune popolazioni ad alto rischio, pneumococcocolonizzazione si verifica spesso molto presto nella vita, prima della somministrazione della prima dose di vaccino di 4,5. Recentemente, l&#39;uso di probiotici è stata proposta come una strategia aggiuntiva per inibire pneumococcica colonizzazione 6,7. Saggi in vitro di aderenza sono stati utilizzati per esaminare l&#39;adesione pneumococcica 8,9. Questi test sono stati adattati per studiare l&#39;impatto del probiotico Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) sull&#39;adesione pneumococcica 10. Oltre a LGG e altri batteri lattici, Streptococcus salivarius, residente comune della cavità orale, è stato studiato come potenziale probiotico per le vie respiratorie a causa della sua potenziale colonizzazione e capacità di inibire pneumococchi e altri patogeni respiratori in vitro 11 - 13. Il protocollo presentato qui descrive un test aderenza utilizzato per studiare gli effetti di S. salivarius K12 sul rispetto pneumococcoalla linea cellulare epiteliale umano CCL-23. Prima di usare nel saggio, isolati pneumococco sono stati valutati per le capacità di aderenza, come la crescita e le proprietà di aderenza può variare notevolmente tra gli isolati 10,14. Curve di crescita di pneumococchi e S. salivarius sono stati eseguiti per determinare fase mid-log e concentrazione stima (unità formanti colonie o CFU / ml) di densità ottica (OD, Figura 1). Si raccomanda di esaminare crescita conteggio e OD valida per ogni isolato prima dell&#39;uso nel saggio. Questa analisi può essere eseguita in qualsiasi laboratorio con impianti di coltura di tessuti standard e attrezzature. In questo protocollo, gli effetti di tre dosi di S. salivarius somministrato 1 ora prima dell&#39;aggiunta di pneumococchi sull&#39;aderenza di S. pneumoniae PMP843, un sierotipo 19F carrozza isolato derivata da un tampone nasofaringeo, sono esaminati. Due modi diversi di quantificare pneumococchi aderenti sono presentati: placcatura su agar sangue per scoraggiareil mio conte vitali, e l&#39;estrazione del DNA e la rilevazione del pneumococco LYTA gene da qPCR 15. Il protocollo di base saggio aderenza può essere facilmente modificato per testare diverse dosi o tempo di somministrazione di probiotici e può essere utilizzato anche con altri ceppi batterici o specie.

<table><tbody><tr><td>Terreni minimi essenziali (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30244.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30084.03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 Fiaschetta</td><td>Nunc</td><td>156472</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Celle CCL-23</td><td>ATCC</td><td>CCL-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologie per la vita della tripsina</td><td></td><td>15090046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastre di agar di sangue di cavallo (HBA)</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td><td>Piastre di agar di sangue di pecora accettabili anche</td></tr><tr><td>Todd-Hewitt Brodo</td><td>Oxoid</td><td>CM0189</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212750</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cuvette monouso</td><td>Kartell</td><td>1938</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L'eparina</td><td>Pfizer</td><td>2112105</td><td>è disponibile in fiale sterili da 5.000 UI/5m/&nbsp;</td></tr><tr><td>Spalmatore sterile</td><td>Technoplas</td><td>S10805050</td><td>alternativamente, uno spandiconcime di vetro può essere immerso in etanolo al 96% e sterilizzato a fiamma prima di ogni utilizzo</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mutanolisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>proteinasi K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione SDS 20%</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini-kit QIAamp DNA (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LytA F primer</td><td>Sigma-Aldrich</td> Custom <td>made</td><td>5' -> 3' sequenza ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>LytA R primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Custom made</td><td>5' -> 3' sequenza&nbsp; TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>LytA sonda</td><td>Eurogentec</td><td>Su misura</td><td>5' -> 3' sequenza Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, è possibile utilizzare fluorofori alternativi</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mastermix QPCR ultra veloce Brilliant III</td><td>Agilent Technologies</td><td>600880</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra di rilevamento Thermo-Fast 96</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Strisce di tappi qPCR ultratrasparenti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0866</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema QPCR Mx3005</td><td>Tecnologie Agilent 401449</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*fonti alternative sono disponibili per la maggior parte/tutti i prodotti elencati</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un<em&gt; in vitro</em&gt; aderenza assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

