Progettazione e analisi del comportamento delle preferenze di temperatura e del suo ritmo circadiano in Drosophila

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la preferenza di temperatura della drosofila. Ciò si ottiene preparando prima le mosche e l'apparato, che è assemblato attorno a una base di alluminio a temperatura controllata. Una volta stabilite le temperature nell'apparato, viene caricata una coorte di mosche e dopo mezz'ora viene valutata la loro preferenza di temperatura.

In definitiva, il test può essere utilizzato con una grande varietà di condizioni sperimentali. Ad esempio, i ritmi circadiani della preferenza di temperatura. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo dei ritmi target.

Poiché i ritmi target di preferenza della temperatura sono controllati da meccanismi diversi da quelli dell'attività locomotiva, questo saggio di comportamento porterà all'identificazione di nuovi meccanismi molecolari e cellulari che non erano stati precedentemente identificati utilizzando approcci di attività locomotiva. Questo metodo può anche aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze sensoriali, come la temperatura e la sensazione di dolore. Poiché questi saggi comportamentali della temperatura sono molto robusti, questo test ci consentirà di mappare il circuito neurale dal rilevamento della temperatura all'elaborazione, il che ci consentirà di comprendere meglio l'integrazione sensoriale.

Allevare le mosche in incubatrici umidificate con un ciclo di buio chiaro 1212. Questo protocollo richiede due incubatori di questo tipo impostati su orari opposti. L'incubatrice notturna dovrebbe essere buia durante il normale orario di lavoro.

Quando si accede a un'incubatrice durante il suo ciclo notturno, utilizzare la luce rossa per illuminare l'incubatrice. Raccogli coorti di 20-30 mosche appena nate di entrambi i sessi e, in qualsiasi rapporto, tienile nella loro incubatrice per due o tre giorni prima di farle passare al test. Sono necessarie almeno cinque coorti per ogni condizione testata.

Per costruire una camera di prova per le preferenze di temperatura, è necessario progettare una copertura in plexiglass che si adatti a una piastra di alluminio sotto la piastra. Posiziona quattro dispositivi Peltier. Ciascuno dei dispositivi peltier deve essere collegato ai regolatori di temperatura in grado di generare temperature fredde o calde per evitare il surriscaldamento dei pelter.

Un sistema di raffreddamento del computer è collegato a tubi dell'acqua, ventole di raffreddamento dell'aria e alimentatori per monitorare le temperature sulla piastra di alluminio. Le sonde di temperatura sono incorporate nel bordo della piastra di alluminio e sono collegate ai regolatori di temperatura. Impostare i lati freddo e caldo del piatto rispettivamente a 12 e 36 gradi Celsius nel coperchio.

Collegare sei sonde di temperatura in varie posizioni all'interno di una delle corsie. Collocare l'apparecchio in una stanza a temperatura controllata dal punto di vista ambientale a 25 gradi Celsius e tra il 65 e il 75% di umidità relativa. Assicurati di monitorare queste condizioni.

La stanza deve avere un controllo della luce e una buona circolazione dell'aria per evitare che l'aria circolante destabilizzi la temperatura. Schermare l'area di test con una tenda da doccia. È necessario utilizzare una luce uniforme sull'apparecchio perché la luminosità può influenzare la preferenza di temperatura.

Accendere l'apparecchio per almeno 30 minuti. Al fine di stabilire un gradiente di temperatura stabile sulla superficie della piastra. Rivestire la copertura dell'apparato comportamentale con un idrorepellente per evitare che le mosche si arrampichino sulle pareti o sul soffitto della copertura.

Rimuovere l'idrorepellente in eccesso e lasciare il coperchio in movimento per 25-30 minuti, se necessario, il nastro biadesivo può essere utilizzato mezz'ora dopo. Rimuovere la condensa dalla piastra di alluminio. Quindi posizionare la copertura in plexiglass sulla piastra di alluminio e fissarla con sei morsetti a C.

È molto importante che il coperchio sia sigillato. Monitorare bene la temperatura dell'aria tra la piastra e il coperchio. Assicurarsi che le sonde non tocchino né la piastra in alluminio né il coperchio in plexiglass.

Lasciate riposare il coperchio sul piatto per almeno 15 minuti. Alla fine, il gradiente di temperatura dell'aria tra la piastra di alluminio e il coperchio varierà da 18 a 32 gradi Celsius Nel caso di un esperimento comportamentale diurno, estrarre le fiale di mosca dall'incubatrice diurna e testare il test comportamentale alla luce immediatamente prima di un esperimento comportamentale notturno. Togli le fiale di mosca dall'incubatrice notturna.

Avvolgili in un foglio di alluminio e mettili in una scatola nella stanza buia sotto una lampada rossa. Per gli esperimenti durante i periodi di buio, le luci della stanza devono rimanere sempre spente fino al termine degli esperimenti comportamentali. Tuttavia, le lampade rosse possono essere utilizzate per l'illuminazione mediante aspirazione.

Caricare da 20 a 25 mosche nello spazio tra la piastra di alluminio. Quindi copri i fori con vetrini coprioggetti per evitare che le mosche fuoriescano. Lasciare che le mosche si muovano per 30 minuti.

Quando l'esperimento è completato, scatta almeno due foto per gli esperimenti di luce. Un flash deve essere utilizzato per gli esperimenti oscuri. Controllare la temperatura dell'apparecchio.

Prendere nota della temperatura ambiente e dell'umidità per rimuovere le mosche collegato tubo di anidride carbonica vicino al foro sulla parte superiore dell'apparecchio per anestetizzare le mosche, scartare le mosche. Non dovrebbero essere ritestati. Quindi, rimuovere la condensa o l'umidità dalla piastra.

Riposizionare il coperchio sulla piastra e serrare con i morsetti in preparazione Per il prossimo esperimento, calcolare il gradiente di temperatura come segue. Innanzitutto, determina dove sono posizionate le sonde di temperatura utilizzando un righello in base alle posizioni delle sonde e alle loro temperature registrate. Disegna linee rette che rappresentano ogni grado di temperatura nella posizione appropriata sulla foto della posizione finale della mosca.

Quindi conta il numero di mosche tra ogni intervallo di un grado Celsius. Escludere eventuali mosche sulle pareti o sul soffitto della copertura. Calcola la percentuale di mosche in ogni intervallo di temperatura di ciascuna corsia e quindi la temperatura media preferita per ciascuna condizione.

Raccogliere dati da almeno cinque studi. Quindi utilizzare i valori medi di ogni prova per determinare la temperatura media preferita con errori. Le mosche normali sollevate a 25 gradi Celsius, preferiscono una temperatura più bassa al mattino rispetto alla sera.

Durante il giorno è stato misurato un aumento da uno a 1,5 gradi della preferenza di temperatura e da 1,5 a due gradi Celsius. La diminuzione è stata osservata nel passaggio dal giorno alla notte. Il test può essere utilizzato anche per testare le mosche mutanti.

Ad esempio, è stato riscontrato che la preferenza di temperatura dei moscerini portatori di una mutazione difettosa nel viaggio, un canale ionico è superiore a quella dei controlli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il test del comportamento delle preferenze di temperatura. Questo metodo consente di studiare i meccanismi molecolari e i circuiti neuronali, gli orologi e gli orologi, e come il cervello integri i diversi segnali ambientali e negli orologi biologici.