Correzione Drift seguente esempio 4D confocale Time-lapse imaging

La microscopia TimeLapse consente una visualizzazione dei processi di sviluppo, crescita o deriva del campione che si verifica su questa immagine. L'acquisizione può comportare l'impossibilità di seguire o tracciare i movimenti della cellula, il seguente protocollo. Utilizziamo software di elaborazione delle immagini open source per correggere la deriva tridimensionale nel tempo.

L'acquisizione di una serie di sezioni ottiche su diversi piani focali consente la generazione di un modello tridimensionale del campione. Questo può essere esteso in quattro dimensioni creando una serie time-lapse di set di dati 3D. Negli esperimenti time lapse a lungo termine, è comune osservare il movimento del campione.

Ciò può essere causato da precisioni di scorrimento nello stadio di controllo dell'hardware e nelle posizioni focali, mentre in altri casi il drifter a causa di movimenti indotti dalla crescita del campione o dalla flessibilità all'interno dei mezzi di montaggio esistono metodi per compensare e limitare questi movimenti con molti miglioramenti ai sistemi di messa a fuoco hardware e la maggiore rigidità del mezzo di montaggio. Tuttavia, questi approcci non possono essere applicati in molti casi a causa della configurazione di imaging necessaria per fornire le condizioni adeguate per la correzione del mantenimento e della crescita dei campioni. Per la deriva dei campioni, abbiamo sviluppato un plug-in per utilizzare la piattaforma di elaborazione delle immagini open source delle Fiji.

Il nostro plugin di deriva 3D corretto è in grado di formare una registrazione di correlazione di fase per correggere il movimento che si verifica come ruolo o deriva del campione in esperimenti time-lapse tridimensionali in esperimenti multicanale. Il plugin 3D drift corretto utilizza un canale per determinare la correzione richiesta. Questa correzione viene quindi applicata a tutti i canali aggiuntivi che determinano la registrazione del set di dati The four D.

Il pacchetto Web gratuito open source. Fiji è un fork di distribuzione, il programma Image J, che contiene plugin preinstallati per eseguire numerosi processi sui dati raccolti da esperimenti di microscopia. Fiji fornisce un'architettura di plug-in più semplice e include l'installazione predefinita.

Una copia dei tre plugin EG corretti, che utilizzeremo per questa analisi quando l'installazione sarà completa Open Fiji. Fiji supporta l'importazione di una vasta gamma di formati di immagine per microscopia proprietari. Ciò può essere ottenuto tramite il trascinamento della selezione o tramite l'ambiente di microscopia aperto degli utenti.

Plugin per l'importazione di formati biografici. Se il set di dati supera la dimensione della memoria installata sul sistema, aprire il file immagine come stack virtuale e di un'opzione di gestione della memoria. Il set di dati che utilizzeremo in questa analisi è stato generato da un esperimento di serie temporali tridimensionali di ACTA, GFP transgenic zebrafish in cui la GFP è espressa nel muscolo scheletrico.

Per visualizzare i nuclei, questa linea transgenica è stata iniettata con il nucleo che localizza la ciliegia M per rappresentare meglio questi pavimenti di fluoro, possiamo modificare le tabelle di ricerca per ciascuno di questi canali sotto lo strumento del canale di colore. Nel corso delle serie temporali raccolte, sembra che il campione di pesce cerniera sia andato alla deriva nel campo visivo. Ha corretto questa deriva ha aperto il plugin di deriva 3D corretto nel sottomenu di registrazione dei plugin installati nelle Fiji.

I marcatori del venditore che sono ampiamente espressi all'interno di un campione o non coinvolti negli eventi di commercializzazione durante l'acquisizione dell'immagine forniscono la migliore fonte per la correzione della deriva. In questo esempio, quello ACTA, fluorescenza GFP nel canale uno. Se la memoria del sistema è limitata, selezionare l'opzione Virtual stack e consentire l'esecuzione del plug-in Correct 3D drift

Il set di dati corretto avrà una dimensione dell'area di disegno maggiore rispetto all'originale. Accomodare il movimento del campione. La generazione di immagini di massima proiezione delle sezioni ottiche consente di effettuare il confronto della deriva che è stata rimossa dal campione corretto.

La massima intensità di proiezione rimuove la dimensione dal set di dati, ma come approccio utile per esaminare rapidamente i risultati della correzione della deriva. Qui vediamo le immagini di proiezione massime per ogni punto di collegamento nei loro set di dati corretti e non corretti. Quando questo esperimento time-lapse viene proiettato come una singola immagine, la quantità di deriva che può verificarsi anche in un breve esperimento time-lapse è evidente.

Le correzioni apportate registrando la deriva di un canale del campione vengono applicate anche a tutti gli altri canali contenuti in questa pila di immagini. La procedura per la correzione della deriva se la memoria è limitata sul sistema è leggermente modificata. Seleziona l'opzione stack virtuale utilizzato sia nel formato di acquisto, nel menu di importazione e nel menu a comparsa del plug-in di deriva 3D corretto.

Quando selezioni questa opzione, ti verrà chiesto di selezionare una posizione in cui un plug-in può esportare singoli file immagine per ogni fetta di canale e punto temporale del tuo esperimento time-lapse. Lo stack virtuale generato contiene la stessa correzione della deriva dell'esempio precedente. Se apriamo la posizione di salvataggio selezionata, vedremo i singoli file di sequenza di immagini risultanti Generato.

Per aprire questa raccolta di file, utilizzare lo strumento di importazione della sequenza di immagini. Il file risultante non separerà i canali, le sezioni ottiche o i punti temporali. Per visualizzare queste caratteristiche, convertire lo stack in un hyper stack utilizzando i dati del file di registro, inserire il numero di canali, le fette ottiche e i punti di collegamento raccolti nel, Possiamo nuovamente modificare le tabelle di ricerca per regolare il colore visualizzato del nostro esperimento time-lapse.

Questo protocollo corregge la deriva che si verifica tra i punti temporali La deriva che si verifica all'interno dell'acquisizione di un singolo punto temporale non può essere corretta da questo protocollo. Si consiglia di ridurre il tempo impiegato per ogni punto temporale da acquisire con i parametri utilizzati per l'acquisizione delle immagini. La capacità di correggere la deriva nel software di post-elaborazione consente di analizzare e misurare i movimenti delle cellule che altrimenti sarebbero abili in base alla deriva del campione.