Name: Valutare Variazioni Volatile generale anestetico sensibilità dei topi dopo lintervento farmacologico locale o sistemica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Impara a valutare la sensibilità agli anestetici volatili nei topi dopo interventi farmacologici locali o sistemici. Questo metodo utilizza il riflesso di raddrizzamento per misurare l'inconscienza e può essere adattato a diverse specie e terapie inalatorie.

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Questo lavoro è stato sostenuto da GM088156 R01 e T32 HL007713-18. Vorremmo ringraziare Bill Pennie e Michael Carman presso la University of Pennsylvania Research Strumentazione Shop per il loro aiuto nel montaggio nostro apparato riflesso di raddrizzamento.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali descritti nel presente documento sono stati approvati dalla University of Institutional Animal Care ed uso commissione di Pennsylvania. 1. Panoramica dell&#39;Apparato Testing <ol><li> L&#39;apparecchiatura di prova è composto da 24 camere chiare acrilico cilindrico 10 cm di lunghezza e 5 cm di diametro (volume totale di 200 ml). Questa dimensione è appropriato per un tipico 25 g topo adulto. Chambers hanno porte ad ogni estremità per l&#39;ingresso e l&#39;uscita del gas. L&#39;estremità di uscita è rimovibile in modo che gli animali possono essere facilmente caricati nella camera. Apertura delle porte del gas sono accuratamente sigillate con nastro di teflon, mentre le guarnizioni di gomma o-ring sono usati per sigillare la fine rimovibile delle camere cilindriche. </li><li> Ogni camera è montata su un telaio che si trova all&#39;interno di un bagno d&#39;acqua. La cremagliera è montata in modo che solo la porzione inferiore delle camere (sotto i ingressi del gas) è sommerso. Per la stabilità, l&#39;estremità posteriore della camera poggia su un supporto in modo che l&#39;intero chamber siede in orizzontale. Questo assicura il contatto anche di tutta la camera con il bagno. </li><li> Tubo di polietilene collega un serbatoio di ossigeno per un vaporizzatore di anestetico, e poi passa attraverso un L / min misuratore di flusso 10. Il tubo divide in 25 resistenze di piccolo diametro di uguale lunghezza per garantire la parità di flusso è consegnato a ciascuna delle 24 camere e di un analizzatore agente. </li><li> Linee di vuoto escono ciascuna camera all&#39;estremità opposta dell&#39;ingresso del gas. Questo favorisce il flusso unidirezionale che elimina rirespirazione di anidride carbonica espirata. Le linee di vuoto si combinano in un collettore per il collegamento ad una linea di aspirazione in-house. Una valvola pop-off lungo la linea del vuoto centrale garantisce condizioni di pressione atmosferica all&#39;interno di ogni camera. </li><li> La vasca viene riempita con acqua sufficiente a contattare completamente il fondo di ogni camera. L&#39;acqua viene fatta circolare attraverso il bagno e mantenuta alla temperatura costante di 37 ° C da una pompa. </li></ol> 2. Controllare il sistema prima esposizione <ol><li> Cdiamine che la temperatura del bagno d&#39;acqua è 37 ° C per