Name: Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare lattività citotossica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Impara a misurare l'attività citotossica di cellule T CD8+ antigen-specifiche mediante citometria a flusso cellulare. Questo saggio utilizza cellule target primarie autologhe per una valutazione fisiologicamente rilevante della citotossicità.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Ufficio del Turismo, del Commercio e dello Sviluppo Economico della Florida.

1. Preparazione delle cellule T CD8+ effettrici
<ol>
	<li>Scongelare le PBMC crioconservate autologhe (2-3 fiale da 50 x 106 cellule) trasferendo il crioviale dall'azoto liquido a un bagno d'acqua a 37 °C.</li>
	<li>Lavare le cellule riempiendo la provetta fino a 50 ml con RPMI completo (4 mM di L-glutammina e 100 U/ml di penicillina e streptomicina, integrati con il 10% di FBS). Contare le PBMC e risospendere le cellule a una concentrazione di 5 x 106/ml in RPMI completo.</li>
	<li>Aggiungere peptide specifico (5 μg/ml) e IL-2 (10 ng/ml) alle PBMC.</li>
	<li>Preparazione della coltura in una piastra a 96 pozzetti; seminare 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Dopo 3 giorni di coltura, sostituire metà del terreno di coltura cellulare con un RPMI completo fresco.</li>
	<li>Dopo 6 giorni di coltura, raccogliere tutte le PBMC con pipetta multicanale e trasferire le cellule in un serbatoio sterile.</li>
	<li>Contare, lavare e risospendere le PBMC a 5 x 107/ml nel tampone di separazione raccomandato in provette a fondo tondo da 14 ml. Aggiungere un cocktail di arricchimento di cellule T CD8+ umane a 50 μl/ml di cellule. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Aggiungere particelle magnetiche a 150 μl/ml e incubare per 5 minuti.</li>
	<li>Portare la sospensione cellulare fino a 7 ml aggiungendo il tampone di separazione. Procedere all'isolamento immunomagnetico di una cellula T CD8+ non toccata inserendo la provetta nel magnete. Dopo 5 minuti, con la provetta ancora nel magnete, versare le cellule di interesse in una nuova provetta conica da 15 ml. Prelevare una piccola aliquota e colorare le cellule con anticorpi contro CD3 e CD8 in 1X PBS-2% FBS per 30 minuti a 4 °C. La purezza delle cellule T CD8+ può quindi essere misurata tramite citometria a flusso con una purezza prevista del 95% o superiore.</li>
	<li>Risospendere le cellule T CD8+ in 450 μl con RPMI completo.</li>
	<li>Aggiungere 225 μl di RPMI completo in 5 provette con tappo a vite.</li>
	<li>Preparare diluizioni seriali (da 1:2 a 1:32) trasferendo 225 μl di CD8+ nella provetta successiva (vedere il pannello superiore della Figura 1).</li>
</ol>
2. Preparazione delle cellule T CD4+ target
<ol>
	<li>Scongelare le PBMC crioconservate autologhe (1 fiala da 50 x 106 cellule) trasferendo la crioviale da azoto liquido a un bagno d'acqua a 37 °C.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 ml contenente 10 ml di RPMI.</li>
	<li>Lavare le cellule e risospendere le PBMC a 5 x 107/ml con tampone di separazione in provette a fondo tondo da 14 ml. Aggiungere un cocktail di arricchimento di cellule T CD4+ umane a 50 μl/ml di cellule. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Aggiungere particelle magnetiche a 100 μl/ml e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Portare la sospensione cellulare fino a 7 ml aggiungendo un tampone di separazione. Procedere all'isolamento delle cellule T CD4+ inserendo la provetta nel magnete. Dopo 5 minuti, con la provetta ancora all'interno del magnete, versare le cellule desiderate in una nuova provetta conica da 15 ml. Prelevare una piccola aliquota e colorare le cellule con anticorpi contro CD3 e CD4 in 1x PBS-2% FBS per 30 minuti a 4 °C. La purezza delle cellule T CD4+ può quindi essere misurata tramite citometria a flusso con una purezza prevista del 95% o superiore.</li>
	<li>Contare le cellule T CD4+, dividerle in due provette coniche da 15 ml e lavarle in 1x PBS caldo.</li>
	<li>Preparare una soluzione di lavoro ad alto CFSE da 0,4 μM in PBS caldo.</li>
	<li>Preparare una soluzione di lavoro a basso contenuto di CFSE da 0,04 μM diluendo una parte della soluzione ad alto tenore di lavoro CFSE 10x in PBS caldo.</li>
	<li>Risospendere le cellule a 20 x 10,6/ml di PBS (se il numero di cellule T CD4+ è inferiore a 10 x 10,6/ml risospendere le cellule in 0,5 ml di PBS) e colorare metà delle cellule T CD4+ aggiungendo un volume uguale di soluzione di lavoro ad alto CFSE da 0,4 μM (concentrazione finale 0,2 μM). Ad esempio, per 1 ml di cellule, aggiungere 1 ml della soluzione di lavoro CFSE. Colorare la metà rimanente del CD4+ aggiungendo un volume uguale di 0,04 μM di soluzione di lavoro a basso contenuto di CFSE (concentrazione finale 0,02 μM). Colorare le celle per 15 minuti a 37 °C in atmosfera al 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, pellettare le celle a 1.500 giri/min per 5 minuti e risospendere in 1 ml di RPMI completo caldo per spegnere la reazione di marcatura.</li>
	<li>Pulsare le cellule T CD4+ CFSE-low aggiungendo il peptide di interesse a una concentrazione finale di 5 μg/ml nell'RPMI completo e incubare per 45 minuti in atmosfera di CO2 al 5% a 37 °C.</li>
	<li>Lavare le cellule T CD4+ CFSE-high e CFSE-low in RPMI completo. Ripetere per un totale di due lavaggi. Risospendere a una concentrazione di 2 x 105 cellule/ml ciascuna in RPMI completo.</li>
	<li>Mescolare le due popolazioni target con un rapporto di 1:1 (CFSE-High:CFSE-Low) (vedere la Figura 1 nel pannello inferiore).</li>
</ol>
3. Cocultura
<ol>
	<li>Da ogni diluizione di cellule T CD8+, seminare 100 μl in duplicato su piastra a 96 pozzetti a fondo tondo.</li>
	<li>Aggiungere le cellule T CD4+ target misti (100 μl) a ciascuna diluizione di cellule effettrici per un volume finale di 200 μl.</li>
	<li>Per misurare l'apoptosi basale, seminare 3 pozzetti con le sole cellule bersaglio.</li>
	<li>Incubare la cocoltura per 6 ore in atmosfera di CO2 al 5% a 37 °C.</li>
</ol>
4. Colorazione e acquisizione della citometria a flusso
<ol>
	<li>Trasferire le cellule su una piastra a 96 pozzetti con fondo a V e colorarle con tetrameri pMHC coniugati in PE per 15 minuti in atmosfera di CO2 al 5% a 37 °C.</li>
	<li>Lavare in 1x PBS-2% FBS e colorare le cellule con Far Red LIVE/DEAD fixable dead cell, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 per 30 minuti a 4 °C, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Lavare le celle una volta con 1x PBS-2% FBS e risospendere in 100 μl con formaldeide al 2% in 1x PBS.</li>
	<li>Acquisire le cellule sul citometro a flusso.</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il test qui descritto consente di quantificare la funzione principale delle cellule T CD8+: l'attività citolitica. La misurazione accurata di questa funzione è di fondamentale importanza quando si caratterizzano le funzioni effettrici delle cellule T CD8+, poiché studi precedenti hanno riportato una discordanza tra questa funzione e la secrezione di citochine delle cellule T CD8+ antigene-specifiche10,11. A causa del breve tempo di incubazione in cocoltura (6 ore) e dell'uso di cellule bersaglio autologhe, c'è...

