Name: Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni In Vitro E In Vivo Per studiare neuronale Morfologia e migrazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Scopri la manipolazione genetica dei neuroni granulari cerebellari per studiare morfologia e migrazione neuronale in vitro e in vivo. Questo metodo elettroporazione aiuta a comprendere lo sviluppo cerebellare postnatale.

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Ringraziamo N. Schwedhelm-Domeyer per l&#39;eccellente assistenza tecnica, C. Martello e S. Papiol per un aiuto con analisi statistiche. Il nostro lavoro è finanziato dalla Max Planck Society, la Deutsche Forschungsgemeinschaft, il Center for Nanoscale Microscopia e Fisiologia Molecolare del cervello (CNMPB), Göttingen, Germania e dal GGNB Junior Gruppo Stipend dell&#39;Università di Göttingen.

CGN possono essere preparati sia dal primo giorno post-natale (P) 5 cuccioli di topo o cuccioli di ratto P6. Seguiamo un protocollo, descritto da Bilimoria e colleghi, che utilizza un inibitore mitotico per selezionare per CGN postmitotic 13. Etica dichiarazione: Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali vivi sono stati condotti secondo il protocollo degli animali, approvato dal &quot;Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit&quot; della Bassa Sassonia, in Germania. Nel test in vitro: 1. Preparazione di plasmidi DNA, Media e buffer per il fosfato di calcio Metodo Transfezione <ol><li> Sciogliere plasmide DNA in acqua privo di endotossine sterile; DMEM (alti livelli di glucosio); fanno 2,5 M CaCl 2; fare 2x HBSS (sciogliere 4 g NaCl, 0,1775 g KCl, 0.095 g di Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,675 g di glucosio e 2,5 g HEPES in 250 ml di acqua ultrapura e aggiustare il pH a 7.05, 7.08 e 7.11). Nota: Quando si preparala soluzione HBSS 2x, pH test che dà i migliori risultati per quanto riguarda l&#39;efficienza di trasfezione di data combinazione di plasmidi. </li></ol> 2. Trasfezione di colture di neuroni <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso di assoni in vitro e dendrite saggio di crescita. Coltivate CGN (piastra da 24 pozzetti con vetrini), isolato da P6 cuccioli di ratto, sono trasfettati in DIV 0 o 1 con precipitato DNA contenente un marcatore fluorescente trasfezione (es. GFP). Dopo la fissazione e immunocitochimica, i neuroni vengono esposte in modo cieco. Le immagini vengono importati in ImageJ e processi sono misurati. Le misurazioni vengono quindi elaborati utilizzando un programma statistico. <ol><li> CGN Seed (20 x 10 6 per 24 pozzetti, BME, siero di vitello al 10%, 2 mM penicillina-Streptomycin-Glutammina (PSG), 25 mM KCl) in acido nitrico-lavato, polyornithine rivestite 12 millimetri vetrini in una piastra da 24 pozzetti con 500 microlitri di media per pozzetto. </li><li> Il giorno in vitro (DIV) 0 (almeno 8 ore dopo la placcatura) o DIV 1, raccogliere i media di crescita e di mantenere a 37 ° C. Lavare i neuroni due volte con 500 ml di DMEM preriscaldata e aggiungere 500 ml di DMEM. </li><li> Inserire neuroni in incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per 45 min. </li><li> Preparare 40 ml precipitato di DNA per ogni ben mescolando: DNA (2-2,5 mg / bene, il 10% del DNA totale dovrebbe essere un marcatore di transfezione es GFP per visualizzarne i neuroni trasfettati), acqua (fino a 18 ml), aggiungere 2 ml di 2,5 M CaCl 2, mescolare bene e aggiungere 20 ml di 2x HBSS. <ol><li> Incubare DNA precipitato per 5 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Aggiungi precipitato DNA a ciascun pozzetto e incubare i