tutta la vasca. </li><li> Flusso di ossigeno ad una velocità di 5 L / min (200 ml / min per camera + analizzatore agente). Immergere ciascuna camera sotto acqua e cercare bolle o ingresso di acqua nella camera, entrambi indicativi di perdite. Sigillare eventuali perdite prima di iniziare l&#39;esperimento. </li><li> Per ogni camera, collegare un ml / min misuratore di flusso 500 in linea a valle della camera di assicurarsi che i flussi sia equilibrata tra ciascuna delle linee di gas 25. Ciò garantisce che l&#39;ingresso 5 L / min flussi saranno distribuiti uniformemente in modo che ciascuna camera riceve 200 ml / min. Ogni camera di non ricevere il flusso previsto dovrebbe avere il suo afflusso e deflusso controllato per tubi ostruzioni. </li><li> Calibrare l&#39;analizzatore agente di garantire una lettura di 0,00% isoflurano quando il 100% di ossigeno scorre. </li></ol> 3. Implant temperatura Transponder <ol><li> Una settimana prima assuefazione, anestetizzare ogni mouse con 2% isoflurano. </li><li> Sterilizzare la zona del collo dorsale con Betadine. </li><li> Iniettare un transponder per via sottocutanea di temperatura tra le scapole utilizzando la sterile, ago dell&#39;iniettore preconfezionato. </li><li> Controllare il sito di iniezione giornaliera per infezione e la migrazione del transponder. </li></ol> 4. Abituarsi Animali da test Chambers <ol><li> Quattro giorni prima della prima valutazione, mettere tutti i topi in camere singole per 2 ore con il 100% di ossigeno che scorre. </li><li> Ripetere il punto 4.1 al giorno per quattro giorni prima valutazione per evitare gli effetti confondenti di stress a causa di un nuovo ambiente. </li></ol> 5. Eseguire l&#39;intervento farmacologico che si desidera testare per gli effetti sulla anestetico Sensibilità <ol><li> Questo intervento può essere una iniezione stereotassica in una parte specifica del cervello 24, una iniezione endovenosa o intraperitoneale 25, o la consegna di un farmaco per una zona specifica del cervello mediante cannula 26. </li><li> Poiché queste procedure stesse possono cambiare la sensibilità anestetico rispetto ad un animale ingenuo, un gruppo di controllo adeguata dovrebbe subire la stessa procedura con iniezioni di veicoli. </li><li> Assicurarsi che l&#39;intervento farmacologico ha una adeguatamente lunga durata d&#39;azione, se avete intenzione di fare un graduale aumento e / o diminuzione determinazione della sensibilità anestetico, come indicato al punto 6 sotto, altrimenti passare al punto 7. </li></ol> 6. Valutare anestetico sensibilità con la graduale EC 50 Determinazione per l&#39;induzione e Emersione <ol><li> Mettere ogni animale in singole camere con ossigeno al 100% che scorre. </li><li> Impostare la concentrazione di isoflurano al 0,4% * per 15 min. Durante gli ultimi 2 minuti di questo periodo, valutare riflesso di raddrizzamento di ogni animale da dolci camera fino a quando il mouse è posizionato sul dorso. Il riflesso di raddrizzamento è considerato integro se e solo se il mouse è in grado di ripristinare tuttizampa al pavimento della camera entro 2 min. <ol><li> * Si noti che