Name: Ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi Parhyale hawaiensis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Impara l'ablazione manuale di singole blastomere da embrioni di otto cellule di Parhyale hawaiensis. Questo metodo consente di rimuovere le cellule precursore della linea germinale per studiare lo sviluppo embrionale nei crostacei.

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Ringraziamo Rayhan Arif e Hassaan Shahawy per il lavoro della macchina fotografica, Tripti Gupta e Frederike Alwes per l&#39;assistenza affinando la tecnica di ablazione delle cellule, e membri del laboratorio Extavour per il feedback sui dati, video e manoscritto. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla Harvard Stem Cell Institute (Seed numero di Grant SG-0057-10-00) Ellison Medical Foundation (New Scholar Award numero AG-NS-07010-10) alla CGE, e premi Harvard programma del college di ricerca per ARN.

Commenti che possono essere utili in esecuzione di alcuni passaggi sono indicati in corsivo. 1. Giorno 1: Preparazione dei Materiali <ol><li> Preparare i seguenti materiali (cfr. tabella dei Materiali e attrezzature): <ul><li> 15 cm e 22 cm pipette Pasteur </li><li> Diamante scriba </li><li> acqua di mare artificiale filtrata (salinità tra 0,0018-0,0020) contenente 1 mg / ml di amfotericina B (1:100 di una soluzione madre di 100 mg / ml), 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (1:50 di una soluzione madre contenente 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 mg / ml di streptomicina) </li><li> filtrata acqua di mare artificiale (salinità tra 0,0018-0,0020) senza additivi </li><li> un grande contenitore di plastica per le coppie abitative (di almeno 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> di piccole dimensioni (3 cm o 5 centimetri) piastre Petri rivestite con Sylgard </li><li> di piccole dimensioni (3 cm o 5 centimetri) piastre di Petri </li><li> un vetro d&#39;orologio o lastra di vetro multi-bene </li><li> Pinza (usiamo una pinza smussato derivati ​​from vecchio Dumont # 5 pinze accidentalmente danneggiati in altre procedure di laboratorio, che abbiamo riproposto utilizzando una pinza pietra per affilare ad assicurare che le estremità della pinza sono lisce, che entrambi i denti sono della stessa lunghezza, e che non hanno più punti taglienti. Pinza estremamente sottili, come i nuovi Dumont # 5 pinze, sono indesiderabili in quanto possono danneggiare gli embrioni e / o femmine). </li><li> una pipetta Pasteur con l&#39;estremità allargata (vedi punto 1.2) </li><li> uno strumento di recupero embrione costituito da un sottile filo di tungsteno curvo incorporato nella estremità sottile di una pipetta Pasteur (potrebbe essere sostituito da un&#39;alternativa attuare; vedere 1.3) </li><li> una pipetta bocca con una piccola apertura (vedi punto 1.4) </li><li> un ago di vetro fatto da un capillare di vetro tirato (vedi punto 1.5 che segue) </li></ul> Non ci sono materiali tossici per gli esseri umani sono utilizzati in questo protocollo. Tuttavia, i ricercatori dovrebbero assicurare che indossano guanti o altri indumenti protettivi, come richiesto dal guidel gestione del rischioines della loro istituzione. </li><li> Per rendere la pipetta Pasteur allargato, primo punteggio intorno una pipetta Pasteur 15 centimetri nel punto in cui la pipetta comincia a ridursi con un scribe diamante, avvolgere la regione segnato della pipetta in un asciugamano Kimwipe o carta per proteggere le dita, e poi accuratamente rompere la punta alla linea di frattura. Tenere l&#39;estremità rotto della pipetta su una fiamma del bruciatore Bunsen per alcuni secondi per smussare i bordi. L&#39;apertura dovrebbe essere leggermente più stretta della larghezza massima della pipetta. </li><li> Per rendere lo strumento di dissezione filo di tungsteno, inserire un filo di tungsteno nell&#39;estremità di un 15 centimetri pipetta Pasteur di vetro, premuto brevemente su un becco Bunsen per fondere il vetro, che fissa il filo in posizione. Usare pinze per curva dolcemente alla fine del filo a forma di uncino. Vedi Figura 3 per un esempio di una forma appropriata per questo strumento. </li><li> Per fare una piccola apertura per la pipetta bocca, tirare l&#39;estremità sottile di un 22 centimetri pipetta Pasteur in due parti over una fiamma, e rompere la punta del piede di biella. Inserire nell&#39;estremità del titolare pipetta bocca. </li><li> Effettuare l&#39;ago di vetro che verrà utilizzato per perforare i blastomeri di interesse durante la procedura di ablazione mediante estrattore ago. Un ago opportunamente sagomato è mostrato in Figura 4. Questo ago è stato tirato su un estrattore Sutter P97 ago utilizzando un programma con i parametri 2x (calore = 566, tirare = 100, velocità = 20 time = 250) + 1X (calore = 566, tirare = 100, velocità = 100, tempo = 250). Il programma e specifico strumento usato per fare l&#39;ago può variare, ma l&#39;ago deve avere un punto di fine, ma anche essere abbastanza robusto da non rompersi quando spinto contro il corion dell&#39;embrione. </li></ol> 2. 1 ° giorno: Coppie Gathering Parhyale affini <ol><li> Utilizzare la pipetta Pasteur ampliato (fase 1.2 di cui sopra) per raccogliere accoppiamento P. coppie hawaiensis dal grande contenitore di coltura, e trasferirli in un contenitore contenente separato cmagra acqua di mare artificiale. Non è necessario che questa acqua di mare filtrata. E &#39;meglio raccogliere le coppie di accoppiamento nel tardo pomeriggio e lasciare le coppie a temperatura ambiente (20-23 ° C) durante la notte, in modo che la mattina dopo, la maggior parte degli embrioni sono stati recentemente fecondato e depositato, e quindi a presto scissione fasi adatto per ablazione. Raccogliere almeno 20 coppie di accoppiamento per garantire che alcune femmine saranno portando primi scissione embrioni stadio la mattina seguente. </li></ol> 3. 