Name: Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Scopri i processi subcellulari coinvolti nella riparazione della membrana cellulare utilizzando marcatori fluorescenti e imaging in tempo reale. Questo metodo permette di studiare la cinetica della risposta cellulare all'infortunio.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni AR055686 e AR060836 e borsa di studio postdottorato al dC da Francese Distrofia Muscolare (AFM). L&#39;impianto di imaging cellulare utilizzato in questo studio è sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HD040677.

1. Imaging Membrana cellulare Repair Uso Bulk (perle di vetro) Ferimento Questo protocollo permette separatamente segnando le cellule danneggiate e quelli che non riescono a guarire. Quantificare queste popolazioni di cellule richiede l&#39;utilizzo di tre condizioni: 1. Test (C1) - Le cellule possono riparare in presenza di Ca 2 +, 2. Controllo 1 (senza pregiudizio C2) - Le cellule vengono incubate in presenza di Ca 2 +, ma non feriti, e 3. Control 2 (senza C3 riparazione) - le cellule sono autorizzati a riparare in assenza di Ca 2 +. <ol><li> Crescere le cellule a&gt; 50% di confluenza in tre coprioggetto sterili e lavare C1 e C2 due volte con CIM a 37 ° C e C3 con PBS a 37 ° C e di trasferimento coprioggetto su O-ring in silicone. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di destrano FITC preriscaldata in CIM su C1 e C2 o C3 in PBS su. </li><li> Ferire membrana plasmatica in C1 e C3 da dolci 40 perle mg di vetro sopra il vetrino a temperatura ambiente mediante lamelle inclinabili manualmente indietro evia 6-8 volte con un angolo di 30 °. Nota: per lesioni lievi, assicurano le perle di vetro sono distribuite in modo uniforme, riducendo così al minimo le lesioni ripetute. Per migliorare la riproducibilità del pregiudizio tra i campioni, contemporaneamente effettuare la lesione branello di vetro dei diversi campioni da confrontare. </li><li> Evitare inoltre di rotolamento di perline, trasferire tutti i vetrini di un incubatore 37 ° C a CO 2 ambiente e consentire la riparazione di procedere per 5 min. </li><li> Senza lasciare le perle rotolano, rimuovere le perline di vetro e FITC destrano mediante lavaggio con CIM (C1 e C2) o PBS (C3) a 37 ° C. </li><li> Luogo coprioggetto torna sul ring e aggiungere 100 ml di soluzione di lisina TRITC destrano risolvibile preriscaldata in CIM su C1 e C2 o in PBS su C3. </li><li> Incubare a 37 ° C per 5 min a CO 2 ambiente. </li><li> Lavare coprioggetti due volte con preriscaldata CIM e fissare con PFA 4% per 10 min a RT. </li><li> Lavare due volte con PBS e incubare per 2 min a RT in Hoechst colorante. </li><li> Wash samples due volte con PBS, montare su un vetrino utilizzando supporti di montaggio e celle di immagine utilizzando un microscopio a epifluorescenza. </li><li> Utilizzare cellule da C2 per determinare il fondo rosso e verde intensità di colorazione e utilizzare questo valore di soglia per i canali rosso e verde per tutti i campioni (C1-C3). </li><li> Punteggio numero totale di cellule che sono a) verde (infortunato e riparato) e b), rosso o entrambi rosso e verde (infortunato, ma non è riuscito a riparare) in campioni C1 e C3. </li><li> Conte&gt; 100 cellule verdi per ogni condizione ed esprimere la frazione di cellule che non sono riusciti a riparare come percentuale di tutte le cellule danneggiate (verde e rosso). </li></ol> 2. Immagini dal vivo della cinetica di membrana cellulare di riparazione Following Laser Injury <ol><li> Lavare le cellule con preriscaldata CIM e poi mettere il vetrino in CIM con la tintura FM. </li><li> Posizionare il coprioggetto in un supporto in incubatrice all&#39;inizio stadio mantenuto a 37 ° C. </li><li> Selezionare una regione della membrana cellulare 1-2 mm 2, e per irradiare &lt;; 10 msec con il laser pulsato. Attenuare la potenza laser attraverso il software al 40-50% della potenza di picco. Potenza ottimale consente pregiudizio consistente, ma non letale e questo deve essere determinato per tentativi per ogni singolo strumento e linea cellulare utilizzato. </li><li> Per monitorare la riparazione, un&#39;immagine ogni 10 secondi in epifluorescenza e chiaro, iniziando prima di pregiudizio e proseguire per 3-5 minuti dopo la lesione. Nota: Per nessun controllo la riparazione, ripetere i passaggi 