neuroni per 18 min in incubatrice. </li><li> Rimuovere mix DMEM / DNA e lavare i neuroni due volte con 500 ml di preriscaldata DMEM. </li><li> Aggiungere raccolta multimediale dal punto 2.2 torna ai neuroni. Se i neuroni saranno in coltura per più di 3 giorni, i media supplemento con glucosio 25 mm a DIV 3 per ricostituire fonte di carbonio. </li><li> Dopo 1-5 giorni, neuroni sottoposti a immunocitochimica utilizzando anticorpi GFP. </li><li> Immagine almeno 30 neuroni individuali a condizione in modo cieco utilizzando un microscopio a fluorescenza. </li></ol> 3. Misurare assoni e dendriti con NeuronJ, un NIH ImageJ Plugin Importante: Assicurarsi che le immagini vengono ridimensionate correctluy utilizzando appropriate pixel: rapporto micron a seconda di ingrandimento e la risoluzione dell&#39;immagine. <ol><li> Converti immagini a 8-bit con ImageJ: Apri immagine, selezionare &#39;Immagine&#39; -&gt; &#39;Tipo&#39; -&gt; &#39;8 bit &#39;-&gt;&#39; Salva immagine &#39;. </li><li> Eseguire NeuronJ plug-in e aprire l&#39;immagine a 8 bit. <img alt="screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot1.jpg" width="500px" /></li><li> Utilizzare l&#39;opzione &#39;Aggiungi&#39; tracciati per monitorare l&#39;assone: click il pulsante sinistro del mouse una volta all&#39;inizio dell&#39;assone e spostare il mouse lungo il processo. Fare doppio click sulla punta dell&#39;assone se traccia corrisponde a forma assonale. <img alt="screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot2.jpg" width="500px" /> Nota: Se la traccia suggerita differire dalla forma assonale, fare clic una volta sul processo assonale per ancorare traccia, fare doppio clic sulla punta dell&#39;assone. </li><li> Clicca su &quot;tracciati misura&quot;, scegliere il &#39;Display misurazioni tracciamento&#39; opzione e premere &#39;Esegui&#39;. Misurazioni Axon sono tutti visualizzati in una nuova finestra. Per i dendriti, scegliere l&#39;opzione &#39;misure gruppo di visualizzazione&#39; e premere &#39;Esegui&#39;. <img alt="screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot3.jpg" width="500px" /> Misurazioni dendriti totali sono tutti visualizzati in una nuova finestra. Salvarli come file separato che può essere aperto in qualsiasi programma di foglio di calcolo. </li><li> In alternativa, per il tracciamento manuale, utilizzare il software Fiji: clic destro su °e l&#39;opzione &#39;retta&#39;, scegliere &#39;la linea a mano libera&#39;, <img alt="screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot4.jpg" width="500px" /> mantenere il tasto sinistro del mouse e tracciare manualmente il processo, premere &#39;Ctrl + M&#39; per misurare. </li><li> Calcola lunghezza / assonale media dendritiche per condizione e utilizzare test statistico appropriato. In elettroporazione in vivo: </li></ol> 1. Attrezzature e Preparazione dei reagenti <ol><li> Avete bisogno di 30 aghi G, distanziale (1-2 mm), siringa, riduttore di volume morto (DVR), elettroporatore e tweezertrodes, piastra elettrica o lampada di calore a raggi infrarossi, lampada a collo d&#39;oca e isoflurano. </li><li> Mettere DVR in dell&#39;ago, quindi collegare l&#39;ago alla siringa, e, infine, mettere distanziale sulla ago (Figura 2). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2.jpg" /> Figura2. Preparazione dell&#39;ago. DVR è tagliata una punta di pipetta 200 microlitri e collocato all&#39;interno dell&#39;ago per ridurre il volume morto. Spaziatore è derivato da una punta di 200 microlitri di carico e viene posizionato sull&#39;estremità dell&#39;ago per regolare la profondità di penetrazione nel cervelletto di circa 2 mm. Unità righello: cm </li><li> Sciogliere DNA in PBS/0.03% Verde veloce. Nota: Come marcatore trasfezione, è vantaggioso utilizzare una proteina fluorescente che è sotto un promotore neurone-specifica (ad es Synapsin) per visualizzare solo i neuroni. 