Separazione automatica di C. elegans Variabilmente Colonizzato da un batterio patogeno

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di valutare i contributi della colonizzazione e il suo danno associato all'avvio delle risposte immunitarie innate nell'eleganza del mare. Ciò si ottiene esponendo una popolazione sincronizzata di giovani adulti di eleganza marina a pseudomonas arosa che esprime la proteina fluorescente verde o GFP, che produce una popolazione di vermi variabilmente colonizzati dal patogeno. Dopo aver lavato il differenziale, le popolazioni colonizzate di vermi vengono separate in popolazioni pure concentrandosi sui due estremi dei vermi completamente colonizzati e non colonizzati.

Successivamente, l'RNA viene estratto da queste popolazioni e l'espressione genica immunitaria viene valutata rispetto ai vermi cresciuti su e coli non patogeni. Al fine di esaminare la relazione tra la risposta immunitaria e la colonizzazione, si ottengono risultati che dimostrano che la risposta immunitaria innata dell'eleganza marina alla patorosa può essere disaccoppiata dalla colonizzazione dei patogeni. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri approcci per studiare l'inizio della risposta immunitaria in sea elegance è che affronta la variabilità dell'infezione nelle popolazioni calde, permettendoci di distinguere diversi aspetti del processo di infezione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'eleganza del mare, sull'immunità innata, come ad esempio su quale sia la base per l'avvio delle risposte immunitarie innate e in modo ad alto rendimento. Qual è l'impatto di diverse manipolazioni genetiche o ambientali sulla capacità di resistere alla colonizzazione dei patogeni? Per iniziare a far crescere i vermi su diversi nematodi, terreni di crescita o piastre NGM seminate con batteri e coli fino a quando molti vermi hanno raggiunto lo stadio grave.

Quindi trattare gli animali gravi con una soluzione per la preparazione delle uova per ottenere una coltura sincronizzata. Piatto successivo. Le uova su diverse piastre NGM da 60 millimetri sono state seminate con batteri a una densità di circa 150-200 uova per piastra.

Saranno necessarie da 15 a 20 piastre per ottenere diverse migliaia di vermi. Per l'esperimento di smistamento, gli utenti dovrebbero aumentare utilizzando piastre di diametro maggiore con più uova per piastra se è necessario un numero maggiore di vermi. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per due giorni fino a quando i vermi non hanno raggiunto lo stadio L quattro o giovane adulto.

Il giorno successivo alla preparazione degli ovuli inoculare una GFP che esprime la coltura POSA, PA 14 GFP, in due millilitri di B.Medium contenente antibiotico. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione durante la notte. Il giorno successivo la coltura GFP di PA 14 viene applicata su tutte le piastre di uccisione lenta necessarie per il saggio su ciascuna piastra di Petri da 150 millimetri.

Pipettare da 75 a 100 microlitri di coltura satura e distribuire uniformemente. Utilizzando un divaricatore di vetro sterile, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 20-24 ore. Estrarre le piastre con PA 14 GFP dall'incubatrice e lasciarle raffreddare a temperatura ambiente.

Nel frattempo, per raccogliere i vermi cresciuti su piastre NGM, aggiungere una piccola quantità di tampone M nine sufficiente a coprire la piastra. Agitare delicatamente la piastra e trasferire il liquido in un tubo conico da 15 millilitri. Lasciare che le viti si depositino sul fondo e rimuovere il liquido in eccesso prima di trasferirle su piastre GFP PA 14 In un volume minimo di liquido, quando si utilizzano piastre da 150 millimetri, è possibile posizionare diverse centinaia di viti su una singola piastra.

Incubare le piastre a 25 gradi Celsius per 18-21 ore per i giovani vermi adulti esposti a parosa. Questa è la finestra temporale che mostra la distribuzione ottimale degli animali colonizzati rispetto a quelli non colonizzati prima di eseguire l'ordinamento del campione per assicurarsi che la macchina funzioni correttamente. I passaggi essenziali sono descritti qui e i dettagli possono essere ottenuti online.

Impostare la pressione della valvola della guaina a circa cinque PSI per verificare che la portata del fluido della guaina sia appropriata. Posizionare un tubo conico da 15 millilitri sotto l'erogatore. Aprire la valvola della guaina e chiudere la valvola di smistamento.

Tenere il tubo sotto l'erogatore per 60 secondi. Il volume nel tubo dovrebbe essere compreso tra nove e 10 millilitri. Se è al di fuori di questo intervallo.

Regolare di conseguenza la pressione della valvola della guaina per assicurarsi che la portata del fluido della guaina consenta una selezione accurata. Testare la velocità di ordinamento chiudendo prima la valvola della guaina. Quindi aggiungere circa 25 millilitri di soluzione di particelle di controllo al serbatoio.