2 ° giorno: Raduno Parhyale embrioni <ul><li> La mattina successiva, infondere acqua di mare artificiale filtrata (FASW) con CO 2. Alcune delle femmine avranno nuotato liberi dai loro maschi durante la notte; raccogliere queste femmine separati e anestetizzare in FASW / CO 2. I restanti maschi spaiati possono essere rimossi dal contenitore coppia di accoppiamento e restituito al grande cultura. Coppie di accoppiamento rimanenti possono essere salvati per la raccolta di embrioni tardinel corso della giornata o il giorno successivo. </li><li> Trasferire una singola femmina anestetizzato portando embrioni per un vetro da orologio in FASW / CO 2. Tutte le femmine separate probabilmente hanno depositato le uova, che sarà visibile ad occhio il rosa pallido o sferoidi viola attraverso le piastre coxal trasparenti delle femmine (Figura 1A). Per determinare se gli embrioni sono nelle fasi iniziali scissione e quindi adatto per blastomeri ablazione, il ricercatore dovrà rimuovere gli embrioni dal sacchetto covata ed esaminarli al microscopio. </li><li> Visualizzazione della procedura sotto un microscopio da dissezione, afferrare i piatti coxal lungo un lato del corpo con una pinza. Gli embrioni saranno visibili nel sacchetto covata ventrale tra questi piatti coxal (Figura 1B). </li><li> Inserire il sottile, strumento filo curvo (figura 3; precedente punto 1.3) nell&#39;estremità posteriore del sacchetto covata, e sollevare delicatamente il filo verso l&#39;estremità anteriore del sacchetto covata per separare la covatarivestimenti sacchetto (questi sono modificati appendici ventrali chiamati oostegites 30), aprendo il sacchetto ed allentando gli embrioni. Gli embrioni che si trovano entro la prima ora o così di essere licenziati sono tutti racchiusi all&#39;interno di una sottile membrana trasparente che sarà facilmente interrotto dallo strumento a filo; questa membrana scompare di circa 2-3 ore dopo la deposizione delle uova e gli embrioni non sono vincolati tra loro o alla femmina in alcun modo da questo punto in poi tutta l&#39;embriogenesi. Se i ricercatori trovano scomodo o difficile da manovrare l&#39;utensile filo curvo per rimuovere embrioni dal sacchetto covata, un&#39;alternativa implementare può essere utilizzato, purché i movimenti sono delicati e nessuna pressione duro viene applicato al embrioni o il sacchetto covata. Altri strumenti adeguati per rimuovere gli embrioni dal sacchetto covata includono pinze smussate o un capillare di vetro con un&#39;estremità sigillata e levigato. </li><li> Utilizzare un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur per svuotare l&#39;acqua attraverso il sacchetto covata aperta, spingendo fuori tegli embrioni, che dovrebbe depositarsi sul fondo del vetro da orologio. Trasferire la femmina per pulire FASW (senza CO 2) per permettere il recupero prima di reintrodurre lei alla cultura principale. Più femmine possono essere collocati nello stesso piatto di recupero, ma le femmine permettono di recuperare completamente prima di restituirli alla cultura principale, in quanto possono essere mangiati da altri animali se sono ancora parzialmente anestetizzati. </li><li> Utilizzare un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur per trasferire gli embrioni in una capsula di Petri con FASW pulito, e visualizzare al microscopio per determinare la loro fase embrionale. Embrioni distinti che sono alla terza fenditura (fase 4 5), che sono adatti per questa procedura. Dovrebbe inoltre essere possibile applicare questo protocollo per ogni fase scissione prima della formazione del disco di germi (stadi 7-8 MAGGIO). </li></ul> 4. 2 ° giorno: ablazione di singole cellule <ol><li> Riempire piastra di Petri Sylgard alberato con uno strato di FASW superficiale. Utilizzare un inalterata 15 centimetri Pasteur pipipetta per trasferire un singolo embrione alla piastra. </li><li> Utilizzando pinze smussato, inclinarsi leggermente l&#39;embrione per identificare la cella da asportare (Figure 2A e 2B). La linea germinale precursore g può essere identificato come il micromere più piccolo, che si trova sulla cima della più piccola Mav macromere. Inoltre, g non contattare direttamente la cellula en, che è il micromere direttamente di fronte, come le ml micromeri mesoderma precursori e la quota di mr margine di una cella nel centro dell&#39;embrione. Mr è il blastomere a destra di g, e ml è il micromere a fianco di g. Le macromeres sorella di mr, ml, e en sono i precursori ectoderma Er, El, e Ep, rispettivamente. </li><li> Con una pinza in left mano se il ricercatore è di mano destra (o la mano destra se il ricercatore è mancino), orientare l&#39;embrione con la cella di interesse a destra (oa sinistra se il ricercatore è mancino), e afferrare delicatamente l&#39;embrione tra le pinze per stabilizzarlo. </li><li> Utilizzando un ago tirato vetro (passo 1.5 sopra; la figura 4), ​​forare delicatamente la cella di interesse. Non inserire l&#39;ago troppo, in modo da non spingere l&#39;ago nelle celle vicine o sotto la cella di interesse. L&#39;ago ha solo per forare la membrana cellulare e corion sottostante, e non deve estendersi profondamente nella cella da asportare. </li><li> Sostituire l&#39;ago utilizzato per forare l&#39;embrione per la fine del vetro di una pipetta bocca con una bella tirata Pasteur puntale (precedente punto 1.4). Tenere la punta della pipetta vicino al foro creato nella cella di interesse, e applicare molto delicata aspirazione. </li><li> Molto premere delicatamente l&#39;embrione con le pinze. Dato che il contenuto del blastomera viene spinto fuori dal corion attraverso il foro creato nel passaggio 4.4, succhiare in pipetta bocca per consentire una visuale libera dell&#39;embrione. Se il foro è abbastanza grande, il nucleo della cellula perforato può essere visto emergere pure. Questo è un buon controllo per assicurarsi che tutto il contenuto della cella sono state rimosse e non possono essere rigenerata. </li><li> Osservare attentamente l&#39;embrione come blastomere di interesse viene rimosso. Il bordo della cella forato retrocederà verso il foro del corion, rendendo l&#39;intersezione delle celle sottostanti visibili. Continuare ad applicare la pressione fino a quando tutti blastomero di interesse è stato rimosso. Utilizzare pinze a rotolare l&#39;embrione da un lato all&#39;altro e confermare visivamente che tutto il blastomero di interesse è andato. </li><li> Utilizzando un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur, trasferire l&#39;embrione pulire FASW + (FASW + 1 mg / ml di amfotericina B, 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina). </li><li> Sollevare embrioni blastomeri-ablazione a singoli pozzidi una piastra a 48 pozzetti pulita in FASW +, cambiando il 50% di antibiotico-FASW integrato + giornaliero. Nelle nostre mani embrioni sopravvivere e svilupparsi bene, anche a seguito di ablazione, in una gamma di temperature di 18-28 ° C. I ricercatori dovrebbero aumentare i loro embrioni a una temperatura per la quale hanno una superficie pulita (ma non necessariamente sterile) sul quale generare gli embrioni con il minimo disturbo. Per poter confrontare i tempi degli eventi di sviluppo in embrioni blastomeri-ablazione con controlli, rimandiamo il lettore alle informazioni dettagliate messa in scena dello sviluppo che è disponibile per gli embrioni sollevate a 18 º C 4, 25 º C 4, e 26 º C 5,6. </li></ol>