il 0,4% isoflurano è una dose subhypnotic nei topi C57BL/6J. Se eventuali topi perdono la loro riflesso di raddrizzamento al primo passo, la dose iniziale era troppo grande e deve essere ridotta nei giorni successivi. </li></ol></li><li> Registrare lo stato del riflesso di raddrizzamento per ogni mouse e la scansione ogni mouse per i dati di temperatura. Un template record è mostrato nella Tabella 1. </li><li> Aumentare la concentrazione di isoflurano da ~ 0,05% per 15 min e ripetere il punto 7.2. Continuare a fare questo fino a quando tutti gli animali hanno perso il loro riflesso di raddrizzamento. </li><li> Facoltativo: ripetere la stessa procedura per diminuire le dosi isoflurano graduale fino a che tutti gli animali hanno riacquistato la loro riflesso di raddrizzamento (vedi punto 6.3). </li><li> Per terminare l&#39;esperimento, spegnere l&#39;isoflurano e lavare l&#39;intero sistema con ossigeno al 100% per 15 min. Questo aiuterà a prevenire l&#39;ipossia come i topi recuperare prima di essere tornati alle loro gabbie a casa e proteggerà il experimenter da qualsiasi esposizione anestetico. </li><li> Facoltativo: se il numero di animali o il numero di concentrazioni anestetiche sono limitati a causa di vincoli di risorse o di tempo, le stime-in particolare dei parametri della curva-fit il pendio-Hill possono avere sottovalutato stima dell&#39;errore, falsamente bassi. In questi casi, può essere necessario ripetere la misurazione sensibilità anestetico descritto nei passaggi 6,1-6,6 su un massimo di due giorni sperimentali complementare, per ottenere pienamente parametro del vero pendenza Hill e il suo corrispondente stima dell&#39;errore. </li></ol> 7. Valutare i cambiamenti a breve termine in anestetico Sensibilità con il tempo di Emersione <ol><li> Mettere ogni animale in singole camere con ossigeno al 100% che scorre. </li><li> Impostare la concentrazione di isoflurano al 1,2%, che corrisponde ad una induzione ED 99 per wild-type topi C57BL/6J 20. Mantenere per 30-60 min a seconda della durata prevista di azione dell&#39;intervento acuta. </li><li> Conferma LORR intutti gli animali di dolci ciascuna camera fino a quando i topi sono posti sulle loro spalle. </li><li> Spegnere isoflurano e portata al 100% di ossigeno. Misurare il tempo fino a quando ogni animale riacquista il suo riflesso di raddrizzamento. Questo è definito dalla collocazione di tutte e quattro le zampe sul pavimento della camera e confermata dalla presenza di tre prove consecutive con un riflesso di raddrizzamento intatta. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sebbene valutazione di LORR in un singolo topo è un compito apparentemente semplice, è tuttavia essenziale mantenere condizioni fisiologiche identiche tra soggetti per raccogliere dati affidabili da un gruppo di animali. La strettamente regolata, apparecchi LORR ad alta capacità qui presentata offre un modo per standardizzare esperimenti e massimizzare l&#39;efficienza. Seguendo i principi fondamentali della termoregolazione e distribuzione uguale portata, questo sistema può essere facilmente ricreato e personalizzato p...

