Name: Separazione automatica di C. elegans Variabilmente Colonizzato da un batterio patogeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Scopri come separare Caenorhabditis elegans variabilmente colonizzati da Pseudomonas aeruginosa GFP utilizzando il wormsorter. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica immunitaria e decouplare la risposta immunitaria innata dal livello di colonizzazione patogena.

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Gli autori ringraziano il Ellison Medical Foundation per il loro sostegno. Desideriamo anche ringraziare i membri del laboratorio Abby Dernburg per l&#39;assistenza con l&#39;utilizzo del wormsorter.

1. Ottenere una cultura sincronizzata di giovane adulto animali <ol><li> Crescere vermi in diverse piastre NGM seminato con OP50-1 E. coli, batteri (10x concentrata da una cultura satura) fino a molti worm hanno raggiunto la fase gravida. </li><li> Trattare gli animali gravide con la soluzione di uovo-prep per ottenere una coltura sincronizzata (uova). </li><li> Uova Piatto su diversi 60 mm piastre NGM seminato con 10x OP50-1 concentrato ad una densità di circa 150-200 uova / piastra. </li><li> Incubare le piastre a 25 ° C per 2 giorni (fino vermi hanno raggiunto la L4 - Giovani stadio adulto). </li></ol> 2. Preparazione Pseudomonas aeruginosa Piatti e infettare Worms <ol><li> Il giorno dell&#39;uovo-prep (passo 1.1) inoculare una coltura PA14 :: GFP in 2 ml di B supporti contenenti rifampicina re ad una concentrazione finale di 100 mg / ml. Incubare la coltura a 37 ° C con agitazione O / N. </li><li> Piatto il PA14 :: GFP culTure su altrettanti piatti Uccidere lenta (SKP) come necessario per il saggio. Su ogni 150 millimetri SKP Petri dish pipetta 75-100 ml di cultura satura e diffondere uniformemente con una spatola di vetro sterile. Incubare le piastre a 37 ° C per 20-24 ore. </li><li> Rimuovere le piastre da incubatore e lasciare raffreddare a temperatura ambiente (~ 20 min). Utilizzando tampone M9, lavare i vermi dal passaggio 1.4 su PA14 :: piastre GFP in un volume minimo di liquido. Quando si utilizzano piastre da 150 mm, diverse centinaia di vermi possono essere posizionati su un unico piatto. </li><li> Incubare le piastre a 25 ° C per 18-21 ore. Per P. vermi adulti giovani aeruginosa esposte, questa è la finestra temporale visualizza la distribuzione ottimale delle colonizzato vs animali non colonizzato. </li></ol> 3. Impostazione del Wormsorter Prima di eseguire il campione tipo, assicurarsi che la macchina sta funzionando correttamente. I dettagli possono essere ottenuti presso http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, e THe passaggi essenziali sono riportate qui di seguito. <ol><li> Impostare la pressione della valvola guaina a circa 5 psi (4,5-5,5 range). </li><li> Per verificare che la portata del liquido guaina è opportuno posizionare un tubo da 15 ml sotto l&#39;erogatore, attivare la valvola di guaina, e spegnere la valvola selezionatrice. Tenere il tubo sotto il dispenser per 60 sec. Il volume del tubo deve essere 9-10 ml. Se è fuori di questo intervallo, regolare la pressione della valvola guaina di conseguenza. </li><li> Per garantire che la portata del liquido guaina (impostato come nel passaggio 3.2) consentirà un&#39;accurata selezione, verificare