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<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li>
<li>Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmitz%2C+EH+%22Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates%22">Microscopic Anatomy of Invertebrates</a>. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descriviamo un protocollo per l&#39;ablazione manuale e rimozione fisica completa di singoli blastomeri dalle fasi iniziali della scissione del anfipode P. hawaiensis. Dimostriamo l&#39;uso di questo protocollo rimuovendo la singola linea germinale cellula precursore g da una fase embrionale di otto cellule, e dimostrare che l&#39;ablazione ha avuto successo, confermando l&#39;assenza di s &#39;g cellule figlie in embriogenesi più tardi. Questo protocollo può essere utilizzato ...

Il Parhyale hawaiensis anfipode crostaceo è emerso negli ultimi dieci anni come organismo modello promettente con un grande potenziale per l&#39;uso in biologia dello sviluppo evolutivo di ricerca 1. Tra gli artropodi, la maggior parte dei sistemi modello sono insetti, e il più ampiamente studiati di questi è il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. D. melanogaster è un membro dell&#39;ordine dei Ditteri insetti, e come tale visualizza molte caratteristiche embrionali derivate rispetto a quelli degli insetti basally ramificazione 2. Inoltre, gli insetti sono annidati all&#39;interno del subphylum Pancrustacea 3, il che significa che gli insetti hanno i loro parenti più stretti all&#39;interno del gruppo di lunga data &quot;naturale&quot; chiamato pancrustaceans, e che questo gruppo è parafiletico. Ciò suggerisce che oltre alla ramificazione basally modelli insetti, studi di altri crostacei sono necessari per ottenere una visione più ampia della storia evolutiva dei tratti di sviluppo unmeccanismi molecolari nd che sono stati così ben studiate in D. melanogaster. Tuttavia, poche crostacei sono stati ben stabiliti per analisi di laboratorio sperimentale di sviluppo. Il anfipode P. hawaiensis è altamente trattabile sistema modello di laboratorio, suscettibili di una serie di tecniche sperimentali. Anfipodi mostrano molte caratteristiche uniche nel loro superorder genitori Peracarida (tramogge spiaggia, scudi, e gamberetti così), e sono quindi pensati per essere relativamente derivato all&#39;interno di questo gruppo di crostacei. Tuttavia, la relativa facilità di manipolazione genetica embrionale e funzionale offerto da Parhyale rendono questo anfipode una preziosa aggiunta alla corrente inventario di organismi modello. Come un animale da laboratorio, P. hawaiensis offre molti vantaggi. Gli animali sono tolleranti ad una vasta gamma di temperature e salinità, e sopravvivono bene in grandi culture di acqua di mare artificiale 1. E &#39;facile distinguere between maschi e femmine sulla base di differenze morfologiche evidenti, più in particolare, i grandi, uncinate, appendici tronco anteriori che i maschi usano per afferrare le femmine durante l&#39;accoppiamento. Per il lavoro embrionale e dello sviluppo, P. hawaiensis ha diverse caratteristiche molto interessanti. Embriogenesi dura circa 10 giorni e il tempo per la maturità sessuale è di circa sei settimane a 28 ° C (ma si noti che Parhyale sopravvive bene a temperature che variano da circa il 20-30 º C, e che informazioni dettagliate messa in scena dello sviluppo è disponibile per gli embrioni sollevate a 18 º C 4 , 25 ° C 4, e 26 ° C 5,6). Adulti si accoppiano tutto l&#39;anno in laboratorio, in modo da embrioni sono disponibili in qualsiasi periodo dell&#39;anno. Le femmine depongono 2-20 (a seconda dell&#39;età delle donne) uova fecondate in un sacchetto covata ventrale che si trova tra le prime paia di zampe (Figure 1A e 1B), ed è possibile raccogliere questi embrionis molto presto nello sviluppo senza uccidere la femmina o danneggiare gli embrioni (Figura 1C). Gli embrioni sopravvivono in acqua di mare artificiale filtrata fino alla schiusa, possono essere fissati per l&#39;espressione genica o successiva analisi istologica 7, e una tabella dettagliata di gestione temporanea permette l&#39;identificazione precisa dei progressi attraverso lo sviluppo 5. Protocolli robusti sono stati utilizzati per effettuare analisi di espressione genica mediante ibridazione in situ 8-15 o immunoistochimica 4,16,17, knockdown funzionale mediante RNA interference 13,15 o Morpholinos 12, e la linea germinale stabile transgenesi 18. Utilizzando il sistema di transgenesi, espressione inducibile 14 e trappola enhancer 19 metodi possono anche essere usati per studiare la funzione del gene in P. hawaiensis. Mentre una sequenza del genoma a disposizione del pubblico non è al momento disponibile, un trascrittoma contenente le trascrizioni prodotta durante oogenesi e embriogenesi ha apen de novo assemblati e annotati 20, e depositati in un database consultabile 21, facilitando la scoperta del gene. In sintesi, P. hawaiensis è un organismo modello molto maneggevole adatto per molteplici approcci sperimentali e genetici per comprendere lo sviluppo. A differenza delle prime fratture sinciziale di D. melanogaster, P. embrioni hawaiensis fendere holoblastically segue fecondazione (Figura 2A). Lineage tracing analisi ha mostrato che dal terzo clivaggio, ciascuno dei terzi blastomeri scissione è specificamente destinata a dare origine ad uno dei tre strati germinali o la linea germinale 6 (Figura 2B). Questi dati, insieme ai dati di microarray 22, linea cellulare analisi 6,23, e gli esperimenti di isolamento blastomere 4 hanno suggerito che le potenzialità di sviluppo sono separate da almeno alcuni terzi blastomeri scissione di eredità asimmetrica del cell determinanti destino. Pertanto, in esperimenti blastomere ablazione in cui il precursore linea germinale (chiamato &quot;g&quot; nella linea cellulare nomenclatura Parhyale 6) è stato rimosso nella fase otto cellule, embrioni mancavano cellule germinali in successivi stadi di sviluppo 4, come indicato dall&#39;assenza di cellule esprimendo la proteina Vasa, che è un marker germinale nella maggior metazoi 24. Al contrario, somatiche esperimenti ablazione blastomeri hanno mostrato che P. embrioni hawaiensis possiedono anche notevoli capacità di regolamentazione, in modo tale che le sorti del mesoderma o ectoderma blastomeri precursori ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti 25 blastomeri. Come regolativo sostituzione destino delle cellule può verificarsi, e il grado di autonomia adozione destino delle cellule somatiche da blastomeri, rimane sconosciuto. Sperimentali tecniche embriologiche come blastomere ablazione può essere utile a comprending l&#39;autonomia relativa e nonautonomy delle decisioni destino delle cellule 26,27 e sono quindi di interesse per lo studio di P. hawaiensis embriogenesi. Negli esperimenti che hanno dimostrato la sostituzione regolatore del ectodermici e mesodermici lignaggi, ablazione blastomeri è stata eseguita mediante iniezione 28 e la successiva eccitazione coloranti fototossiche 25. Mentre questa tecnica è efficace a uccidere il blastomeri (s) iniettato, non rimuove completamente il corpo cellula morta dall&#39;embrione. Inoltre, sono state osservate differenze tra i dati raccolti attraverso il lignaggio delle cellule agli stadi gastrulazione dell&#39;embriogenesi iniettando blastomeri con traccianti fluorescenti lignaggio 28,29, ei dati raccolti seguendo blastomeri imperturbati attraverso lo sviluppo degli stessi stadi embrionali 23. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni. Abbiamo già pubblicato i risultati della linea cellulare analisi degli embrioni in cui singole cellule sono state asportato manualmente 23. Tuttavia, le delicate operazioni necessarie per rimuovere i singoli blastomeri dai primi scissione embrioni fase non sono ancora state pienamente descritte. Qui vi presentiamo un protocollo per la raccolta di P. embrioni hawaiensis e ablazione manuale di un singolo blastomero da un embrione di otto cellule. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di ottenere la rimozione completa del corpo cellulare dall&#39;embrione, che permette l&#39;osservazione dei comportamenti cellulari e competenze destino cellulare delle restanti cellule durante l&#39;embriogenesi e sviluppo post-embrionale. Il nostro protocollo mostra rimozione del precursore g germinale (Figura 2C), ma può essere applicato a qualsiasi cella nella fase di otto cellule, o di blastomeri di scissione fasi precedenti. In linea di principio, questo protocollo potrebbe essere applicato a rimuovere le singole cellule da embrioni precoci fase scissione di Other holoblastically cleaving invertebrati marini.