25% del totale plasmide dovrebbe essere il plasmide codificante il marcatore trasfezione. </li><li> Effettuare il 70% di etanolo. </li><li> Miscelare volumi uguali di ottobre e del 30% di saccarosio disciolto in PBS. </li><li> Riempire la siringa con 4 ml di DNA (4 mg / mL di DNA plasmidico in PBS/0.03% rapidi verde). </li></ol> 2. IVE di Rat Pups Diagramma di flusso di IVE: si veda la Figura 3 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-Page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3.jpg" /> Figura 3. Diagramma di flusso di elettroporazione in vivo. P4 cuccioli di ratto sono anestetizzati con isoflurano e DNA plasmidico codificante un marcatore fluorescente trasfezione (es. GFP) viene iniettato nel cervelletto, seguito da esposizione a 5 impulsi elettrici. Cinque giorni dopo, isolato cerebella GFP-positive sono sezionato e sottoposto a immunoistochimica. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale e analizzati utilizzando il software Imaris. I dati sono trattati con un programma statistico. <ol><li> Utilizzare P4 cuccioli di ratto dal ceppo albino (Wistar o Long Evans). </li><li> Anestetizzare cuccioli (uno dopo l&#39;altro) con isoflurano in piccola scatola (ad esempio P1000 box puntale) con 200 ml di isoflurano (imbevuto in tessuto) per 1-2 minuti fino a quando cucciolo non è più in movimento. Fate attenzione che i cuccioli non entrare in contatto wesima Iiquido isoflurano. Monitorare il tempo strettamente individuali cuccioli rispondono diversamente ad anestesia. </li><li> Sterilizzare posteriore della testa del cucciolo con il 70% di etanolo. </li><li> Fissare capo del pup tra il pollice e l&#39;indice e utilizzare la lampada a collo d&#39;oca per individuare cervelletto del pup albino. Il seno trasverso delimita nettamente il mesencefalo (collicolo superiore ed inferiore) a partire da emisferi corticali (Figura 3). Il cervelletto si trova adiacente al mesencefalo e appare in una tonalità più scura. Utilizzare un pennarello indelebile per indicare il cervelletto con un punto. Importante: Conservare pup in posizione fissa! Nota: In caso di anestesia indossare durante questa procedura, esporre cucciolo di isoflurano prima di iniettare il DNA. </li><li> Inserire l&#39;ago (figura 3) e iniettare lentamente 3 ml di DNA nel cervelletto. </li><li> Lasciate che la soluzione di DNA diffusa per 30-60 sec. <ol><li> Inserire la testa del cucciolo tra tweezertrodes in modo che il polo negativo a contatto con la parte posteriore della testa (cerebellaregione r) e che il polo positivo contro il lato opposto della testa (Figura 3). </li><li> Oggetto pup a 5 impulsi elettrici. Regolare la tensione al peso dei cuccioli di garantire una buona efficienza elettroporazione senza compromettere la loro sopravvivenza (Tabella 1). <table border="0"><tbody><tr><td> Peso </td><td> Tensione </td><td> Impulso </td><td> Intervallo </td></tr><tr><td> 8-9 g </td><td> 160 V </td><td> 50 msec </td><td> 950 msec </td></tr><tr><td> 9-10 g </td><td> 165 V </td><td> 50 msec </td><td> 950 msec </td></tr><tr><td> &gt; 10 g </td><td> 170 V </td><td> 50 msec </td><td> 950 msec </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elettroporazione di P4 cuccioli di ratto. </li><li> Lasciate cuccioli recuperare il pad riscaldato o sotto una lampada a raggi