il tasso di ordinamento mediante 40 particelle micron di controllo: </li><li> Spegnere la valvola guaina. Aggiungere circa 25 ml di soluzione di particella controllo al serbatoio. </li><li> Aprire la valvola guaina, e la valvola di campionamento. </li><li> Sul software per computer, passare alla modalità &quot;particella di controllo&quot; e fare clic acquisire. </li><li> Assicurarsi che il flusso di particelle è ~ 5-8 particelle / sec, con una TOF (Time Of Flight) approssimare la larghezzadella particella, 40 pm. Tale TOF indica che solo un singolo 40 pm oggetto attraversa alla volta. Se i valori sono al di fuori di questo intervallo, regolare le impostazioni (seguendo le indicazioni di cui sopra) di conseguenza. </li></ol> 4. Ordinando Colonizzato vs non colonizzato Worms <ol><li> Utilizzando M9, lavare i vermi in tubi conici da 15 ml. Consentire vermi adulti depositarsi sul fondo della provetta per gravità e rimuovere il surnatante. Riempire il tubo con fresche M9. Ripetere questo processo in 3-4x. Ciò elimina gran parte delle larve e batteri in eccesso e dura circa 10 min. </li><li> Aggiungi vermi al serbatoio wormsorter con un dolcemente mescolando piccola ancoretta. </li><li> Regolare il guadagno iniziale del segnale impostando la PMT verde a 600 e il rosso e giallo PMT a 200. </li><li> Iniziare l&#39;acquisizione di dati per regolare le impostazioni. </li><li> Obiettivo per un tasso sorta di 25-30 eventi (vermi) al secondo. Se il tasso di numero è troppo alta, diluire i vermi nel serbatoio con M9 conseguenza. Se il tasso è quelloo bassa, aggiungere più vermi in un piccolo volume di M9. </li><li> Se l&#39;esperimento richiede una separazione molto rigorosa colonizzato vs vermi non colonizzato, impostare il &quot;controllo di coincidenza&quot; a &quot;puro&quot;. Ciò garantisce che, in caso si verificano due oggetti troppo vicini l&#39;uno all&#39;altro oppure nella stessa caduta, la macchina rifiuta la goccia anziché raccogliendola. </li><li> Per ordinare la popolazione di interesse, disegnare cancelli intorno agli assi che indicano le dimensioni (per ottenere vermi adulti) e intensità di fluorescenza (cioè alto per colonizzata, basso per non colonizzato). I valori di fluorescenza gating devono essere determinati empiricamente. </li><li> Posizionare un piatto multi-pozzo o una capsula di Petri sotto l&#39;erogatore per raccogliere i vermi quindi aprire la valvola di ordinamento per iniziare l&#39;ordinamento vermi. </li><li> Raccogliere una piccola popolazione di animali per verificare al microscopio che la popolazione filtrate è la popolazione di interesse. In caso contrario, regolare i parametri di gating di conseguenza e continuare con la raccolta di campioni. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo descriviamo approfitta marcatura fluorescente di entità esterna della vite senza fine, di seguire le interazioni tra la vite e il suo ambiente. Nel caso che presentiamo, la separazione è basata sull&#39;etichettatura di un agente patogeno ed è stato impiegato per vermi separati con carico agente patogeno pesante da quelli senza (o luce) del carico. Successiva analisi di espressione genica trovato alcuna differenza nella risposta immunitaria tra i due gruppi suggerendo che fossero indipendenti carico patogeno. ...