<table><tbody><tr><td>Pipetta Pasteur da 15 cm</td><td>Wheaton</td><td>53499-630 VWR</td><td>Per il trasferimento di embrioni intatti e ablati con blastomero da una piastra all'altra.</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur da 22 cm</td><td>Wheaton</td><td>53499-632 VWR</td><td>Per la realizzazione di puntali per pipette orali.</td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 3 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>25382-334 VWR</td><td>Utilizzare un po' inalterato per raccogliere e conservare gli embrioni; rivestire alcuni con uno strato di Sylgard (vedi sotto) per creare una superficie di lavoro per l'ablazione dei blastomeri.</td></tr><tr><td>Piastre a 48 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-004 VWR</td><td>Per la coltura di embrioni dopo l'ablazione.</td></tr><tr><td>Filtri per bottiglie 0,2 &; micro; m</td><td>Nalge Nunc International</td><td>28199-296 VWR</td><td>Per la creazione di FASW (vedi sotto).</td></tr><tr><td>Bruciatore Bunsen</td><td>VWR</td><td>89038-530 VWR</td><td>Per la creazione di un utensile a filo di tungsteno e di una pipetta con punta fine.</td></tr><tr><td>Graffietto a diamante</td><td>Musco Sports Lighting</td><td>52865-005 VWR</td><td>Per la creazione di pipette Pasteur a bocca larga per il collezionismo di coppie.</td></tr><tr><td>Forcipe</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>11050-10 Strumenti di Fine Science</td><td>Per trattenere femmine anestetizzate durante la rimozione di embrioni dalla sacca di covata. Non è necessario che si tratti di pinze Dumont a punta fine: le punte possono essere smussate almeno quanto quelle delle pinze per le quali è riportato il numero di catalogo.</td></tr><tr><td>Fungizone-Amfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A2942 Sigma Aldrich</td><td>Aggiungere a FASW fino a una concentrazione finale di 1 mg/ml e utilizzare questa soluzione per coltivare embrioni ablati con blastomero.</td></tr><tr><td>Capillari in vetro lunghi 4 pollici, 1/0,58 OD/ID (mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4 World Precision Instruments</td><td>Per realizzare aghi per perforare il blastomero da ablare.</td></tr><tr><td>Vetro orologio 300 mm di diametro</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 70543-30 Scienze della microscopia elettronica</td><td>Da utilizzare nella rimozione di embrioni dalla sacca di covata di femmine anestetizzate.</td></tr><tr><td>Acqua di mare artificiale Instant Ocean (ASW)</td><td>Gli</td><td>ecosistemi acquatici Instant Ocean IS160</td><td>producono ASW sciogliendo il sale in acqua deionizzata a una salinità di 1,022-1,024.</td></tr><tr><td>Acqua di mare artificiale filtrata Instant Ocean (FASW)</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>Use 0.2 &micro; m filtri per sterilizzare ASW. Preparare in piccole quantità (< 250 ml) secondo necessità.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>21905-026 VWR</td><td>Per rompere in sicurezza l'estremità fine delle pipette Pasteur modificate per la raccolta di coppie.</td></tr><tr><td>Adattatore per pipetta orale</td><td>Drummond Labware</td><td>A5177-5EA Sigma Aldrich</td><td>Inserire la punta della pipetta Pasteur tirata fine in questa estremità, da utilizzare per rimuovere il contenuto delle cellule estruse durante la procedura di ablazione.</td></tr><tr><td>Tubo per pipette per bocca</td><td>Aldrich</td><td>Z280356 Sigma Aldrich</td><td>Taglialo in modo che sia abbastanza lungo da poter essere appeso comodamente al collo durante la procedura di ablazione.</td></tr><tr><td>Estrattore di aghi</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P97 Sutter Instrument Company</td><td>Per realizzare aghi da capillari di vetro per perforare il blastomero da ablare.</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>Mediatech</td><td>45000-650 VWR</td><td>Aggiungere a FASW fino a una concentrazione finale di 100 unità/ml di penicillina e 100 mg/ml di streptomicina e utilizzare questa soluzione per coltivare embrioni ablati con blastomero.</td></tr><tr><td>Bulbo di gomma</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Sciences 100488-418 VWR</td><td>Per l'utilizzo delle pipette Pasteur per trasferire gli embrioni da un piatto all'altro.</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>K. R. Anderson, Inc.</td><td>NC9659604 Fisher Scientific Make</td><td>up secondo le istruzioni del produttore. Versare uno strato di 2-5 mm di spessore in una capsula di Petri di 3 cm per creare una superficie di lavoro per l'ablazione dei blastomeri.</td></tr><tr><td>Filo di tungsteno 0,004 pollici di diametro</td><td>A-M Systems</td><td>719000 A-M Systems</td><td>Utilizzare questo per realizzare uno strumento per la rimozione di embrioni dalla sacca di covata di femmine anestetizzate.</td></tr></tbody></table>

ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi<em&gt; parhyale hawaiensis</em

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un piccolo crostaceo trovato in intercotidali habitat marini di tutto il mondo. Negli ultimi dieci anni, Parhyale è emerso come organismo modello promettente per studi di laboratorio di sviluppo, fornendo un confronto outgroup utile al ben studiato modello artropodi organismo Drosophila melanogaster. In contrasto con le fratture sinciziale di Drosophila, i primi divisioni di Parhyale sono holoblastic. Mappatura Fate utilizzando coloranti traccianti iniettati nel primi blastomeri hanno dimostrato che tutti e tre i foglietti embrionali e la linea germinale sono stabiliti dallo stadio di otto cellule. In questa fase, tre blastomeri predestinati per dare luogo alla ectoderma, tre sono destinata a dare origine al mesoderma, e gli altri due blastomeri sono rispettivamente i precursori della linea endoderma e germe. Tuttavia, gli esperimenti di ablazione blastomeri hanno dimostrato che gli embrioni Parhyale possiedono anche significativo capabiliti normativoes, in modo tale che i destini di blastomeri ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti blastomeri. Blastomere ablazione è stato precedentemente descritto da uno dei due metodi: iniezione e successiva attivazione di coloranti fototossiche o ablazione manuale. Tuttavia, fotoablazione uccide blastomeri ma non rimuove il corpo cellulare morto dall&#39;embrione. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni. Qui vi presentiamo un protocollo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri dalla fase di otto cellule di embrioni Parhyale, illustrando gli strumenti e le procedure manuali necessarie per la rimozione completa del corpo cellulare mantenendo vivo e intatto rimanenti blastomeri. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi cella Parhyale allo stadio di otto cellule, o blastomeri di altre fasi iniziali della scissione. Inoltre, in linea di principio questo protocollo possa essere applicabile ai primi di CleaVage embrioni stadio di altri invertebrati marini holoblastically fendendo.

Dopo il successo ablazione del singolo terzi scissione P. micromeri hawaiensis come descritto in questo protocollo, i restanti micromeri progressivamente spostano le loro posizioni leggermente in modo da occupare parzialmente lo spazio precedentemente occupato dal blastomero ablato. Per esempio, quando g viene rimosso, la vicina blastomeri mr e ML spostare leggermente e venire a condividere i bordi delle celle laterali che erano precedentemente in diretto contatto con ...

Il hawaiensis anfipode Parhyale è un organismo modello promettente per studi di embriologia crostacei e sviluppo artropodi comparativa e l&#39;evoluzione. Questo protocollo descrive un metodo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri da embrioni precoci stadio di clivaggio Parhyale.

Ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Questa dimostrazione mostra la tecnica per rimuovere la cellula precursore della linea germinale da embrioni precoci nel baccello. Crustacean parli sys parli è un organismo modello emergente con un potenziale notevole per l'uso nella ricerca evolutiva e nello sviluppo. La maggior parte degli artropodi modello sono insetti e il più ampiamente studiato tra questi è il moscerino della frutta Glip Melanogaster. Gli insetti sono inclusi nel sottophylum Pancresta e lo studio di altri crostacei al di fuori degli insetti fornisce una visione più ampia della storia evolutiva dei tratti dello sviluppo e dei meccanismi molecolari che sono stati ampiamente studiati in Drosophila.Tuttavia, sono stati ben pochi i crostacei che si sono affermati come sistemi sperimentali per l'analisi di laboratorio dello sviluppo. Parelli è un sistema modello di grande praticabilità in laboratorio e rappresenta quindi un'aggiunta preziosa all'insieme degli organismi modello. Come animale da laboratorio, parli è molto semplice da mantenere e da utilizzare.Si può conservare bene in colture di grandi dimensioni di acqua marina artificiale ed è facile distinguere tra maschi e femmine in base a chiare differenze morfologiche. In particolare, i grandi appendi anteriori uncinati che i maschi utilizzano per afferrare le femmine durante l'accoppiamento per lavori di sviluppo. Parelli presenta diverse caratteristiche molto interessanti: le coppie si accoppiano tutto l'anno, quindi è possibile raccogliere embrioni in qualsiasi momento.Le femmine depongono gli embrioni nella borsa marsupiale situata tra le prime coppie di zampe, ed è possibile raccogliere gli embrioni molto precocemente nello sviluppo senza uccidere la femmina né danneggiare gli embrioni. Gli embrioni sopravvivono in acqua marina artificiale filtrata fino alla schiusa, ed esiste una tabella di stadi dettagliata che consente un'identificazione accurata del progresso dello sviluppo. Qui viene mostrata una selezione di stadi dello sviluppo di paral fino alla schiusa, a partire dallo stadio a otto cellule dello sviluppo.Ciascuna delle cellule nell'embrione paral è specificamente destinata a uno dei tre strati germinativi o alle cellule germinali primordiali. È la specificazione della popolazione di cellule germinali ad essere di particolare interesse in questa dimostrazione. La cellula denominata G per germinale è nota come l'unico precursore della linea germinale in esperimenti di tracciamento della linea cellulare parli, che mostrano come i discendenti di G diano origine a tutte le cellule germinali e nessun discendente faccia parte di altri strati germinativi.Inoltre, sono stati effettuati esperimenti rimuovendo la cellula G dall'embrione senza danneggiare le altre cellule. In questi esperimenti, gli embrioni da cui era stata rimossa la cellula G non presentavano cellule germinali durante il resto dell'embriogenesi, come indicato dall'assenza di cellule che esprimono la proteina vasa, un marcatore della linea germinale in organismi modello appartenenti ai metazoani. Ora illustreremo come raccogliere embrioni parli ed eliminare manualmente la cellula G da un embrione a otto cellule.Questo video illustra la rimozione di G, ma può essere applicato a qualsiasi cellula allo stadio di otto cellule. Per questa parte della procedura, avremo bisogno di una pipetta Pasteur con l'estremità allargata, una seconda pipetta Pasteur non modificata, acqua di mare artificiale filtrata, un contenitore grande per ospitare le coppie, piatti di Petri piccoli, una piastra con pozzetti di vetro, pinzette e uno strumento da dissezione costituito da un sottile filo curvo fissato all'estremità di una pipetta Pasteur. I guanti per pipetta non vengono utilizzati in questa dimostrazione, ma ricordarsi di aggiungere dispositivi di protezione individuale conformi alla gestione del rischio della propria istituzione. Per realizzare la pipetta Pasteur allargata, effettuare innanzitutto un intaglio circolare sulla pipetta con una penna al diamante e quindi rompere con attenzione la punta.Tenere sopra una fiamma per alcuni secondi per levigare i bordi. L'apertura deve essere leggermente più stretta della larghezza massima della pipetta. Per realizzare lo strumento da dissezione in filo, inserire un filo di tungsteno nell'estremità di una pipetta di vetro e tenere sopra una fiamma per fondere il vetro.Fissare il filo in posizione: utilizzare pinze per curvare delicatamente l'estremità del filo al fine di facilitarne la manipolazione con lo strumento. L'estremità ricurva dovrebbe essere leggermente superiore a mezzo centimetro di lunghezza. Raccogliere le coppie utilizzando la pipetta con punta allargata e trasferirle in un contenitore separato di acqua marina artificiale.Lasciare le coppie a temperatura ambiente per tutta la notte. La mattina seguente, saturare l'acqua marina artificiale filtrata con anidride carbonica. Raccogliere le femmine separate e anestetizzarle in quest'acqua.Trasferire una singola femmina in una piastra in vetro contenente acqua marina artificiale filtrata con anidride carbonica, osservando al microscopio stereoscopico; afferrare le piastre coxali lungo un lato del corpo con pinzette. Gli embrioni sono visibili nella sacca marsupiale. Inserire lo strumento da dissezione metallico nell'estremità posteriore della sacca marsupiale e sollevare delicatamente