L&#39;aderenza di Streptococcus pneumoniae (pneumococco) al rivestimento epiteliale del rinofaringe può provocare colonizzazione ed è considerato un prerequisito per infezioni pneumococciche quali polmonite e otite media. Saggi in vitro di aderenza possono essere utilizzati per studiare l&#39;attaccamento di pneumococchi a cellule epiteliali monostrati e di indagare potenziali interventi, come l&#39;uso di probiotici, per inibire la colonizzazione pneumococcica. Il protocollo qui descritto viene usato per studiare gli effetti della salivarius Streptococcus probiotico dall&#39;adesione dei pneumococchi alla linea cellulare epiteliale umano CCL-23 (talvolta indicato come cellule HEp-2). Il test prevede tre fasi principali: 1) la preparazione delle cellule epiteliali e batteriche, 2) l&#39;aggiunta di batteri per monostrati di cellule epiteliali, e 3) individuazione di pneumococchi aderenti da conte vitali (diluizione seriale e placcatura) o quantitativa real-time PCR (qPCR ). Questo technique è relativamente semplice e non richiede attrezzature specializzate diverso da una configurazione coltura tissutale. Il test può essere usato per testare altre specie probiotiche e / o potenziali inibitori di colonizzazione da pneumococco e può essere facilmente modificato per affrontare altre questioni scientifiche riguardanti l&#39;adesione pneumococcica e l&#39;invasione.

I risultati di un esperimento rappresentativo in cui pneumococchi (S. pneumoniae PMP843, un colonizzando 19F isolare) sono stati aggiunti al CCL-23 cellule 1 ora dopo l&#39;aggiunta di S. salivarius, e l&#39;adesione pneumococcica è stata quantificata sia conta vitale e Lyta qPCR sono mostrati in Tabella 2. risultati erano coerenti tra i due metodi sia per il numero assoluto di batteri (presentato come CFU / ml) e l&#39;aderenza%, normalizzato al numero pneumococchi di aderent...

In vitro aderenza possono essere utilizzati per studiare l&#39;attaccamento di Streptococcus pneumoniae di monostrati di cellule epiteliali e di indagare potenziali interventi quali l&#39;uso di probiotici per inibire la colonizzazione pneumococcica.

Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Aderenza Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare la capacità di un probiotico Streptococcus cell levarius di inibire l'adesione pneumococcica a una linea cellulare epiteliale. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto monocapife di cellule epiteliali CCL 23. In una piastra a 24 pozzetti, successivamente vengono aggiunti alla monocapifa i pneumococchi e lo slovar in sequenza e le cellule vengono incubate.Nell'ultimo passaggio, le pozzette vengono lavate per rimuovere i batteri non aderenti. Le cellule epiteliali CCL 23 vengono lisate e il contenuto delle pozzette viene raccolto. Infine, l'impatto di salivarius sull'adesione pneumococcica può essere valutato quantificando il numero di pneumococchi associati alle cellule.Questo metodo aiuta a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie infettive, come ad esempio se i probiotici possano inibire l'adesione di patogeni batterici come il pneumococco. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a indagare sul potenziale utilizzo di Lactobacillus hypnosis, GG e altri probiotici nel tratto respiratorio. A dimostrazione di questa procedura saranno Jane Manning e Zen, dottorandi del n

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Immunologia e Infezioni

Questo protocollo è un test semplice adesione batterica che consiste nel contare il numero di unità formanti colonie batteriche che vengano rispettate su cellule in coltura. Il test è robusto, indipendente dal adesina studiato, e numerose varianti vengono utilizzate nella maggior parte dei laboratori che lavorano su patogenesi batterica.

In vitro di Adesione batterica su mammiferi cellule epiteliali

Fonte: Jagau, H. et al. Infezione da pneumococco di cellule endoteliali umane primarie a flusso costante. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la visualizzazione in tempo reale dell'attaccamento pneumococcico alle stringhe del fattore di Von Willebrand (VWF) su cellule endoteliali in condizioni di flusso costante del terreno. Descrive i passaggi per stimolare il rilascio di VWF, etichettare le stringhe e quantificare il legame batterico.