infrarossi. Cuccioli di diga di ritorno. Importante: Assicurarsi che fonte di riscaldamento non infliggere ustioni. </li></ol></li><li> Sacrifica cuccioli 5 ​​giorni dopo l&#39;elettroporazione mettendoli in CO 2, seguita da decapitazione. <ol><li> Isolare il cerebella e lo schermo per quelli GFP-positive cerebella utilizzando un microscopio a fluorescenza. </li></ol></li><li> Fix cerebella in 4% PFA O / N a 4 ° C, poi incubare in saccarosio al 30% a 4 ° C fino cerebella lavello a fondo della provetta. </li><li> Incorpora cerebella in OCT/30% di saccarosio e tagliare 40 micron sezioni coronali utilizzando un criostato. Nota: Tratto ogni cervelletto in modo cieco. </li><li> Sezioni soggette a immunoistochimica con l&#39;anticorpo GFP. Controcolorare con colorante nucleare (DAPI o Hoechst 33258) e determinare la localizzazione di almeno 200 neuroni trasfettati per animale. </li><li> Per un&#39;analisi approfondita, suddividere il IGL in due metà, con un conseguente IGL superiore di fronte alla ML e una IGL minore di fronte alla materia bianca e contare i neuroni GFP-positive che risiedono in ogni tempo. Nota: Count neuroni GFP-positive di ogni sezione in modo cieco. </li&gt; </ol> 3. Misurare Dendrite intera, Acquisire le immagini della sezione in x, y, z aereo utilizzando un microscopio confocale Nota: per esempio, utilizzare 40 immagini per una sezione di 40 micron con una z-stwp di 1 micron. <ol><li> Serie di immagini Open in software, Imaris, per generare una immagine 3D di dendriti. </li><li> Clicca su modalità &#39;Superare&#39; per vedere il neurone in 3D. <img alt="screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot5.jpg" width="500px" /></li><li> Selezionare &#39;Aggiungi nuovo filamento&#39; e cliccare su &#39;Skip creazione automatica&#39; per avviare l&#39;analisi semiautomatica. <img alt="screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot6.jpg" width="500px" /> Nota: Analizzare ogni immagine 3D in modo cieco </li><li> Selezionare la scheda &#39;Draw&#39; e &#39;AutoPath&#39;. <img alt="screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot7.jpg" width="500px" /></li><li> Spostare il cursore del mouse sul ccorpo ell e Maiusc + tasto destro del mouse per selezionare il corpo cellulare. Nota: autocalculation dal software potrebbe richiedere alcuni minuti. <img alt="screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot8.jpg" width="500px" /></li><li> Aggiungi percorsi per il filamento (dendriti) usando Shift + click del mouse a sinistra. Nota: I percorsi possono essere visualizzati in tempo reale. <img alt="screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot9.jpg" width="500px" /></li><li> Vai alla finestra delle statistiche ad incandescenza e clicca su &quot;valori specifici, &#39;&#39; dettagliate &#39;e&#39; la lunghezza del filamento dendrite (somma) &#39;per somma di lunghezza totale dendrite. <img alt="screenshot" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot10.jpg" width="500px" /></li><li> Utilizzare appropriati test statistici per analizzare i dati. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Vantaggi e limitazioni del descritto in vitro e in vivo: CGN Colta da mouse e ratti sono ugualmente adatti per le analisi morfologiche. A causa della dimensione più grande di un cervelletto di ratto, la resa di CNGS da cuccioli di ratto supera quello dei cuccioli di topo 3-4x. A parte CGN, neuroni corticali e ippocampali possono essere utilizzati come sistema cultura. Il metodo di fosfato di calcio si traduce in un basso (0,01-5%) efficienza di trasfezione, che è desiderato...