Smistamento automatico verme è molto simile FACS, operando misurando un segnale fluorescente in una vite senza fine (tipicamente fornita dai transgenici espressione di proteine ​​reporter) che passa raddrizzato in un tubo, consentendo il reindirizzamento sia ad un tubo di raccolta / pozzetto o ad un contenitore per rifiuti secondo di gating parametri fissati dal ricercatore 1. Il wormsorter può facilitare la ricerca in molti modi, un esempio di impiegare come uno strumento analitico è uno studio che ha seguito i modelli spazio-temporali di attività del promotore per quasi 1.000 geni 2. Tuttavia, il principale uso del wormsorter è in schermi genetici, seguendo bersaglio livelli di espressione di geni o localizzazione di proteina fluorescente lungo l&#39;asse del verme 3-5. Qui, descriviamo una nuova applicazione per la wormsorter, nel seguire la colonizzazione del worm da un agente patogeno fluorescente tag. Con questo come uno strumento ci siamo concentrati sul rapporto tra pathogen colonizzazione / carico e la risposta immunitaria, per acquisire nuove conoscenze sui meccanismi responsabili per l&#39;inizio delle risposte immunitarie nel verme. In quasi tutti gli organismi studiati fino ad oggi, l&#39;inizio delle risposte immunitarie innate di agenti patogeni microbici dipende dal riconoscimento di pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP), e / o modelli molecolari di pericolo / danno-associato (smorza) 6,7. Le strutture microbiche primi sono conservati che includono componenti della parete cellulare microbica, il suo flagello, o il suo doppio strato lipidico 6, la seconda, comprendono sia molecole rilasciate (ad esempio ATP 8), proteine ​​alterate o altri marcatori di processi cellulari alterati 9,10. Entrambi i tipi di segnali sono riconosciuti da proteine ​​designati come recettori di pattern recognition (PRR), che su specifica di legame di una molecola modello di attivare una catena di eventi che conducono ad una risposta protettiva. C. elegans è stato estremamente utile come tractamodello bile sviscerare i vari aspetti delle interazioni ospite-patogeno, ma una cosa che non è ben compreso è come risposte immunitarie sono iniziati nel verme. Nessuno dei recettori putativi che sono orthologous ai recettori pattern recognition (PRR) in altri organismi hanno dimostrato di legare PAMPs, e molti degli ortologhi di PRRs che sono cardine per le risposte immunitarie in altri organismi mostrare un contributo sorprendentemente limitato a risposte verme patogeni e resistenza. Per esempio, il recettore Toll Drosophila, che è essenziale per resistere patogeni Gram positivi, è rappresentato in C. elegans da una suola omologo, tol-1, che contribuisce alla protezione dal patogeno Gram-negativo Salmonella Typhimurium 11, ma non da altre testate Gram-negativi, patogeni o-positivi 11,12. Queste osservazioni, combinato con i dati che indicano che le risposte immunitarie potrebbe essere indotta da interrompendo proteina cellulare traduzione hcome indotto alcuni a suggerire che C. elegans rileva principalmente smorza 9,13,14. Tuttavia, i rapporti capacità degli agenti patogeni morti per indurre risposte immunitarie descrivono suggerire che PAMP legame può essere ha un ruolo importante nel riconoscimento patogeno in C. elegans 15,16. Il lavoro precedente concentrandosi sulle risposte immunitarie in età sincronizzato geneticamente identici C. elegans popolazioni, hanno dimostrato grande variabilità individuale nella colonizzazione intestinale da parte dei batteri Gram-negativi patogeno Pseudomonas aeruginosa. Tuttavia, gli studi di profilatura trascrizionale trattate queste popolazioni variabile colonizzati come un&#39;unica entità 17,18. Approfittando di questa variabilità, abbiamo sviluppato un protocollo di messa a fuoco di un wormsorter automatizzato per separare le popolazioni colonizzate differenziale di Caenorhabditis elegans esposti a GFP che esprimono P. aeruginosa. Esaminando l&#39;espressione genica in popolazioni diversamente colonizzate FACIla valutazione litated del rapporto tra carico patogeno (e il danno associato) e le risposte immunitarie e nuove intuizioni fornite circa il riconoscimento dei patogeni in C. elegans 19. Qui di seguito descriviamo il protocollo, che potrebbe essere applicato per ordinare i vermi infettati con qualsiasi agente patogeno fluorescente. Per utenti potenziali occorre notare che il numero di vermi che devono essere risolti dipende dalla natura delle analisi successive e protocolli in uso. Ad esempio, nel caso di analisi di espressione genica microarray,&gt; 1.000 vermi dovranno avere abbastanza RNA, se si utilizzano protocolli standard, ma ~ 100 vermi sarebbero sufficienti se l&#39;amplificazione è impiegato, consentendo veloce raccolta di materiale e riducendo al minimo lo stress a i vermi.