Accendere la valvola della guaina e la valvola del campione sul software del computer. Passa alla modalità particella di controllo e fai clic su acquisisci. Assicurati che la portata delle particelle sia di circa cinque-otto particelle al secondo con il tempo di volo che si avvicina alla larghezza della particella di 40 micrometri.

In questo modo si garantisce il passaggio di un solo oggetto di 40 micron alla volta. Se i valori sono al di fuori di questo intervallo, regolare le impostazioni di conseguenza. Utilizzando nove vermi tampone in tubi conici da 15 millilitri, lasciare che i vermi adulti affondino sul fondo del tubo per gravità e rimuovere il surnatante.

Riempire il tubo con un tampone M nine fresco. Ripeti questo processo tre o quattro volte. Questo rimuove una grande percentuale di larve e batteri in eccesso e richiede circa 10 minuti.

Aggiungere i vermi al serbatoio del selezionatore di viti che contiene una piccola ancoretta che si mescola delicatamente. Regolare il guadagno del segnale iniziale impostando il tubo fotomoltiplicatore verde su 600 e il tubo fotomoltiplicatore rosso e giallo su 200. Inizia ad acquisire i dati per regolare le impostazioni.

Punta a una velocità di ordinamento da 25 a 30 eventi o worm al secondo. Se il tasso di numero è troppo alto, diluire i vermi nel serbatoio con M nove. Tamponare di conseguenza.

Se il tasso è troppo basso, aggiungi più vermi in un piccolo volume di M nove. Se l'esperimento richiede una separazione molto rigorosa tra vermi colonizzati e non colonizzati, impostare il controllo di coincidenza su puro. Ciò garantisce che se due oggetti si trovano troppo vicini l'uno all'altro o nella stessa caduta, la macchina rifiuta la caduta.

Piuttosto che raccoglierlo per ordinare la popolazione di interesse, disegna delle porte attorno all'asse indicando le dimensioni e l'intensità della fluorescenza. I valori per il gating fluorescente devono essere determinati empiricamente. Quindi, posiziona una piastra a più pozzetti o una capsula di Petri sotto l'erogatore per raccogliere i vermi.

Quindi aprire la valvola di smistamento per iniziare a smistare i vermi. Raccogli una piccola popolazione di animali per verificare al microscopio che la popolazione ordinata sia la popolazione di interesse. In caso contrario, regolare di conseguenza i parametri di un gating e continuare con la raccolta del campione.

Quando l'età corrispondeva all'eleganza del mare geneticamente identica che è esposta a GFP che esprime posa si traduce in un'ampia distribuzione dei livelli di colonizzazione, è stata ottenuta una separazione efficiente dei vermi non colonizzati da quelli colonizzati utilizzando un selezionatore di vermi. A differenza dei vermi non colonizzati, i vermi colonizzati mostrano segni evidenti di lentezza e riducono la defecazione. Quest'ultimo potrebbe essere un motivo per cui i vermi colonizzati da Pöarosa hanno difficoltà a eliminare l'infezione.

Quattro geni sono stati indotti in modo simile all'esposizione a P arosa, indipendentemente dallo stato di colonizzazione dei vermi, e la R-T-P-C-R quantitativa è stata utilizzata per misurare l'espressione dei geni. I quattro geni sono noti per far parte della risposta immunitaria del CLEGAN. Lys 2 codifica per un lisozima, due geni non caratterizzati rispondono specificamente all'infezione, di cui uno contribuisce anche alla resistenza all'infezione, e PGP 5 risponde all'infezione e allo stress da metalli pesanti.

I risultati corroborano i risultati pubblicati in precedenza che indicano che la colonizzazione e il danno associato non sono necessari per una risposta immunitaria. Invece, puntando ai modelli molecolari associati ai patogeni come dati segnale che mostrano che PGP 5 è indotto in animali non colonizzati, che non ci si aspetta di sperimentare. I danni estesi suggeriscono una sovrapposizione nei programmi regolatori, che controllano le risposte immunitarie e le risposte generali allo stress nell'eleganza del mare.

Questo metodo può fornire nuove intuizioni sull'avvio delle risposte immunitarie nell'eleganza del mare, ma potrebbe anche essere applicato ad altre questioni come gli effetti delle condizioni ambientali o della manipolazione genetica sulla colonizzazione o sulla competizione tra diversi agenti patogeni oltre ai processi di infezione. Questo metodo potrebbe anche essere applicato per seguire altre interazioni dei vermi con il loro ambiente, come l'ingestione o il sequestro di metaboliti o sostanze chimiche. Seguendo questa procedura, le popolazioni ordinate di interesse possono essere utilizzate per una varietà di scopi oltre all'espressione genica.

Questi includono la raccolta di animali vivi per successivi saggi di infezione o sopravvivenza o esperimenti comportamentali. Questa tecnica fornisce un mezzo utile per studiare gli effetti dell'esposizione e della colonizzazione di agenti patogeni sull'immunità innata e sull'eleganza del mare.