Il cervelletto è un ottimo sistema per studiare i meccanismi di crescita degli assoni e la migrazione. Il cervelletto è stata oggetto di studi anatomici fin dagli albori delle neuroscienze 1. Microscopia moderna e tecniche di immunoistochimica hanno notevolmente ampliato e perfezionato le scoperte iniziali di Santiago, Ramon e Cajal 2-4. Genetica del topo e studi molecolari scoperti fattori di crescita e di trascrizione essenziali nel controllo dello sviluppo del cervelletto, che ha portato ad una maggiore comprensione degli eventi cruciali necessari per il corretto cablaggio dei diversi tipi di neuroni, tra cui neuroni granulari del cervelletto (CGN) 5-7. Il cervelletto è un derivato di rhombomere 1 della hindbrain sviluppo 8. Il labbro rombico, che è parte del tetto del 4 ° ventricolo, dà origine a progenitori neuronali dei granuli cerebellari, che costituiranno la più numerosa popolazione neuronale nelcervelletto adulto 9. Dopo la migrazione rostrale, si depositano nel anlage cerebellare. Qui, mitosi di precursori neuronali dei granuli porta alla drammatica espansione dello strato granulare esterno (EGL), che avviene dopo la nascita nei roditori. Dal EGL, i neuroni iniziano la migrazione verso l&#39;interno attraverso lo strato molecolare (ML), oltre lo strato di cellule di Purkinje a prendere in ultima analisi, la residenza nello strato granulare interno (IGL 2). Durante questo processo migratorio, acquisiscono una forma bipolare con due assoni si estende nella ML. Su ulteriore migrazione, il corpo cellulare migra distanti assoni ei due processi fondono per formare uno biforcato, assone forma di T 10. Successivamente, questi assoni fasciculate e sono indicate come fibre parallele. Stabilitosi nel IGL, CGN crescere dendriti, che formano artigli dendritiche stabilire sinapsi con le fibre di muschio. Per esaminare processi fondamentali nel cervelletto sviluppo, un combinato in vitro e in vivo approach consente di ottenere risultati affidabili e conclusioni. CGN sono non solo più numerosi neuroni del cervelletto ma dell&#39;encefalo e possono essere coltivate a elevata purezza 11-13. Nella cultura, questa popolazione neuronale molto omogenea diventa rapidamente postmitotico e acquisisce una morfologia polare con assoni e dendriti facilmente identificabili. CGN coltura hanno dimostrato di essere estremamente utile per studiare i vari aspetti dello sviluppo neuronale, tra cui la proliferazione progenitore, la differenziazione, assonale e lo sviluppo dei dendriti, migrazione neuronale, l&#39;apoptosi e le proprietà elettrofisiologiche (14-19 e molti altri). L&#39;uso della manipolazione genetica ha ampliato la versatilità di CGN colti e consentito per una visione più meccanicistica nei suddetti eventi. La trasfezione di neuroni in coltura con bassa efficienza fosfato di calcio o metodi lipofile seguiti da immunocitochimica con marcatori polarità o software supportato da analisi di facilitareTATI la valutazione ad esempio la morfologia dei singoli neuroni in coltura neuronale denso. Con questo approccio, il ruolo delle proteine ​​di interesse in assoni e dendriti crescita può essere studiato 20-25,26-28. Questo sistema di coltura però è meno utile per analizzare migrazione neuronale, come la migrazione è molto limitata nelle culture ad alta densità e richiederebbe co-colture. L&#39;analisi in vitro di assoni e dendriti crescita consente anche per l&#39;esame di proteine ​​interconnessi di una via di segnalazione utilizzando combinazioni di RNA interference (i), sovra-espressione o piccole molecole. Per stabilire la rilevanza della proteina di interesse in assoni e dendriti regolazione della crescita o la migrazione neuronale, l&#39;elettroporazione in vivo (IVE) tecnica permette l&#39;analisi in via di sviluppo corteccia cerebellare. Per il fatto che lo sviluppo cerebellare nei roditori estende strada nelle prime due settimane dopo la nascita, il cervelletto rappresenta un accessibstruttura del cervello per le manipolazioni genetiche per esaminare lo sviluppo di assoni e dendriti, migrazione neuronale, sinaptogenesi e apoptosi 20-24,29,30,26,27,31-34. Inoltre, questo modello di sistema è utile anche per altri aspetti dello sviluppo neuronale che richiedono la corteccia cerebellare intatta come assone pathfinding, il cablaggio e la connettività dei neuroni e delle interazioni neuroni-glia Preso insieme, questo protocollo prevede in vitro e in vivo le tecniche per affrontare un approccio complementare per quanto riguarda la morfogenesi neuronale e la migrazione.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Si-1-4011</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2533</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Appli-Chem</td><td>A3652</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Actavis Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 e pinzette</td><td>Harvard Apparecchio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza e fotocamera</td><td>Microscopio</td> confocale Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>SP2</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.4.2</td><td>Bitplane, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suggerimento di caricamento 1-200 &micro; l</td><td>Costar</td><td>4853</td><td></td></tr><tr><td>Puntale per pipette 200 &; micro; l</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.502</td><td></td></tr><tr><td>Microlancia 3 aghi, 30 G</td><td>BD</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>50 & micro; l siringa a tenuta di gas 1705</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Menzel Glaeser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; in vitro</em&gt; e<em&gt; in vivo</em&gt; per studiare neuronale morfologia e migrazione