Anestetici generali sono definite dalla loro capacità di causare uno stato reversibile di ipnosi in un&#39;ampia varietà di specie, sei spiegazione di come tale classe diversificata di farmaci può sortire un endpoint singolare resta sfuggente. Un certo numero di teorie sono state ipotizzato nel corso degli anni, a partire dalla correlazione Meyer-Overton tra potenza anestetici e solubilità lipidica, che ha suggerito interruzioni membrana generali come base per l&#39;ipnosi 1,2. Evidenze più recenti suggeriscono che gli obiettivi di proteine ​​che interessano la segnalazione neuronale contribuiscono agli effetti anestetici. I topi hanno dimostrato di essere un modello indispensabile per esplorare queste teorie causa della omologia tra murino e reattività anestetico umano. Anche se un mouse non può essere chiesto di sua consapevolezza personale in anestesia generale, alcuni riflessi primitivi servono misure utili surrogati di roditori ipnosi. Nei primi giorni dopo la nascita, i topi sviluppano un raddrizzamento resp riflessivaonse che impedisce loro di essere passivamente collocato in una posizione supina 3. La dose di anestesia alla quale un mouse perde il suo riflesso di raddrizzamento correla bene con dosi ipnotiche umani 4. Valutazione della perdita del riflesso di raddrizzamento (LORR) è diventato uno standard di laboratorio ampiamente utilizzata per la prova di sensibilità anestetico in topi e una varietà di altre specie, compreso il ratto, cavia, coniglio, furetto, pecore, cani e 5-8. La dose di un determinato anestetico in cui LORR si verifica per i membri di una specie risulta costante, ma può essere spostato in modo significativo da fattori ambientali. Ad esempio, ratti privati ​​del sonno sono più sensibili ad entrambi anestetici volatili ed endovenosi 9 e ratti con elevata capacità aerobica sono meno sensibili ai isoflurano 10. L&#39;ipotermia è stato anche dimostrato di ridurre la dose di anestetici numerose richieste per ipnosi in un ampio spettro di specie 11-14. Perper identificare in maniera affidabile la dose di anestetico in cui LORR si verifica in un gruppo di animali sperimentali, è fondamentale che l&#39;ambiente di valutazione essere controllata attentamente per minimizzare lo stress, mantenere eutermia, e fornire la stessa quantità di farmaco a tutti i soggetti. Non sorprendentemente, i fattori genetici sono anche noti per alterare la sensibilità anestetico 15-18. Di conseguenza, un&#39;attenta considerazione dovrebbe essere prestata al controllo di background genetico 19. Abbiamo sviluppato un apparato che assicura identico gassoso consegna anestetico per ciascuno dei 24 topi pur mantenendo un ambiente C 37 o costante. Il design cilindrico trasparente delle nostre camere di esposizione consente per la valutazione LORR rapida e facile integrazione di misurazioni fisiologiche telemetrici. Questo sistema ha dimostrato di misurare accuratamente isoflurano, alotano e sevoflurano induzione CE 50 e il tempo di emergere in topi wild-type 20. Abbiamo usato anchequesto sistema per osservare i cambiamenti nella sensibilità anestetico nei topi con mutazioni genetiche e mirati lesioni ipotalamiche 21-23. Qui si descrive due modi in cui la sensibilità anestetico può essere valutato dopo un intervento farmacologico utilizzando il nostro apparato ambiente controllato. Steady-state fenotipizzazione dell&#39;induzione anestetico volatile e sensibilità emergere richiede 8-10 ore ed è conseguentemente più su misura per gli studi in cui le condizioni sperimentali non cambiano, come ad esempio in interventi farmacologici croniche o lunga durata d&#39;azione. Tuttavia, per i trattamenti di breve durata d&#39;azione i cui effetti dissipare in modo significativo nel corso del tempo abbiamo anche presentiamo una semplice procedura per valutare le variazioni riflesso di raddrizzamento seguenti microiniezioni stereotassica mirati o trattamenti per via endovenosa di farmaci che hanno un impatto significativo emergere anestetico. Questi test rappresentano un piccolo sottoinsieme delle potenziali applicazioni di questo sistema ambiente controllato, che potrebbe essere adattato per qualsiasi numero di subjetti di una varietà di specie di ricevere qualsiasi tipo di terapia per via inalatoria.

