Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di identificare le modificazioni post-traduzionali delle proteine coinvolte nei complessi proteici vegetali, espresse prima transitoriamente o stabilmente in plana, le proteine tag di interesse. Quindi estrarre le proteine totali dal tessuto della pianta e precipitare immuno la proteina di interesse. Successivamente, separare le proteine immunoprecipitate su un gel di acrilammide ed estrarre e digerire le proteine dalla banda di gel di interesse.

Ora invia i campioni di proteine per la spettrometria di massa. In definitiva, i risultati della spettrometria di massa possono rilevare cambiamenti dinamici nelle modifiche post-traduzionali come la fosforilazione. A differenza di metodi alternativi come l'incubazione in vitro della chinasi con substrato, questo metodo esprime le proteine nel planter.

Quindi non è necessario sapere quale chinasi è responsabile della fosforilazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia vegetale, come il modo in cui i segnali vengono trasdotti in risposta allo stress, ai cambiamenti ambientali o al riconoscimento dei patogeni. Oltre all'identificazione della fosforilazione, siti di complessi proteici di resistenza attivati, questo metodo può essere ampiamente applicato a qualsiasi modifica post-traduzionale di qualsiasi complesso proteico vegetale.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non sono abituate a lavorare con grandi quantità di estratto ed eseguire più passaggi del protocollo in un solo giorno. Per l'espressione transitoria, far crescere i ceppi di agrobacterium tohin in fase stazionaria. Raccogliere gli agrobatteri mediante centrifugazione a 3000 Gs per cinque minuti.

Risospendere i pellet e il tampone di infiltrazione. Buffer. Ora si infiltra. Piante di NCOA hamana di quattro settimane con agrobatteri manualmente utilizzando una siringa senza ago da un millilitro o sotto vuoto con lo 0,02% di tensioattivo, da due a cinque giorni dopo l'infiltrazione.

Raccogli le foglie infiltrate, le foglie, congelale in azoto liquido e conservale a meno 80 gradi Celsius. Successivamente, macina 20 grammi di tessuto vegetale e azoto liquido utilizzando un mortaio e un pestello a 80 millilitri di tampone freddo C per i 20 grammi. Mescolate bene e scongelate con ghiaccio.

Ora omogeneizza con tre raffiche di 10 secondi ciascuna alla massima velocità. Filtrare l'omogeneizzato e centrifugare a 30.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Nel frattempo a 100 microlitri di matrice di affinità adatta a 500 microlitri di tampone bloccante freddo D per cinque minuti a quattro gradi Celsius e lavato tre volte con un millilitro di tampone freddo D.Successivamente, rimuovere il supernat dell'estratto di foglie e passarlo attraverso una siringa da 0,45 micrometri.

Filtrare in un nuovo tubo con ghiaccio. Aliquotare l'estratto grezzo. Per un immuno blot.

Aggiungi cinque vortici buffer di caricamento della pagina XSDS e fai bollire i campioni per denaturarli. Aggiungere 50 microlitri della matrice di affinità, sospesa nel tampone D a ciascuna provetta. Incubare con una leggera rotazione per due ore a quattro gradi Celsius, centrifugare per pellettare la matrice di affinità.

Quindi assumere un'aliquota dell'estratto non legato per un immuno blot. Scartare il resto del sano, lasciando circa 500 microlitri sul fondo del tubo. Risospendere la soluzione di impasto con una punta a foro largo.

Raggruppare la soluzione di liquame miscelato da entrambe le provette in un'unica provetta da 1,5 millilitri. Pulsare tre volte per cinque secondi utilizzando una centrifuga da banco per precipitare la matrice di affinità e rimuovere il supernat dopo tre-cinque lavaggi con un millilitro di tampone freddo, D.Rimuovere il tampone in eccesso, D con un ago da siringa, eluire con 200 microlitri del tampone di eluizione appropriato, agitando costantemente. Tirare i tre EIT in un unico tubo.

Quindi concentrare le proteine utilizzando 30 microlitri di vortice di resina di assorbimento. Fermiamoci per cinque minuti e facciamo precipitare la resina, scartiamo il supernat. Aggiungere 50 microlitri di un tampone di caricamento della pagina XSDS alla matrice di affinità precipitata o al vortice di resina di assorbimento e far bollire per 10 minuti a 80-100 gradi Celsius in una centrifuga a blocchi di calore.