L'attività citolitica è la funzione principale delle cellule T CD8+, ma è ancora raramente misurata poiché i saggi utilizzati per questo scopo sono ingombranti e difficili da standardizzare. La misurazione accurata di questa funzione è di fondamentale importanza quando si caratterizzano le funzioni effettrici delle cellule T CD8+, poiché non sono stati ancora descritti predittori affidabili di un'efficace citotossicità cellulo-mediata1,2. Qui, proponiamo un nuovo test funzionale per misurare l'attività citotossica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche su cellule T CD4+ bersaglio. Sono stati sviluppati diversi approcci per fornire alternative al gold standard, il saggio di rilascio del cromo. Presentiamo qui un saggio basato su cellule che rivela l'intero processo di uccisione mentre misura la morte delle cellule bersaglio vive. Questo metodo è stato derivato da protocolli di saggi citotossici basati sulla citometria a flusso in vivo nei topi4,5 e in vitro nell'uomo6. In questo protocollo, le cellule T CD8+ antigene-specifiche contenute nella popolazione totale di cellule T CD8+ vengono utilizzate come cellule effettrici e le cellule T CD4+ autologhe vengono utilizzate come cellule bersaglio. Le cellule T effettrici CD8+ di interesse sono enumerate utilizzando MHCI/tetrameri peptidici7. La morte delle cellule bersaglio è calcolata dal rapporto tra le cellule T CD4+ caricate e non caricate con peptidi. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo metodo era riproducibile, sensibile, specifico e non dipendeva dal numero di cellule effettrici all'interno della popolazione totale di cellule T CD8+8. Enumerando sia il numero di cellule effettrici che quelle bersaglio nel saggio di cocoltura, la capacità intrinseca delle cellule T CD8+ di uccidere le cellule bersaglio può essere calcolata ed espressa in unità litiche9.

