Shock Wave Application to Cell Culture

L'obiettivo generale di questa procedura è evitare effetti fisici disturbanti durante il trattamento in vitro con onde d'urto, al fine di ottenere risultati riproducibili. Questo risultato si ottiene riempiendo innanzitutto completamente un flacone per colture cellulari con mezzo di coltura, quindi posizionando il flacone in un bagno d'acqua riscaldato. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare una quantità abbondante di gel ecografico durante l'accoppiamento dell'applicatore al bagno d'acqua.

Successivamente, l’applicatore viene posizionato orizzontalmente contro la membrana del bagno termico. L'ultimo passaggio consiste nell'assicurarsi che la sorgente di onde d'urto sia allineata con il centro del flacone per coltura cellulare, in modo che le cellule si trovino nel fuoco dell'onda. Infine, l'analisi delle cellule può essere eseguita, ad esempio, mediante PCR in tempo reale e un array di citochine per evidenziare eventuali alterazioni nei geni e nelle citochine di interesse.

L'idea per questo modello è nata quando abbiamo osservato che i metodi esistenti di applicazione di onde corte direttamente alle colture cellulari non tengono conto dell'effetto di riflessione delle onde al passaggio dal mezzo di coltura all'aria ambiente. A illustrare la procedura sarà la dottoressa Chante, studentessa di dottorato del mio gruppo di ricerca. Per iniziare, riscaldare 3,5 litri di acqua di rubinetto a 37 gradi Celsius.

Quindi trasferire l'acqua riscaldata nel bagno termostatato. Il livello dell'acqua deve trovarsi a tre centimetri sotto la parte superiore del bagno termostatato e deve ricoprire completamente la membrana. Successivamente, collegare il sensore di temperatura a un'alimentazione elettrica e posizionare il sensore di temperatura nell'apposito alloggiamento sulla parete posteriore del bagno termostatato.

Quindi, mentre si mescola l'acqua, collegare continuamente il riscaldatore a un'alimentazione elettrica e riscaldare l'acqua fino a una temperatura stabile di 37 gradi Celsius. In condizioni sterili. Seminare le cellule in fiaschi di coltura T 25.

Pertanto, raggiungeranno una confluenza del 90% dopo un'incubazione notturna. Successivamente, posizionare i flaconi in verticale e riempirli con il mezzo di coltura fino alla base del collo del flacone per evitare contaminazioni. Non permettere al mezzo di entrare in contatto con il collo del flacone o con il tappo di chiusura.

Successivamente, chiudere i flaconi con un tappo solido senza filtro per prevenire la contaminazione causata dall'acqua del bagno. Quindi sigillare i tappi con paraform. Dopo aver sigillato i flaconi, fissarli con una molletta a un supporto.

Quindi inserire le fiasche fissate nel bagno d'acqua e allineare il centro della fiasca da coltura cellulare con il centro della membrana dell'applicatore di onde d'urto. Applicare una quantità abbondante di gel per la trasmissione degli ultrasuoni sull'applicatore di onde d'urto e sulla membrana del bagno d'acqua. Successivamente, collegare l'applicatore alla membrana, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria tra di essi.

Successivamente, posizionare l'applicatore di onde d'urto al centro della membrana e assicurarsi che sia allineato orizzontalmente e verticalmente con la fiala di coltura cellulare, per garantire il trattamento dell'intera area di crescita cellulare. Quindi, eseguire un esperimento pilota per determinare la distanza ideale tra l'applicatore di onde d'urto e la fiala di coltura, nonché per definire i parametri di trattamento corretti. Assicurarsi di mantenere la fiala di coltura e l'applicatore in una posizione stabile durante l'attivazione del dispositivo a onde d'urto.

Dopo aver determinato una distanza ideale, eseguire l'esperimento secondo i parametri desiderati di trattamento con onde d'urto. Al termine del trattamento con onde d'urto, rimuovere la fiala di coltura cellulare dal bagno d'acqua, asciugarla con carta da cucina e disinfettare la superficie esterna della fiala. Successivamente, trasferire il mezzo di coltura dalla fiala in un tubo da centrifuga.

Centrifugare le cellule utilizzando parametri normali della centrifuga. Sospendere il pellet cellulare in due millilitri di mezzo di coltura, quindi trasferire la sospensione cellulare nel flacone contenente cinque millilitri di mezzo di coltura e coltivare le cellule fino alla confluenza richiesta per gli esperimenti di analisi cellulare. L'analisi mediante PCR in tempo reale di cellule endoteliali venose umbelicali umane ha rivelato un aumento dei livelli di mRNA di tie due dopo il trattamento con onde d'urto.

Ciò suggerisce che il trattamento con onde d'urto aumenti la proliferazione delle cellule endoteliali e l'angiogenesi. I livelli di citochine nella vena ombelicale sono stati quantificati mediante un array di citochine.

È stato inoltre riscontrato un significativo aumento delle due citochine infiammatorie IL-6 e IL-8, entrambe coinvolte nell'infiammazione associata al processo angiogenetico dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada a numerosi ricercatori nel campo della scienza di base delle onde d'urto per esplorare gli effetti su un singolo tipo cellulare in esperimenti in vitro. Speriamo di convincere ancora più ricercatori ad utilizzare questo modello al fine di ottenere risultati riproducibili e confrontabili nella scienza delle onde d'urto.