<table><tbody><tr><td>Nome del reagente</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Commenti</td></tr><tr><td>Ossigeno</td><td>Airgas</td><td>OX300</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Butler Schein</td><td></td><td>Qualsiasi anestetico volatile di interesse può essere sostituito</td></tr><tr><td>Nome del materiale</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Commenti Misuratore</td>di</tr><tr><td>portata massica - 10 SLPM</td><td>Omega Engineering</td><td>FMA-A2309</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di portata massica - 500 SCCM</td><td>Omega Engineering</td><td>FMA-A2305</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di agenti anestetici/indicatore di gas</td><td>AM Bickford</td><td>FI-21 Riken</td><td></td></tr><tr><td>Pompa dell'acqua di riscaldamento</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-874-175</td><td></td></tr><tr><td>Transponder di temperatura</td><td>BMDS</td><td>IPTT-300</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di temperatura RF</td><td>BMDS</td><td>DAS-6007</td><td></td></tr></tbody></table>

valutare variazioni volatile generale anestetico sensibilità dei topi dopo l&#39;intervento farmacologico locale o sistemica

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

Un endpoint desiderabile dell&#39;anestesia generale è stato di incoscienza, noto anche come ipnosi. Definire lo stato ipnotico negli animali è meno semplice di quanto non sia in pazienti umani. Un surrogato comportamentale ampiamente usato per ipnosi nei roditori è la perdita del riflesso di raddrizzamento (LORR), o il punto in cui l&#39;animale non risponde più al loro istinto innato per evitare la vulnerabilità del decubito dorsale. Abbiamo sviluppato un sistema di valutazione LORR in 24 topi contemporaneamente, mentre con attenzione il controllo per potenziali confonde, comprese le fluttuazioni di temperatura e variabili flussi di gas. Queste camere consentono una valutazione affidabile della sensibilità anestetico come misurato dalla latenza ritorno del riflesso di raddrizzamento (RORR) a seguito di un&#39;esposizione anestetico fisso. In alternativa, utilizzando aumenti graduali (o diminuisce) in concentrazione di anestetico, le camere consentono anche la determinazione della sensibilità di una popolazione a induzione (o emergenza) come misurato daEC 50 e Hill pendenza. Infine, le camere ambientali controllate qui descritti possono essere adattati per una varietà di usi alternativi, tra cui la consegna per via inalatoria di altri farmaci, studi di tossicologia e monitoraggio in tempo reale simultaneo delle funzioni vitali.

Figura 1 dimostra l&#39;utilità del graduale saggio LORR per determinare effetti a lungo termine di un intervento farmacologico. L&#39;acido ibotenico (IBA) è un agonista della glutamatergic N-metil-D-asparate (NMDA) che viene spesso utilizzato come excitotoxin provocare lesioni neuronali permanenti. Qui abbiamo iniettato 10 nl del 1% IBA bilateralmente nella zona ventrolaterale preottica (VLPO) dei topi C57BL/6J una settimana prima della prova. La maggior parte dei neuroni in questo nucleo esporre bass...

La perdita del riflesso di raddrizzamento ha servito a lungo come un surrogato comportamentale standard per incoscienza, chiamato anche l&#39;ipnosi, in animali da laboratorio. Alterazioni nella sensibilità anestetico volatile causati da interventi farmacologici possono essere rilevati con un sistema di valutazione ad alta produttività attentamente controllato, che può essere adattato per la fornitura di qualsiasi terapeutico inalata.

Valutare Variazioni Volatile generale anestetico sensibilità dei topi dopo l&#39;intervento farmacologico locale o sistemica

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare i cambiamenti nella sensibilità agli anestetici dopo un intervento farmacologico. Questo viene raggiunto innanzitutto controllando attentamente le camere di esposizione per assicurare un flusso uniforme di gas e una temperatura costante. Il secondo passaggio consiste nell'abituare gli animali alle camere.Successivamente, si esegue l'intervento farmacologico di interesse. L'ultimo passaggio consiste nel valutare i cambiamenti nella sensibilità all'anestetico mediante l'analisi del riflesso di scrittura dell'animale in risposta all'esposizione all'anestetico. In definitiva, i saggi del riflesso di scrittura vengono utilizzati per evidenziare le differenze nella sensibilità anestetica provocate da interventi farmacologici a lunga o breve durata d'azione.Sebbene questo sistema possa fornire informazioni sui cambiamenti della sensibilità agli anestetici nei topi, può anche essere utilizzato in diverse specie per studiare gli effetti di qualsiasi terapia inalatoria. L'apparato di prova è costituito da 24 camere cilindriche trasparenti in acrilico, lunghe 10 centimetri e con un diametro di cinque centimetri. Queste dimensioni sono adatte

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Le misurazioni elettroniche di von Frey sono un'alternativa efficace e migliorata ai classici filamenti di von Frey, in quanto consentono una misurazione rapida e precisa dei cambiamenti nelle soglie di prelievo meccanico dei roditori agli stimoli di pressione applicati continuamente prima e dopo un evento infiammatorio.

Misurazione dei cambiamenti nella sensibilità tattile nella zampa posteriore dei topi utilizzando un apparecchio elettronico di von Frey

Descriviamo un protocollo di esaminare lo sviluppo di iperalgesia indotta da oppioidi e tolleranza nei topi. Sulla base della misurazione di risposte nocicettive termica e meccanica di capre e morfina-trattata, consente di quantificare l'aumento della sensibilità al dolore (iperalgesia) e diminuire in analgesia (tolleranza) associati alla somministrazione cronica di oppiacei.

