Facile Misura di diffusione Coefficienti di EGFP-tagged plasma proteine ​​di membrana Uso k-spazio Spettroscopia di correlazione Immagine

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare i coefficienti di diffusione delle proteine di membrana in cellule vive. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando cellule che esprimono la proteina marcata con GFP, quindi acquisendo una sequenza di immagini in time-lapse su un microscopio a disco rotante con il fuoco impostato sulla membrana plasmatica. Il secondo passaggio consiste nel selezionare un'area nell'insieme di immagini in cui la membrana è piatta e non sono presenti organelli in movimento.

Successivamente, il campione viene analizzato utilizzando un software di spettroscopia per immagini basato su casi. L'ultimo passaggio consiste nel calcolare la media dei grafici di diffusione in Excel. In definitiva, la microscopia su cellule vive combinata con i kicks viene utilizzata per misurare il coefficiente di diffusione di una proteina di membrana.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biofisica delle membrane, ad esempio determinando i coefficienti di diffusione delle proteine di membrana in diverse condizioni. La prima volta che si utilizza il codice kicks, aprire MATLAB e fare clic su file. Quindi impostare il percorso, selezionare aggiungi con sottocartelle e individuare sul computer la cartella in cui è ubicato il codice kicks.

Fare clic su OK. Prima di salvare e chiudere MATLAB durante l'acquisizione, è importante mantenere la membrana a fuoco per tutta la durata dell'acquisizione delle immagini. Selezionare una regione rettangolare di interesse o ROI nella parte piatta della membrana in cui la fluorescenza è distribuita uniformemente.

Escludere gli organelli cellulari in movimento e le regioni membrane protrudenti. La dimensione del ritaglio viene scelta in modo da generare statistiche sufficienti per ottenere buoni grafici di K quadro. Ritagliare la regione e salvare il ritaglio come file tiff.

Salvare in una cartella appropriata. Se ci sono diverse ritagliamenti provenienti dallo stesso filmato, utilizzare un incremento numerico, ad esempio ritaglio dello stack uno, tiff, stack uno, ritaglio due, tif, e così via. Per eseguire l'analisi, aprire innanzitutto MatLab e digitare ICS gooey nella finestra dei comandi, quindi premere invio ICS.

GUI è il nome eseguibile del programma grafico di interfaccia utente per la spettroscopia di correlazione dell'immagine in ICS Gooey. Fare clic sulla scheda kicks. Trovare la cartella con il nome MATLAB code.

Scorrere fino al file con il nome scripts e aprirlo facendo doppio clic. Questo file si chiama editor. Nell'editor.

Scorrere per caricare i set di dati dei calci. Quindi copiare o digitare il nome del file e il percorso della cartella nella riga di comando. Nella riga di comando sotto il percorso della cartella.

Impostare il numero di fotogrammi da analizzare. Utilizzare le stesse impostazioni per tutti i filmati consecutivi nella serie di dati. Se si verifica una deriva del fuoco nei fotogrammi successivi.

Questi devono essere esclusi dall'analisi nell'editor. Fare clic su salva, quindi su valuta. Il set di dati è ora caricato nel software di analisi nella finestra di analisi kicks nell'interfaccia grafica (gui).

Immettere le impostazioni per l'analisi deselezionando innanzitutto le caselle delle cellule T. Quindi inserire il numero di ritardo temporale da analizzare. Immettere il valore massimo di K quadrato.

È solitamente compreso tra 20 e 50 all'inizio. L'analisi deve essere ripetuta fino a quando non vengono determinati i migliori valori, dopodiché l'impostazione deve essere utilizzata per tutti i filmati consecutivi nella serie di dati. Verificare sempre che le impostazioni selezionate forniscano un buon adattamento ai dati, come dimostrato da grafici del chi-quadro soddisfacenti e da un grafico di diffusione lineare.

Successivamente, fare clic su impostazioni di archiviazione e procedere. Quindi fare clic su sì per mostrare tutti i grafici. Fare clic su carica serie di immagini e poi su area di lavoro.

Selezionare il ritaglio della serie di immagini prima di fare clic su "importa dall'area di lavoro". Ora inserire nelle impostazioni di acquisizione del sistema di imaging la dimensione del pixel nel campo previsto. Inserire la dimensione del pixel proiettata per il sistema di imaging con cui sono state acquisite le serie di immagini.

Fare clic per selezionare le ROI e inserirne una. Quindi fare clic su OK e utilizzare l'intera immagine. Fare clic su "do kicks analysis" e poi su "yes" per eseguire il filtraggio delle particelle immobili.