La matrice di affinità bollita è resina per due minuti a 10.000. GS aliquota cinque microlitri di supernat per il blocco immuno e scorrerlo con altre frazioni su una pagina SDS lunga 10 centimetri. Gel per la separazione e l'identificazione di proteine fosforilate mediante spettrometria di massa.

Caricare i restanti 45 microlitri su una macchia di gel SDS. Il gel per pagine SDS con blu brillante kamasi colloidale. Quindi trattenere il gel con abbondante lavaggio e acqua, preferibilmente durante la notte.

Ora con un bisturi pulito, asportare la banda di interesse dal gel, tagliare la fetta di gel in cubetti da due a quattro millimetri e trasferire il campione in una provetta. Lavare i pezzi di gel con il 50% di nitrile di aceto e il bicarbonato di ammonio al 50 millivare fino a quando non si macchia. Quindi pipettare la soluzione.

Facendo attenzione a non rimuovere i pezzi di gel. Disidratare il campione con nitrile 100% aceto per cinque minuti e rimuovere il liquido libero. Quindi, per ridurre i legami proteinici di solfuro a 10 millimolari DTT e incubare per 30-45 minuti a 56 gradi Celsius con agitazione, rimuovere il liquido libero ora per alchilare i residui di cisteina.

Aggiungere 55 millimolari di cloroacetamide per 20-30 minuti a temperatura ambiente al buio. Rimuovere il liquido libero, quindi lavare due volte i pezzi di gel con nitrile di aceto al 50% per 10 minuti. Rimuovere il liquido libero.

Ora disidratare i pezzi di gel con 100% nitrile di aceto per cinque minuti e rimuovere il liquido libero per il Triptych Digest. A 40 microlitri di soluzione di lavoro di tripsina, lasciare reidratare i pezzi di gel per 10 minuti a un tampone di digestione sufficiente a coprire i pezzi di gel. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte per fermare la digestione ed estrarre i peptidi dai pezzi di gel al 5% di acido formico sonicato per 5-10 minuti.

Quindi trasferire il supernat in una nuova provetta, essiccare i peptidi mediante liofilizzazione o un concentratore sottovuoto e conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius. Questo esperimento purifica il complesso chinasico P-R-F-P-T-O dalla nacoa hamana, una NACOA hamana transgenica che esprime 35 SPTO è stata trasformata transitoriamente con 35 SPRF flag e il complesso è stato immunoprecipitato con Anti-Flag M due aros. L'immuno blot illustra un'efficiente immunoprecipitazione della proteina PRF bersaglio, sia del PTO che della proteina effettrice interagente co-purificata con PRF, come indicato dalla rilevazione degli anticorpi e dall'analisi della spettrometria di massa.

In questo caso, la strategia è stata quella di colpire la proteina PTO con Anti-Flag. La strategia è stata cambiata. Al fine di identificare i siti di fosforilazione della PTO.

La quantità totale di proteina PTO che comprende sia il complesso PRF che la forma libera è stata immunoprecipitata con Anti-Flag M two aros e sottoposta a frazionamento della pagina SDS, digestione del trittico ingel e l'analisi spettrometrica di massa ha portato a peptidi PTO che coprono circa l'80% della sua sequenza. È interessante notare che è stato identificato un insieme di singoli siti di fosforilazione per i peptidi PTO. Si noti che i siti di doppia fosforilazione sono stati identificati solo in presenza di entrambe le proteine effettrici.

È importante ottenere quantità sufficienti di proteine vegetali per identificare i componenti di un complesso proteico e anche rilevare la modifica post-traduzionale di una proteina di interesse. Ricorda che le modifiche alla mappatura come la fosforilazione richiedono una quantità ragionevole di proteine dalla spettrometria di massa, quindi almeno una debole banda dovrebbe essere evidente sul tuo gel Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'identificazione di componenti complessi, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come il modo in cui l'attivazione del complesso immunitario porta all'immunità funzionale.

Non dimenticare che lavorare con tamponi organici, batteri e BBL da rasoio può essere estremamente pericoloso, quindi prendi precauzioni come indossare guanti e cappotti addominali.