<table><tbody><tr><td>Kit per l'arricchimento delle cellule T CD4+ umane EasySep</td><td>Cellule staminali</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Kit per l'arricchimento delle cellule T CD8+ umane EasySep</td><td>Cellule staminali</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>Kit per la proliferazione cellulare CellTrace CFSE - Per citometria a flusso</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Cellule morte riparabili Far Red LIVE/DEAD</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Topo Anti-umano CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Anticorpo CD4 Anti-Umano</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP Anticorpo CD8 Anti-Umano</td><td>Biolegend</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina 100x Soluzione</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino - Oro, PAA inattivato al calore</td><td></td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti; Curato; fondo a U; con coperchio</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml di polistirene sterile, serbatoi confezionati singolarmente</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti con fondo a U, sterili 2 ml piastre profonde</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126), per la ricerca</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Buffer, tampone di separazione</td><td>Cellule</td> <td>staminali20104</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica in polipropilene da 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Provetta a fondo tondo da 14 ml, polipropilene</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep Magnet</td><td>Stem cell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>a 96 pozzetti; Piastra con fondo a V con coperchio</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide, reagente ACS, 37 % in peso in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microprovetta con tappo a vite da 1,5 ml, conica</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

L'attività citolitica delle cellule T CD8+ viene valutata raramente. Descriviamo qui un nuovo test basato su cellule per misurare la capacità delle cellule T CD8+ antigene-specifiche di uccidere le cellule T CD4+ caricate con il loro peptide affine. Le cellule T CD4+ bersaglio sono divise in due popolazioni, marcate con due diverse concentrazioni di CFSE. Una popolazione è pulsata con il peptide di interesse (CFSE-low) mentre l'altra rimane non pulsata (CFSE-high). Le cellule T CD4+ pulsate e non pulsate vengono miscelate in un rapporto uguale e incubate con un numero crescente di cellule T CD8+ purificate. L'uccisione specifica delle cellule T CD4+ bersaglio autologhe viene analizzata mediante citometria a flusso dopo cocoltura con cellule T CD8+ contenenti le cellule T effettrici CD8+ antigene-specifiche rilevate mediante colorazione con peptide/tetramero MHCI. La lisi specifica delle cellule T CD4+ bersaglio, misurata a diversi rapporti effettori rispetto a quelli bersaglio, consente il calcolo di unità litiche, LU30/106 cellule. Questo test semplice e diretto consente di misurare con precisione la capacità intrinseca delle cellule T CD8+ di uccidere le cellule T CD4+ bersaglio.

Lo schema in Figura 1 riassume il saggio. I linfociti T CD8+ purificati (cellule effettrici) sono stati sospesi in 450 µl di RPMI completo ed è stata eseguita una diluizione seriale aggiungendo 225 µl di cellule T CD8+ al tubo successivo contenente 225 µl di mezzo (pannello superiore). I linfociti T CD4+ purificati (cellule bersaglio) sono stati contati, suddivisi in due tubi e marcati con due diverse concentrazioni di CFSE (alta e bassa), come descritto nel protocollo. Le cellule T CD4+ con bassa intens...