I risultati si apriranno automaticamente come immagini. Ridurre a icona la finestra delle impostazioni, ridurre a icona la finestra delle informazioni sulla cellula e ridurre a icona la finestra della fotofisica nella finestra delle dinamiche. Verificare che il grafico delle dinamiche mostri un adattamento lineare dei dati con una pendenza negativa, il che significa che i punti dati sono correlati e può essere assunta una diffusione libera.

Registrare il coefficiente di diffusione per il ritardo temporale specifico e le impostazioni di K quadro. I punti dati nei grafici di K quadro devono essere raggruppati intorno alla linea per il tempo indicato. Selezionare la casella di controllo per i ritardi temporali, salvare le figure aperte come immagini, quindi fare clic su salva figure aperte come immagini per salvare i file dei risultati.

Salvare in una nuova cartella, quindi fare clic su "cancella dati attuali" e continuare con l'analisi della coltura successiva. Utilizzando i nomi delle colture impostati in precedenza, inserire i singoli coefficienti di diffusione di ogni area di interesse (ROI) in un foglio elettronico e assicurarsi di annotare il numero di ritardi temporali e i valori di K al quadrato. Calcolare il coefficiente di diffusione medio e la deviazione standard utilizzando un programma per fogli elettronici.

Eseguire un test MOV Smirnoff o un test t di Student per valutare le differenze statistiche. Utilizzando un livello di significatività del 5%, è possibile effettuare confronti quantitativi tra le cellule. La versione del foglio di calcolo dei grafici di diffusione, generata dal software di analisi per ogni coltura, e mediare i dati per ogni condizione e per ogni intervallo temporale.

Genera un nuovo grafico medio della diffusione da presentare in articoli o relazioni. I risultati qui mostrati costituiscono una sequenza temporale di immagini di acquaporina tre marcata con EGFP. In cellule MDCK vive, che sono cellule epiteliali renali, acquisite mediante microscopio a disco rotante con il fuoco impostato sulla membrana plasmatica.

Qui è mostrata un'immagine della cellula con esempi di aree di interesse (ROI) ritagliate, evidenziate mediante rettangoli per la selezione dei ritagli. È importante effettuare il ritaglio alla periferia della cellula, dove la membrana è uniforme e piatta, in modo da visualizzare esclusivamente una diffusione bidimensionale. È necessario evitare organelli cellulari, vescicole e protrusioni della membrana, ed è fondamentale per l'analisi che non vi sia alcun movimento durante l'acquisizione della sequenza temporale.

Questa porzione rappresentativa è stata esclusa dall'analisi e da kicks poiché sono presenti vescicole in movimento, che possono contribuire al coefficiente di diffusione. Un altro esempio di porzione esclusa, in cui è presente un foro nella membrana, è mostrato qui. Il grafico di diffusione di una porzione generato con kicks è presentato qui.

Questo metodo può essere utilizzato per determinare il coefficiente di diffusione di una proteina marcata con una proteina fluorescente, un colorante o punti quantici. La pendenza della curva nel grafico di diffusione corrisponde semplicemente all'opposto del coefficiente di diffusione; qui viene mostrato il grafico di diffusione calcolato per l'acquaporina tre marcata con EGFP, ottenuto con un numero eccessivo di intervalli temporali. In questo caso, l'analisi è stata ripetuta con un numero ridotto di intervalli temporali, in modo che il grafico di diffusione risulti lineare.

Viene presentato qui un tipico grafico K quadro. Questa è la curva di correlazione media radiale e trasformata con il logaritmo per un intervallo temporale selezionato da questi grafici K quadro. La pendenza è riportata in funzione degli intervalli temporali, e il risultato è il grafico di diffusione mostrato in precedenza.

Quando si esaminano i grafici di K quadro, è importante valutare l'adattamento a partire da questo grafico di K quadro. Si può concludere che l'acquisizione è troppo piccola e non può essere analizzata, poiché dovrebbe presentare una pendenza negativa e decrescere linearmente fino a un livello di rumore di fondo. Questo grafico di K quadro deve essere riesaminato utilizzando un valore massimo di K quadro ridotto, dato che l'adattamento non è più adeguato, come indicato dall'aumento dei residui a valori più elevati di K quadro.

In questo caso, l'analisi deve essere eseguita nuovamente, inserendo un valore massimo di K quadrato più basso. Qui viene mostrato un grafico medio di diffusione ottenuto come media su 10 aree selezionate. Il grafico di diffusione è stato trovato nel file Excel generato dall'analisi e derivato da esso.

Il coefficiente di diffusione della AQUAPORIN tre EGFP viene calcolato seguendo questa procedura. Altri metodi, come la misurazione del coefficiente di diffusione di proteine di membrana dopo l'aggiunta di diversi farmaci, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se il coefficiente di diffusione cambia dopo il trattamento con farmaci e se è probabile che vi siano variazioni negli ambienti lipidici e/o nelle interazioni proteina-proteina nella membrana.