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Eventi dello sviluppo del cervello, tra cui la morfogenesi neuronale e migrazione sono processi altamente orchestrati. In vitro e in vivo analisi consentono di una caratterizzazione approfondita per identificare meccanismi coinvolti in questi eventi. Neuroni granulari cerebellari (CGN) che sono derivati ​​dal cervelletto di sviluppo sono un sistema modello ideale che consente analisi morfologiche. Qui, descriviamo un metodo di come manipolare geneticamente CGN e come studiare axono-e dendritogenesis dei singoli neuroni. Con questo metodo gli effetti dell&#39;interferenza RNA, sovraespressione o piccole molecole possono essere confrontati per controllare neuroni. Inoltre, la corteccia cerebellare roditore è facilmente accessibile in sistema vivo a causa del suo sviluppo postnatale predominante. Vi presentiamo anche una tecnica di elettroporazione in vivo per manipolare geneticamente il cerebella sviluppo e descrivere la successiva cerebellare analisi per valutare la morfologia neuronale unand migrazione.

Per analizzare la morfologia della CGN in risposta a differenti condizioni di coltura, abbiamo trasfettato i neuroni sul DIV 0 come descritto sopra. Dopo trasfezione, abbiamo messo una serie di neuroni in pieno mezzo (BME, siero di vitello al 10%, 2 PSG mM, 25 mM KCl) e un&#39;altra serie in minima quantità di terreno contenente insulina (BME, glucosio 25 mM, 2 PSG mm, 10 mg / insulina ml). Abbiamo sottoposto i neuroni a immunocitochimica utilizzando l&#39;anticorpo GFP a DIV 1, 2, e 3, seguita da assoni e dendriti di m...