Questo protocollo descrive un sensibile test di citotossicità basato su cellule. Enumerando la diminuzione della frequenza delle cellule T CD4+ bersaglio vive in presenza di un numero crescente di cellule T CD8+ effettrici, questo test consente la valutazione diretta dell'attività citolitica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche.

Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività citotossica delle cellule T CD8 specifiche per l'antigene mediante un saggio basato su citometria a flusso cellulare. Questo viene realizzato innanzitutto espandendo le cellule T effettrici CD8 per sei giorni in presenza del peptide di interesse; nel secondo passaggio, le cellule T CD4 bersaglio vengono esposte al peptide di interesse e successivamente mescolate con cellule T CD4 non trattate. Successivamente, le cellule T effettrici CD8 e le cellule T bersaglio CD4 vengono coltivate in co-coltura per sei ore a diversi rapporti effettore:bacino.Nell'ultimo passaggio, l'uccisione delle cellule T CD4 caricate con il peptide e il numero di cellule T CD8 effettrici vengono quantificati mediante citometria a flusso. In definitiva, può essere calcolata la capacità citotossica intrinseca delle cellule T CD8 specifiche per l'antigene, espressa in unità litiche. I principali vantaggi di questa tecnica, simile al saggio di rilascio di aro, consistono nell'utilizzo di cellule bersaglio primarie autologhe anziché di linee cellulari immortalizzate e nella presenza della vera cellula bersaglio.Questo e il numero di cellule effettrici sono quantificabili a livello di singola cellula. In questa fase, un assistente di ricerca del mio laboratorio dimostrerà la procedura per isolare le cellule effettrici positive per CD8. Iniziare scongelando i PBMC autologhi criopreservati in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, quindi lavare le cellule con fino a 50 millilitri di mezzo completo.Dopo il conteggio, diluire i PBMC a una concentrazione di 5 milioni di cellule per millilitro in terreno completo, quindi aggiungere all'ambiente di coltura l'IL-2 e il peptide di interesse. Successivamente, seminare un millilitro di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Dopo tre giorni di coltura, sostituire metà del sopranatante con terreno completo fresco. Dopo sei giorni di coltura, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire le cellule in un serbatoio sterile, quindi contare e lavare le cellule.Risospendere il pellet a 50 milioni di cellule per millilitro in un buffer di separazione e incubare i PBMC in un tubo rotondo da 14 millilitri con un cocktail di arricchimento per linfociti T positivi per CD8 umano a 50 microlitri per millilitro di cellule a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, incubare le cellule con particelle magnetiche coniugate con anti-CD8 IgG a 150 microlitri per millilitro per altri cinque minuti, quindi portare il sospensione cellulare a sette millilitri aggiungendo ulteriore buffer di separazione. Posizionare il tubo nel magnete di separazione; dopo cinque minuti, con il tubo ancora nel magnete, versare le cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, colorare un piccolo aliquota delle cellule con anticorpi contro CD3 e CD8 in PBS integrato con FBS al 2% per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Confermare che la purezza delle cellule sia del 95% CD8 positivo o superiore mediante citometria a flusso. Aggiungere ora 225 microlitri di terreno completo in cinque tubi con tappo a vite, quindi diluire in modo seriale le cellule da 1:2 a 1:32. Per isolare le cellule bersaglio CD4 positive, iniziare scongelando i PBMC autologhi criopreservati in un bagno a 37 °C.Trasferire le cellule scongelate in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo. Arricchire per le cellule T esprimenti CD4 mediante separazione con particelle magnetiche come appena dimostrato, confermando una purezza del 95% o superiore di cellule T positive per CD4 mediante citometria a flusso. Dopo aver contato le cellule, suddividerle in due tubi conici da 15 millilitri e quindi lavarle in PBS tiepido, ri-sospendendo i pellet a 20 milioni di cellule per millilitro in PBS.Dopo aver assicurato che le cellule siano protette dalla luce, colorare una metà delle cellule T CD4 positive con una soluzione lavorativa frescamente preparata di CFSE ad alta concentrazione, fino a una concentrazione finale di 0,2 millimolare, e l'altra metà con una soluzione lavorativa frescamente preparata di CFSE a bassa concentrazione, fino a una concentrazione finale di 0,04 millimolare, per 15 minuti a 37 gradi Celsius in 5% CO2. Al termine del periodo di colorazione, centrifugare