lo strumento verso l'estremità anteriore per staccare il rivestimento della sacca, aprendola ed esponendo gli embrioni.Utilizzare una pipetta da pascolo per far scorrere acqua attraverso la sacca marsupiale aperta, espellendo così gli embrioni. Trasferire la femmina in acqua di mare artificiale filtrata senza anidride carbonica per consentirle il recupero prima di reinserirla nella coltura principale.Trasferire gli embrioni in una piastra di Petri contenente acqua di mare artificiale filtrata e osservarli al microscopio per determinarne lo stadio. Poiché spesso è difficile determinare lo stadio degli embrioni prima di rimuoverli dalla femmina, è necessario raccogliere embrioni da numerose femmine per ottenere un numero sufficiente di embrioni allo stadio corretto. Spesso il modo più semplice per ottenere embrioni a otto cellule consiste nel raccogliere embrioni a stadi precedenti e attendere che maturino fino allo stadio desiderato.Oltre agli embrioni che abbiamo già raccolto per la procedura di ablazione, avremo bisogno di pinzette per pipetta, acqua di mare artificiale filtrata, una capsula di Petri con uno strato di paraffina, un ago realizzato da una capillare di vetro tirata, una pipetta a bocca con un'apertura piccola, capsule di Petri pulite e acqua di mare artificiale filtrata con anfotericina e penicillina-streptomicina per la punta della pipetta a bocca. Passare una pipetta con la punta lunga sopra una fiamma per tirare la pipetta e staccare la punta dal lato sottile inserito nell'estremità della pipetta a bocca. Questa punta ha le dimensioni perfette per la procedura.L'ago di vetro, che verrà utilizzato per perforare G durante la procedura di ablazione, deve avere una punta fine, ma essere abbastanza robusto da non rompersi quando viene premuto contro il corione. Qui viene mostrata una forma comune utilizzata nel nostro laboratorio. Per l'ablazione, dobbiamo prima identificare quale cellula è G; l'embrione a sinistra mostra G delineato in nero, e nella sezione seguente impareremo come distinguere G dagli altri micro specchi.L'embrione a destra mostra il risultato che ci si deve aspettare da un'ablazione riuscita. In questo embrione, G è stato ablato come indicato dal cerchio nero, e solo tre micromeri rimangono utilizzando pinzette. Ruotare delicatamente l'embrione per osservare e confrontare le cellule.G può essere identificato come il micromero più piccolo situato sulla sommità del macromero più piccolo; MAV può essere identificato come il macromero più piccolo facendo rotolare l'embrione. Inoltre, G non tocca la cellula EN, che è il micromero opposto rispetto ad esso. Poiché i lati el ed er di questa cellula condividono un confine tra G ed EN, possiamo osservare che il micromero più piccolo si trova a sinistra e che non è a contatto con il micromero che gli sta di fronte.Ruotando l'embrione, possiamo confermare che questo microspecchio è posizionato sul macrospecchio più piccolo. Ora situato in basso a sinistra nell'embrione, possiamo identificarlo con sicurezza come G e passare all'ablazione. In breve.Per questa procedura, stabilizzeremo l'embrione con una pinzetta mentre perforiamo G con l'ago di vetro affilato. Quindi applicheremo una leggera pressione sull'embrione con la pinzetta, facendo fuoriuscire il contenuto di G dall'embrione attraverso il foro creato. Utilizzeremo la pipetta azionata dalla bocca per rimuovere il contenuto di G dopo che è uscito dall'embrione, in modo da poter verificare quando G è stato completamente asportato.Ora, per esaminare nel dettaglio questo procedimento, riempire la piastra di protezione in seta con uno strato sottile di acqua marina artificiale filtrata. Trasferire un embrione a otto cellule nella piastra utilizzando una pipetta Pasteur con pinzette. Con la mano sinistra, orientare l'embrione in modo che G sia rivolto a destra e afferrare delicatamente l'embrione per stabilizzarlo, utilizzando un ago di vetro tirato, punzettando delicatamente G, senza inserire troppo in profondità l'ago per evitare di spingerlo nei macro specchi al di sotto di G. Passare l'ago dalla mano destra a una pipetta a bocca munita di punta di pipetta Pasteur tirata.Tenere la punta della pipetta vicino al foro in G ed esercitare una leggerissima aspirazione. Stringere delicatamente l'embrione con la pinzetta mentre il contenuto di G viene espulso dal corione. Aspirarlo nella pipetta per ottenere una visione chiara e priva di ostacoli dell'embrione.Osservare attentamente l'embrione. Mentre si rimuove G, il bordo di G si ritrae verso il foro nella coriona, rendendo visibile l'intersezione delle cellule sottostanti. Continuare ad applicare pressione finché tutto G non è stato rimosso e utilizzare la pinzetta per ruotare l'embrione e verificare visivamente che tutto G sia stato eliminato.Utilizzando una pipetta da pascolo, trasferire l'embrione in acqua di mare artificiale filtrata contenente amfotericina e penicillina-streptomicina. Cambiare giornalmente metà dell'acqua attorno all'embrione per prevenire infezioni. Qui sotto è mostrato un embrione prima e dopo l'ablazione.Come si può notare, c'è uno spazio vuoto dove prima si trovava G. Se l'intervento viene eseguito con delicatezza e se gli embrioni vengono adeguatamente curati dopo la procedura, una percentuale elevata sopravvive fino alla schiusa. Nel nostro laboratorio, la percentuale media di sopravvivenza è leggermente superiore al 50%