Valutazione della morfina-indotta iperalgesia e analgesico tolleranza nei topi mediante nocicettive termica e meccanica Modalità

Reazioni allergiche, caratterizzate da attivazione dei mastociti e dei basofili, sono guidati dal cross-linking delle IgE e il rilascio di mediatori proinfiammatori. Una valutazione quantitativa delle risposte allergiche può essere ottenuto utilizzando Evans colorante blu per monitorare i cambiamenti nella permeabilità vascolare dopo la sfida allergene.

Misurare Anafilassi locali nei topi

Questo protocollo ha lo scopo di consentire ai ricercatori di condurre esperimenti progettati per testare questi aspetti della dipendenza utilizzando la preferenza di luogo condizionata e i saggi di sensibilizzazione comportamentale locomotoria.

Valutazione della cocaina indotta sensibilizzazione comportamentale e conditioned place preference nei topi

Qui, presentiamo un protocollo per somministrare in modo più sicuro ed efficiente gas anestetico ai topi utilizzando un sistema di anestesia digitale a basso flusso che utilizza un vaporizzatore a iniezione diretta azionato da siringa.

L&#39;utilizzo di un basso flusso di sistema per anestesia digitale per topi e ratti

La stimolazione del nervo vago ha dimostrato di avere una forte efficacia per ridurre l'infiammazione periferica. Qui, presentiamo un protocollo di stimolazione del nervo vago modificato che consente ulteriori esami dei meccanismi antinfiammatori colinergici in risposte infiammatorie limitate.

Aumento tempo di recupero e Diminuzione LPS Per studiare il nervo vago meccanismi di stimolazione in risposta infiammatoria limitati

Abbiamo sviluppato un protocollo per valutare il benessere nei topi durante le procedure di anestesia generale. Una serie di parametri comportamentali che indicano livelli di benessere così come metaboliti di glucocorticoidi sono stati analizzati. Il protocollo può servire come un generale di aiuti per stimare il grado di gravità in modo scientifico, animale-centrato.

Valutazione sistematica del benessere nei topi per procedure usando l'anestesia generale

Le fette di cervello ex vivo possono essere utilizzate per studiare gli effetti degli anestetici volatili sulle risposte evocate agli input afferenti. L'optogenetica è impiegata per attivare indipendentemente afferenze talamocorticali e corticocorticali alla neocorteccia non primaria, e le risposte sinaptiche e di rete sono modulate con isoflurano.

Attivazione optogenetica delle vie afferenti nelle fette cerebrali e modulazione delle risposte mediante anestetici volatili

Questo articolo descrive un metodo per modellare l'anestesia endovenosa totale (TIVA) durante la chirurgia di resezione del cancro nei topi. L'obiettivo è replicare le caratteristiche chiave della somministrazione di anestesia ai pazienti con cancro. Il metodo consente di indagare su come la tecnica anestetica influisce sulla recidiva del cancro dopo l'intervento chirurgico di resezione.

Un modello murino in vivo di anestesia endovenosa totale durante la chirurgia di resezione del cancro

Il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) è ampiamente utilizzato per la ricerca biologica e tossicologica. Per espandere l'utilità delle mosche, abbiamo sviluppato uno strumento, l'array di anestesia seriale, che espone simultaneamente più campioni di mosca agli anestetici generali volatili (VGA), rendendo possibile studiare gli effetti collaterali (tossici e protettivi) dei VGA.

The Serial Anesthesia Array for the High-Throughput Investigation of Volatile Agents Using Drosophila melanogaster

Impara a valutare la sensibilità agli anestetici volatili nei topi dopo interventi farmacologici locali o sistemici. Questo metodo utilizza il riflesso di raddrizzamento per misurare l'inconscienza e può essere adattato a diverse specie e terapie inalatorie.

Valutare Variazioni Volatile generale anestetico sensibilità dei topi dopo l'intervento farmacologico locale o sistemica

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