Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività citotossica delle cellule T CD8 specifiche per l'antigene mediante un saggio basato su citometria a flusso cellulare. Questo viene realizzato innanzitutto espandendo le cellule T effettrici CD8 per sei giorni in presenza del peptide di interesse; nel secondo passaggio, le cellule T CD4 bersaglio vengono esposte al peptide di interesse e successivamente mescolate con cellule T CD4 non trattate. Successivamente, le cellule T effettrici CD8 e le cellule T bersaglio CD4 vengono coltivate in co-coltura per sei ore a diversi rapporti effettore:bacino.

Nell'ultimo passaggio, l'uccisione delle cellule T CD4 caricate con il peptide e il numero di cellule T CD8 effettrici vengono quantificati mediante citometria a flusso. In definitiva, può essere calcolata la capacità citotossica intrinseca delle cellule T CD8 specifiche per l'antigene, espressa in unità litiche. I principali vantaggi di questa tecnica, simile al saggio di rilascio di aro, consistono nell'utilizzo di cellule bersaglio primarie autologhe anziché di linee cellulari immortalizzate e nella presenza della vera cellula bersaglio.

Questo e il numero di cellule effettrici sono quantificabili a livello di singola cellula. In questa fase, un assistente di ricerca del mio laboratorio dimostrerà la procedura per isolare le cellule effettrici positive per CD8. Iniziare scongelando i PBMC autologhi criopreservati in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, quindi lavare le cellule con fino a 50 millilitri di mezzo completo.

Dopo il conteggio, diluire i PBMC a una concentrazione di 5 milioni di cellule per millilitro in terreno completo, quindi aggiungere all'ambiente di coltura l'IL-2 e il peptide di interesse. Successivamente, seminare un millilitro di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Dopo tre giorni di coltura, sostituire metà del sopranatante con terreno completo fresco. Dopo sei giorni di coltura, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire le cellule in un serbatoio sterile, quindi contare e lavare le cellule.

Risospendere il pellet a 50 milioni di cellule per millilitro in un buffer di separazione e incubare i PBMC in un tubo rotondo da 14 millilitri con un cocktail di arricchimento per linfociti T positivi per CD8 umano a 50 microlitri per millilitro di cellule a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, incubare le cellule con particelle magnetiche coniugate con anti-CD8 IgG a 150 microlitri per millilitro per altri cinque minuti, quindi portare il sospensione cellulare a sette millilitri aggiungendo ulteriore buffer di separazione. Posizionare il tubo nel magnete di separazione; dopo cinque minuti, con il tubo ancora nel magnete, versare le cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, colorare un piccolo aliquota delle cellule con anticorpi contro CD3 e CD8 in PBS integrato con FBS al 2% per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Confermare che la purezza delle cellule sia del 95% CD8 positivo o superiore mediante citometria a flusso. Aggiungere ora 225 microlitri di terreno completo in cinque tubi con tappo a vite, quindi diluire in modo seriale le cellule da 1:2 a 1:32. Per isolare le cellule bersaglio CD4 positive, iniziare scongelando i PBMC autologhi criopreservati in un bagno a 37 °C.

Trasferire le cellule scongelate in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo. Arricchire per le cellule T esprimenti CD4 mediante separazione con particelle magnetiche come appena dimostrato, confermando una purezza del 95% o superiore di cellule T positive per CD4 mediante citometria a flusso. Dopo aver contato le cellule, suddividerle in due tubi conici da 15 millilitri e quindi lavarle in PBS tiepido, ri-sospendendo i pellet a 20 milioni di cellule per millilitro in PBS.

Dopo aver assicurato che le cellule siano protette dalla luce, colorare una metà delle cellule T CD4 positive con una soluzione lavorativa frescamente preparata di CFSE ad alta concentrazione, fino a una concentrazione finale di 0,2 millimolare, e l'altra metà con una soluzione lavorativa frescamente preparata di CFSE a bassa concentrazione, fino a una concentrazione finale di 0,04 millimolare, per 15 minuti a 37 gradi Celsius in 5% CO2. Al termine del periodo di colorazione, centrifugare le cellule e risospendere i pellet in un millilitro di mezzo completo tiepido per bloccare la reazione di marcatura. Stimolare le cellule T CD4 positive marcate con CFSE a bassa concentrazione con una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro del peptide di interesse in mezzo completo per 45 minuti nell'incubatore per colture cellulari.