Valutazione dell'attaccamento pneumococcico alle cellule endoteliali umane primarie in costante flusso di terreno

Fonte: Calatayud Arroyo, M., et al. Valutazione della vitalità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia intestino-microbo ospite-microbo in vitro. J. Vis. Esp. (2018).Questo video dimostra un modello intestinale-microbio in vitro per studiare la vitalità batterica. Una co-coltura di cellule Caco-2 e HT29-MTX viene incubata con batteri pretrattati in condizioni digestive simulate. L'integrità della barriera epiteliale viene valutata utilizzando la resistenza elettrica...

Modello intestinale in vitro per valutare l'adesione batterica e l'internalizzazione

Il video dimostra un saggio di aderenza in fase solida per valutare la formazione di biofilm. In una piastra a più pozzetti, i batteri nei terreni integrati con sali biliari aderiscono alle superfici solide, formando biofilm, che viene confermato dalla colorimetria attraverso la colorazione con cristallovioletto e il trattamento con etanolo.

Un saggio di aderenza in fase solida per valutare la formazione di biofilm

Viene descritta la colonizzazione del nasofaringe murino con streptococco pneumoniae e la successiva estrazione di cellule aderenti o reclutate. Questa tecnica prevede il lavaggio del nasofaringe e la raccolta del fluido attraverso i nares ed è adattabile per varie letture, tra cui la quantificazione differenziale delle cellule e l'analisi dell'espressione dell'mRNA in situ.

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Streptococcus pneumoniae è il patogeno principale che causa una grave polmonite acquisita in comunità e responsabile per oltre 2 milioni di decessi in tutto il mondo. L'impatto dei fattori batterici implicati in palestra o virulenza può essere monitorato in tempo reale in un mouse polmonite o batteriemia modello acuta con batteri bioluminescenti.

A seguito in tempo reale l&#39;impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

La competizione in Streptococcus pneumoniae è mediata da batteriocine, piccoli peptidi antimicrobici con attività inibitoria nei confronti dello pneumococco e di altre specie correlate. Qui descriviamo un saggio di sovrapposizione batterica ottimizzato che consente la caratterizzazione dell'attività della batteriocina e dello spettro inibitorio, l'immunità specifica della batteriocina e il rilevamento di peptidi quorum sensing secreti.

Utilizzando il Overlay saggio misurare Qualitativamente produzione batterica di sensibilità e di pneumococcico batteriocine

Questo studio dettaglia il processo di quantità precisa di gavaging di probiotici per topi neonatali. Il set-up sperimentale è stato ottimizzato per includere ma non è limitato ai probiotici di dosaggio, metodi di somministrazione e la quantificazione dei batteri nell'intestino.

Studi di probiotici in topi neonatali tramite sonda gastrica

Il rilevamento delle interazioni patogeno ospite-batterico basate sull'aderenza fenotipica utilizzando l'imaging di etichettatura a fluorescenza ad alto rendimento insieme a metodi di analisi statistica automatizzati consente una rapida valutazione delle potenziali interazioni batteriche con le cellule ospiti.

Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti

Questo articolo descrive un nuovo modello murino per la transizione dello pneumococco da colonizzatore asintomatico a patogeno che causa malattie durante l'infezione virale. Questo modello può essere facilmente adattato per studiare le interazioni polimicrobiche e ospite-patogeno durante le diverse fasi della progressione della malattia e tra vari ospiti.

Un modello murino per la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno in seguito a co-infezione virale ricapitola la malattia esacerbata dall'età

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per la colonizzazione di topi con pks+ Escherichia coli in condizioni non infiammatorie, nonché metodi non invasivi per la validazione della colonizzazione e la valutazione dell'espansione di pks+ E. coli nelle feci.

Colonizzazione con Escherichia coli di Murine pks+ in condizioni non infiammatorie

Scopri come valutare l'inibizione dell'adesione di Streptococcus pneumoniae mediante Streptococcus salivarius probiotico su monocellule epiteliali CCL 23. Questo metodo in vitro aiuta a sviluppare strategie preventive contro la colonizzazione pneumococcica.

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