Morfogenesi neuronale e la migrazione sono eventi cruciali alla base un corretto sviluppo del cervello. Qui, descriviamo i metodi per manipolare geneticamente colture di neuroni granulari del cervelletto e del cervelletto in via di sviluppo per la valutazione della morfologia e delle caratteristiche migratorie dei neuroni.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare l'effetto della proteina di interesse sulla migrazione neuronale e sulla morfologia. Questo viene ottenuto mediante elettroporazione dei cervelletti di cuccioli di ratto P4. Come secondo passaggio, si esegue l'immunohistochimica su sezioni di cervelletti positivi per GFP, che consente la visualizzazione dei neuroni elettroporati.Successivamente, le sezioni immunoistochimiche vengono analizzate mediante imaging al fine di misurare la distanza della migrazione neuronale e la lunghezza dei processi neuronali. I risultati ottenuti mostreranno l'effetto della proteina di interesse sulla migrazione neuronale e sulla morfologia nel contesto del cervelletto in via di sviluppo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'aspirazione in utero, è che il cervelletto postnatale è facilmente accessibile.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo neurologico, poiché permette di chiarire i meccanismi alla base della migrazione neuronale e della morfogenesi. Una dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale, in quanto il corretto indirizzamento del sito

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Qui vi presentiamo un metodo per isolare e cultura dei granuli cerebellari cellule progenitrici dei neuroni e neuroni granuli cerebellari da mouse postnatale.

Isolamento e la coltura di cellule post-Natal Neuron cerebellare granuli mouse progenitore e Neuroni

Per condurre una rapida valutazione della funzione dei geni nello sviluppo della corteccia cerebrale, si descrivono i metodi che comportano...

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

Questo video dimostra la generazione di un modello di lesione neuronale nei neuroni dei granuli cerebellari primari di topo. Delinea i passaggi coinvolti nell'induzione del danno neuronale utilizzando NMDA, un agonista del recettore dei neurotrasmettitori eccitatori, e glicina, un co-agonista. NMDA e glicina si legano a specifici recettori neuronali, causandone la sovrastimolazione e provocando un massiccio afflusso intracellulare di calcio, che porta al danno e alla morte delle cellule...

Modellazione del danno neuronale nei neuroni dei granuli cerebellari primari di topo

Fonte: Chan, U., et al., Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei neuroni dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi. J. Vis. Exp. (2021).Questo video dimostra l'analisi dello sviluppo dei neuroni dei granuli cerebellari mediante l'imaging di fette di tessuto cerebrale prefissate da topi etichettati con una proteina fluorescente, Acquisizione di immagini Z-stack ad alta risoluzione con un microscopio confocale e misurazione di parametri...

Visualizzazione della sinaptogenesi dei neuroni dei granuli cerebellari in diversi stadi di sviluppo

Fonte: Bénard, M., et al. Imaging ex vivo della migrazione postnatale delle cellule dei granuli cerebellari mediante macroscopia confocale. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra un metodo macroscopico confocale per tracciare la migrazione ex vivo di cellule granulari in fette cerebellari da cervelli di ratto postnatale.

Imaging ex vivo della migrazione postnatale delle cellule dei granuli cerebellari mediante macroscopia confocale

Durante lo sviluppo postnatale del cervelletto, le cellule granulari immature originate dalla zona germinale mostrano modalità distinte di migrazione per raggiungere la loro destinazione finale e per stabilire reti neuronali. Questo protocollo descrive la preparazione di fette cerebellari e l'approccio macroscopico confocale utilizzato per studiare i fattori che regolano la migrazione neuronale.

Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Studi convenzionali di perdita di funzione di geni mediante animali knockout sono stati spesso lunghe e costose. Basato su elettroporazione mutagenesi somatica CRISPR-mediata è un potente strumento per capire il gene funziona in vivo. Qui, segnaliamo un metodo per analizzare i fenotipi di knockout in cellule di proliferazione del cervelletto.

CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'Utero basati su elettroporazione trasferimento del Gene

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Qui descriviamo un metodo per visualizzare la sinaptogenesi dei neuroni granuli nel cervelletto del topo nel corso dello sviluppo postnatale del cervello quando queste cellule perfezionano le loro strutture sinaptiche e formano sinapsi per integrarsi nel circuito cerebrale generale.

Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi

Scopri la manipolazione genetica dei neuroni granulari cerebellari per studiare morfologia e migrazione neuronale in vitro e in vivo. Questo metodo elettroporazione aiuta a comprendere lo sviluppo cerebellare postnatale.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni

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