le cellule e risospendere i pellet in un millilitro di mezzo completo tiepido per bloccare la reazione di marcatura. Stimolare le cellule T CD4 positive marcate con CFSE a bassa concentrazione con una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro del peptide di interesse in mezzo completo per 45 minuti nell'incubatore per colture cellulari.Dopo l'incubazione, lavare sia la popolazione di linfociti T CFSC ad alta intensità che quella a bassa intensità. Lavare due volte con mezzo incompleto e risospendere entrambe le sospensioni cellulari a 200.000 cellule per millilitro in mezzo incompleto. Successivamente, mescolare le due popolazioni bersaglio in un rapporto uno a uno tra CFSE ad alta intensità e CFSE a bassa intensità.Ora aggiungere 100 microlitri della miscela di cellule T CD4 positive bersaglio in ciascun pozzetto di una piastra 96 pozzetti a fondo tondo, quindi seminare 1 microlitro di ciascuna sospensione di cellule T CD8 positive in duplicato, per un volume finale di 200 microlitri per pozzetto. Misurare l'apoptosi basale seminando tre pozzetti con sole cellule bersaglio, quindi incubare la coltura in co-coltura per sei ore nell'incubatrice per colture cellulari. Al termine dell'incubazione, trasferire le cellule in una piastra VBO 96 pozzetti e colorare ciascun pozzetto con tetramer PE coniugati peptidi-MHC per 15 minuti.Nell'incubatore per colture cellulari, lavare le cellule con PBS integrato con FBS al 2% e quindi colorare le cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius, protetto dalla luce dopo il lavaggio. Successivamente, risospendere nuovamente i pellet in 100 microlitri di formaldeide al 2% in PBS e analizzare le cellule mediante citometria a flusso. Dopo la co-coltura, le cellule vengono analizzate e selezionate come mostrato in questi diagrammi a dispersione.Il rapporto tra cellule bersaglio vitali CFSE high e cellule bersaglio CFSE low, non presentate o caricate con peptide, viene analizzato a partire da un piccolo gate in avanti rispetto allo scatter laterale; le cellule vive vengono selezionate escludendo le cellule morte e le cellule T CD4 positive, quindi vengono riportate in funzione di CFSE per analizzare il rapporto tra cellule CFSE low e CFSE high. Successivamente, viene creato un gate più ampio in avanti rispetto allo scatter laterale per enumerare il numero totale di cellule effettrici e bersaglio, vive o morte. Dopo l'incubazione di sei ore, le cellule T CD8 positive e tetramero positive e le cellule T CD4 positive CFSE low vengono riportate graficamente per analizzare il rapporto tra cellule effettrici e cellule bersaglio.Il numero totale di cellule T effettrici CD8 positive viene quindi determinato selezionando le cellule positive per il tetramero e CD8 positive. Il numero totale di cellule bersaglio viene determinato selezionando le cellule T CD4 positive, CFSE basso e le cellule positive e negative per il marcatore di vitalità. Il rapporto bersaglio tra cellule CFSE basso e cellule CFSE alto è uno a uno.Quando le cellule bersaglio CD4 positive vengono coltivate in assenza di cellule effettrici, questo rapporto diminuisce drasticamente. Quando le cellule pulsate CFSE low positive vengono incubate con la popolazione totale di linfociti T CD8 positivi contenente linfociti T effettrici CD8 positivi specifici per l'antigene.Al diminuire del rapporto, le cellule bersaglio CD4 positive a fluorescenza CFSE bassa iniziano a diventare positive al marcatore vivo/morto. La diluizione delle cellule effettrici comporta quindi un ripristino del rapporto CFSE e, in ultima analisi, un recupero del numero di cellule T bersaglio CD4 positive a fluorescenza CFSE bassa vitali. La percentuale di lisi specifica può quindi essere riportata in funzione del rapporto effettori/bersagli su scala logaritmica. Come mostrato nel grafico, si calcola una regressione lineare a partire dal grafico, e l'equazione della retta di tendenza viene utilizzata per determinare le unità litiche.Questo è il numero di linfociti T effettori CD8 positivi necessari per uccidere il 30% di un milione di linfociti T bersaglio CD4 positivi, al fine di determinare la capacità citolitica intrinseca dei linfociti T CD8 positivi specifici per l'antigene e di confrontare i risultati tra diversi donatori. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come utilizzare la citometria per misurare l'attività citotossica dei linfociti T CD specifici per l'antigene. Questa tecnica può essere facilmente adattata anche per il proprio tipo di cellule T.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Test di citometria a flusso basato su cellule per misurare l'attività citotossica