<table><tbody><tr><td>M9 Tampone</td><td>preparato in casa</td><td></td><td>Ricetta presso wormbook.org</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione per la preparazione delle uova</td><td>preparata in casa</td><td></td><td>50 ml di acqua; 40 ml di candeggina; 10 ml di idrossido di sodio 10 N</td></tr><tr><td>Piastre NGM</td><td>preparate in casa</td><td></td><td>Ricetta a wormbook.org</td></tr><tr><td>piastre SKP</td><td>preparate in casa</td><td></td><td>Ricetta uguale a NGM, solo 0,35% di peptone invece dello 0,25% di</td></tr> <tr><td>particelle di test di controllo</td><td>Union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr></tbody></table>

separazione automatica di<em&gt; c. elegans</em&gt; variabilmente colonizzato da un batterio patogeno

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Il wormsorter è uno strumento analogo ad una macchina FACS che viene utilizzato in studi di Caenorhabditis elegans, tipicamente per ordinare vermi basato su espressione di un reporter fluorescente. Qui, si evidenzia un uso alternativo di questo strumento, per l&#39;ordinamento vermi in base al loro grado di colonizzazione da un agente patogeno-GFP che esprimono. Questo nuovo utilizzo ci ha permesso di affrontare il rapporto tra la colonizzazione dell&#39;intestino verme e induzione di risposte immunitarie. Mentre C. elegans risposte immunitarie a diversi agenti patogeni sono stati documentati, non si sa ancora che cosa li avvia. Le due possibilità principali (che non si escludono a vicenda) sono il riconoscimento di pattern molecolari associati ai patogeni, e la rilevazione dei danni causati da infezione. Per distinguere tra le due possibilità, l&#39;esposizione al patogeno deve essere dissociata dai danni che provoca. Il permesso wormsorter separazione dei vermi che sono stati ampiamente-colonizzata dai Gram-npatogeno egative Pseudomonas aeruginosa, con danni probabilmente causato da un carico patogeno, da vermi che sono stati esposti in modo simile, ma non, o marginalmente, colonizzato. Queste popolazioni distinte sono stati usati per valutare il rapporto tra carico patogeno e l&#39;induzione di risposte immunitarie trascrizionali. I risultati suggeriscono che i due sono dissociate, supportando la possibilità di riconoscimento patogeno.

Quando pari età, geneticamente identici C. elegans sono esposti a P. aeruginosa, un&#39;ampia distribuzione si osserva nei livelli di colonizzazione (Figura 1A). Con l&#39;aiuto del protocollo qui descritto separazione efficiente di non colonizzato da vermi colonizzati può essere raggiunto (Figura 1B). A differenza dei worm non colonizzato, worm colonizzati mostrano segni di danni, come la lentezza e ridotto defecazione 19. Quest&#39;ultimo può essere un mot...

Il wormsorter facilita schermi genetiche in Caenorhabditis elegans di classificare vermi secondo l&#39;espressione di giornalisti fluorescenti. Qui, descriviamo un nuovo utilizzo: ordinamento secondo la colonizzazione da un agente patogeno-GFP che esprimono, e ci avvaliamo di esaminare il ruolo poco compreso del riconoscimento patogeno in avvio risposte immunitarie.

Separazione automatica di<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabilmente Colonizzato da un batterio patogeno

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare il contributo della colonizzazione e dei danni ad essa associati nell'attivazione delle risposte immunitarie innate in *C. elegans*. Questo viene ottenuto esponendo una popolazione sincronizzata di adulti giovani di *C. elegans* a *Pseudomonas aeruginosa* che esprime la proteina fluorescente verde o GFP, generando una popolazione di vermi colonizzata in modo variabile dal patogeno. Dopo il lavaggio, le popolazioni di vermi differentemente colonizzati vengono separate in popolazioni pure, concentrandosi sui due estremi rappresentati dai vermi completamente colonizzati e da quelli non colonizzati.In seguito, l'RNA viene estratto da queste popolazioni e l'espressione dei geni immunitari viene valutata in confronto a vermi coltivati su e coli non patogeni. Per esaminare la relazione tra la risposta immunitaria e la colonizzazione, si ottengono risultati che dimostrano come la risposta immunitaria innata di sea elegance nei confronti di p arosa possa essere dissociata dalla colonizzazione del patogeno. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri approcci per lo studio dell'attivazione della risposta immunitaria in

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Taylor, M. N., et.al. Utilizzo dei dati di un singolo verme per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni Caenorhabditis elegans-batterio. J. Vis. Exp. (2022)Questo video dimostra l'esposizione di vermi Caenorhabditis elegans privi di germi e di età corrispondente a un ceppo batterico per la colonizzazione intestinale. Spiega la rimozione selettiva dei batteri esterni e non aderenti, lasciando solo i batteri vitali aderiti all'epitelio intestinale per la quantificazione.