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Le manipolazioni embriologiche come l'estirpazione e il trapianto di cellule sono strumenti importanti per studiare lo sviluppo precoce. Questo protocollo descrive un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per eseguire queste manipolazioni in embrioni di zebrafish.

Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

Gli espianti di blastoderma Zebrafish sono generati isolando cellule embrionali da centri di segnalazione endogeni all'interno dell'embrione precoce, producendo cluster cellulari relativamente ingenui facilmente manipolati e coltivati ex vivo. Questo articolo fornisce istruzioni per effettuare tali espianti e dimostra la loro utilità interrogando i ruoli per la segnalazione nodale durante la gastrulazione.

Generazione di espianti di blastoderma naïve da embrioni di zebrafish

Lo sviluppo embrionale richiede una coordinazione su larga scala del movimento cellulare. L'ablazione laser mediata dall'eccitazione a due fotoni consente l'ablazione tridimensionale controllata spazialmente di grandi gruppi di cellule profonde. Inoltre, questa tecnica può sondare la reazione delle cellule che migrano collettivamente in vivo alle perturbazioni nel loro ambiente meccanico.

Ablazioni di volume profonde e controllate spazialmente utilizzando un microscopio a due fotoni nella Zebrafish Gastrula

Impara l'ablazione manuale di singole blastomere da embrioni di otto cellule di Parhyale hawaiensis. Questo metodo consente di rimuovere le cellule precursore della linea germinale per studiare lo sviluppo embrionale nei crostacei.

Ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi

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