Questo video dimostra una tecnica in vitro per misurare la capacità citotossica delle cellule killer indotte da citochine (CIK) contro le cellule tumorali. Dopo la co-coltura di cellule tumorali bersaglio con cellule CIK, le cellule tumorali morte vengono identificate utilizzando un colorante fluorescente di vitalità e vengono quantificate utilizzando la citometria a flusso, stimando l'effetto citotossico delle cellule CIK.

Un test in vitro per studiare la capacità citotossica delle cellule killer indotte da citochine

Questo video dimostra l'attività litica delle cellule natural killer contro le cellule bersaglio colorate in modo fluorescente. Il metodo consente la misurazione della citotossicità indotta dalle cellule NK colorando le cellule morte e utilizzando un citometro a flusso per quantificare le cellule bersaglio vive e morte.

Preparazione del campione per il saggio di citotossicità cellulo-mediata Natural Killer per l'analisi citofluorimetrica

Questo video mostra un test di apoptosi in cellule tumorali indotta da cellule T effettrici pre-attivate. Co-coltivando queste cellule con cellule tumorali marcate con nuclei fluorescenti, viene aggiunto un substrato fluorogenico scissibile della caspasi. Le cellule tumorali apoptotiche mostreranno un colore diverso nei loro nuclei, portando alla doppia fluorescenza. Questa doppia fluorescenza è indicativa di cellule tumorali in fase di apoptosi.

Un test in vitro per studiare la citotossicità delle cellule T CD8+ pre-attivate contro le cellule tumorali

Descriviamo una singola cellula saggio ad alta prestazione per misurare la citotossicità delle cellule T quando incubati con cellule tumorali bersaglio. Questo metodo impiega una densa matrice elastomerica di sub-nanolitri pozzetti (~ 100.000 pozzetti / matrice) per confinare spazialmente le cellule T e le cellule bersaglio con rapporti definiti ed è accoppiato al microscopio a fluorescenza per monitorare effettore-bersaglio coniugazione e apoptosi successiva.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

L'intero test di citotossicità sangue (WCA) è un test di citotossicità sviluppato incorporando high-throughput tecnologia di posizionamento delle cellule con un microscopio a fluorescenza e l'elaborazione automatizzata delle immagini. Qui, descriviamo come cellule di linfoma trattati con un anticorpo anti-CD20 possono essere analizzati in tempo reale nel sangue intero umano per fornire un'analisi quantitativa citotossicità cellulare.

In tempo reale citotossicità saggi in Human Sangue intero

Un metodo semplice ed affidabile è descritto qui di analizzare un insieme di funzioni delle cellule NK come degranulazione, citochine e chemochine ai differenti sottopopolazioni di cellule NK.

Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

Questo lavoro descrive un flusso di lavoro avanzato per la determinazione accurata e rapida della conta delle cellule NK (Natural Killer) e della citotossicità delle cellule NK in campioni di sangue umano.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l'attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Qui, descriviamo un metodo per creare goccioline a doppia emulsione che incapsulano una cellula T e una cellula bersaglio del cancro per esaminare l'uccisione cellulare a livello di singola cellula. Questo metodo consente la doppia quantificazione sia delle molecole citotossiche che dell'apoptosi delle cellule bersaglio all'interno di un'ampia popolazione di cellule T.

Saggio di citotossicità basato su goccioline per valutare le cellule T del recettore dell'antigene chimerico a livello di singola cellula

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro in vitro standardizzato per la misurazione coerente della citotossicità naturale, mediata dai recettori degli antigeni chimerici e dipendente dagli anticorpi delle cellule naturali umane, utilizzando imaging a cellule vive e citometria di flusso.

Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Impara a misurare l'attività citotossica di cellule T CD8+ antigen-specifiche mediante citometria a flusso cellulare. Questo saggio utilizza cellule target primarie autologhe per una valutazione fisiologicamente rilevante della citotossicità.

Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

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