Valutazione della colonizzazione batterica intestinale in C. elegionsprivi di germi

Fonte: Petersen, C. et al., Isolamento e caratterizzazione del microbiota naturale del nematode modello Caenorhabditis elegans. J. Vis. Esp. (2022)Questo video dimostra l'isolamento e la coltivazione di specie batteriche associate a Caenorhabditis elegans. Una lisi a perla di C. elegans, seguita da una coltura selettiva, consente l'isolamento di diversi ceppi microbici per ulteriori analisi.

Isolamento e coltivazione di Caenorhabditis elegans-Batteri associati

Fonte: Chen, Y., et al. Valutazione della virulenza e della patogenesi dell'infezione da Aeromonas in un modello di Caenorhabditis elegans . J. Vis. Esp. (2018)Questo video mostra un test di sopravvivenza che utilizza C. elegans per modellare la patogenesi di Aeromonas , dove l'ingestione orale del batterio porta a infezioni intestinali e mortalità, consentendo una valutazione quantitativa della virulenza batterica in un sistema ospite vivo.

Modellazione della patogenesi di Aeromonas in C. elegans utilizzando un test di sopravvivenza

Fonte: Le, T. A. N. , et al., Misurare gli effetti di batteri e sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale di Caenorhabditis elegans. J. Vis. Esp. (2019)Questo video mostra un saggio basato sulla fluorescenza per quantificare la permeabilità intestinale in C. elegans esposto a Pseudomonas aeruginosa. Rispetto ai controlli alimentati con Escherichia coli, i vermi trattati con patogeni mostrano una maggiore perdita di fluorofori nella cavità corporea, indicando danni alla barriera...

Valutazione della permeabilità intestinale in C. elegans dopo l'esposizione batterica

Qui, presentiamo il nematode Caenorhabditis elegans come un modello versatile host per studiare l'interazione microbica.

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

Qui descriviamo un protocollo che è un host adattabile, intero, strumento di screening ad alto contenuto che possa essere utilizzata per studiare le interazioni ospite-patogeno ed essere utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci.

Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

I nematodi caenorhabditis selvatici sono associati a molti microbi, spesso nel lume intestinale o infettando l'intestino. Questo protocollo descrive un metodo per arricchire i microbi incolturabili che colonizzano l'intestino, sfruttando la resistenza della cuticola dauer.

Pulizia selettiva dei nematodi caenorhabiditi selvatici per arricchire i batteri del microbioma intestinale

I microbi intestinali, compresi i batteri extracellulari e gli agenti patogeni intracellulari come il virus Orsay e i microsporidi (funghi), sono spesso associati ai nematodi selvatici di Caenorhabditis . Questo articolo presenta un protocollo per rilevare e quantificare i microbi che colonizzano e / o infettano i nematodi C. elegans e per misurare il carico patogeno dopo infezioni controllate in laboratorio.

Ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) per visualizzare la colonizzazione microbica e l'infezione nell'intestino di Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive un'interruzione di 96 pozzi di singole Caenorhabditis elegans colonizzate battericamente a seguito di paralisi fredda e sbiancamento superficiale per rimuovere i batteri esterni. La sospensione risultante è placcata su piastre di agar per consentire una quantificazione accurata e di media produttività della carica batterica in un gran numero di singoli vermi.

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

Caenorhabditis elegans è una delle principali specie modello in biologia, ma quasi tutte le ricerche vengono eseguite in assenza dei suoi microbi naturalmente associati. I metodi qui descritti aiuteranno a migliorare la nostra comprensione della diversità dei microbi associati come base per la futura ricerca funzionale di C. elegans.

Isolamento e caratterizzazione del microbiota naturale del nematode modello Caenorhabditis elegans

Scopri come separare Caenorhabditis elegans variabilmente colonizzati da Pseudomonas aeruginosa GFP utilizzando il wormsorter. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica immunitaria e decouplare la risposta immunitaria innata dal livello di colonizzazione patogena.

Separazione automatica di

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