Dopo l'incubazione, lavare sia la popolazione di linfociti T CFSC ad alta intensità che quella a bassa intensità. Lavare due volte con mezzo incompleto e risospendere entrambe le sospensioni cellulari a 200.000 cellule per millilitro in mezzo incompleto. Successivamente, mescolare le due popolazioni bersaglio in un rapporto uno a uno tra CFSE ad alta intensità e CFSE a bassa intensità.

Ora aggiungere 100 microlitri della miscela di cellule T CD4 positive bersaglio in ciascun pozzetto di una piastra 96 pozzetti a fondo tondo, quindi seminare 1 microlitro di ciascuna sospensione di cellule T CD8 positive in duplicato, per un volume finale di 200 microlitri per pozzetto. Misurare l'apoptosi basale seminando tre pozzetti con sole cellule bersaglio, quindi incubare la coltura in co-coltura per sei ore nell'incubatrice per colture cellulari. Al termine dell'incubazione, trasferire le cellule in una piastra VBO 96 pozzetti e colorare ciascun pozzetto con tetramer PE coniugati peptidi-MHC per 15 minuti.

Nell'incubatore per colture cellulari, lavare le cellule con PBS integrato con FBS al 2% e quindi colorare le cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius, protetto dalla luce dopo il lavaggio. Successivamente, risospendere nuovamente i pellet in 100 microlitri di formaldeide al 2% in PBS e analizzare le cellule mediante citometria a flusso. Dopo la co-coltura, le cellule vengono analizzate e selezionate come mostrato in questi diagrammi a dispersione.

Il rapporto tra cellule bersaglio vitali CFSE high e cellule bersaglio CFSE low, non presentate o caricate con peptide, viene analizzato a partire da un piccolo gate in avanti rispetto allo scatter laterale; le cellule vive vengono selezionate escludendo le cellule morte e le cellule T CD4 positive, quindi vengono riportate in funzione di CFSE per analizzare il rapporto tra cellule CFSE low e CFSE high. Successivamente, viene creato un gate più ampio in avanti rispetto allo scatter laterale per enumerare il numero totale di cellule effettrici e bersaglio, vive o morte. Dopo l'incubazione di sei ore, le cellule T CD8 positive e tetramero positive e le cellule T CD4 positive CFSE low vengono riportate graficamente per analizzare il rapporto tra cellule effettrici e cellule bersaglio.

Il numero totale di cellule T effettrici CD8 positive viene quindi determinato selezionando le cellule positive per il tetramero e CD8 positive. Il numero totale di cellule bersaglio viene determinato selezionando le cellule T CD4 positive, CFSE basso e le cellule positive e negative per il marcatore di vitalità. Il rapporto bersaglio tra cellule CFSE basso e cellule CFSE alto è uno a uno.

Quando le cellule bersaglio CD4 positive vengono coltivate in assenza di cellule effettrici, questo rapporto diminuisce drasticamente. Quando le cellule pulsate CFSE low positive vengono incubate con la popolazione totale di linfociti T CD8 positivi contenente linfociti T effettrici CD8 positivi specifici per l'antigene.

Al diminuire del rapporto, le cellule bersaglio CD4 positive a fluorescenza CFSE bassa iniziano a diventare positive al marcatore vivo/morto. La diluizione delle cellule effettrici comporta quindi un ripristino del rapporto CFSE e, in ultima analisi, un recupero del numero di cellule T bersaglio CD4 positive a fluorescenza CFSE bassa vitali. La percentuale di lisi specifica può quindi essere riportata in funzione del rapporto effettori/bersagli su scala logaritmica. Come mostrato nel grafico, si calcola una regressione lineare a partire dal grafico, e l'equazione della retta di tendenza viene utilizzata per determinare le unità litiche.

Questo è il numero di linfociti T effettori CD8 positivi necessari per uccidere il 30% di un milione di linfociti T bersaglio CD4 positivi, al fine di determinare la capacità citolitica intrinseca dei linfociti T CD8 positivi specifici per l'antigene e di confrontare i risultati tra diversi donatori. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come utilizzare la citometria per misurare l'attività citotossica dei linfociti T CD specifici per l'antigene. Questa tecnica può essere facilmente adattata anche per il proprio tipo di cellule T.