2,1-2,4 con le cellule feriti in PBS contenente colorante FM. </li><li> Per quantificare la cinetica di riparazione, misurare FM cellulare colorante fluorescente e tracciare la variazione di intensità (ΔF/F0) nel corso di imaging. Questi dati devono essere in media per oltre 10 celle in ogni stato e tracciata come media o il valore della singola cella, se necessario. </li></ol> 3. Imaging Bulk (perle di vetro) Infortunio Induced lisosomiale Esocitosi Gli esempi includono seguenti cellule cresciute a&gt; 50%confluenza: 1. Test (C1) - Cellule permesso di riparare in presenza di Ca 2 +, 2. Controllo 1 (C2; Nessun danno) - Cellule né feriti né incubate con l&#39;anticorpo primario, e 3. Control 2 (C3, n riparazione) - Cellule autorizzati a riparare in assenza di Ca 2 +. <ol><li> Lavare coprioggetto C1 e C2 due volte con CIM a 37 ° C e C3 con PBS a 37 ° C e trasferirli su O-ring in silicone. </li><li> Aggiungere 100 pl di preriscaldata lisina fissabile destrano TRITC in CIM su C1 e C2 e C3 in PBS su. </li><li> Ferire membrana plasmatica su C1 e C3 come al punto 1.3. </li><li> Evitare inoltre di rotolamento di perline, trasferire tutti i vetrini di un incubatore 37 ° C a CO 2 ambiente e consentire la riparazione di procedere per 5 min. </li><li> Rimuovere le perline di vetro e TRITC destrano lavando i coprioggetti in terreno di crescita freddo, assicurando ancora nessun rotolamento delle sfere di vetro sulle cellule. </li><li> Lavare i coprioggetti due volte con mezzo di crescita freddo e trasferire gli O-ring. </li><li> Per C1 e C3, Aggiungere 100 ml di ratto anticorpo anti LAMP1 topo in mezzi di crescita complete freddo e aggiungere il freddo, terreno di coltura completo C2. </li><li> Per consentire legame dell&#39;anticorpo lamelle incubare per 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavare i coprioggetti tre volte con CIM freddo e fissare tutti i vetrini con il 4% PFA per 10 min a RT e poi risciacquare 3x con CIM. </li><li> Incubare tutte coprioggetto in 100 ml di soluzione di blocco per 15 minuti a RT </li><li> Incubare tutte coprioggetto in 100 microlitri Alexa Fluor 488 anticorpo anti ratto per 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavare due volte con PBS e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente in Hoechst. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS, montare su un vetrino utilizzando supporti di montaggio e immagine utilizzando un microscopio a epifluorescenza. </li><li> Utilizzo di immagini di cellule C2, determinare la colorazione di fondo aspecifica in rosso (TRITC destrano) e verde (Alexa Fluor 488 anticorpi) canali e usare questi valori colorazione di fondo di soglia i canali rosso e verde per tutti i campioni (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li> Utilizzare i rossi etichettati&gt; 100 cellule da C1 e C3 per misurare l&#39;intensità della colorazione LAMP1 (verde) in cellule danneggiate. Per un esperimento riuscito colorazione LAMP1 in celle da C3 sarà notevolmente inferiore rispetto alle cellule di C1. </li></ol> 4. Immagini dal vivo di Cell Membrane Injury Attivato Traffico subcellulare <ol><li> Fluorescently etichettare il vano di interesse trasfettando opportuno giornalista (es. CD63-GFP per lisosomi 8) oppure utilizzando coloranti fluorescenti 9. </li><li> Per i lisosomi etichettatura con colorante fluorescente, incubare cellule cresciute al 50% di confluenza in terreni di coltura contenente FITC-destrano </li><li> Lasciare destrano da endocitato per 2 ore (o più, se necessario per l&#39;etichettatura sufficiente endosomal con destrano dalla linea cellulare di interesse) in CO 2 incubatore. </li><li> Lavare le cellule con i media di crescita preriscaldate e incubare per 2 ore in un incubatore CO 2 per consentire a tuttiendocitosi destrano ad accumularsi nel lisosoma. </li><li> Prima di imaging, sciacquare il vetrino in preriscaldata CIM e montare in un supporto vetrino sul incubatore cima fase a 37 ° C. </li><li> Eseguire widefield (per il movimento in tutta la cellula) o TIRF (movimento alla superficie cellulare e esocitosi) immagini - le cellule che non hanno affollato FITC destrano lisosomi etichettati sono l&#39;ideale per l&#39;imaging dei movimenti e esocitosi dei singoli lisosomi. </li><li> Allineamento laser TIRF per microscopio di imaging: Usa 60X o 100X con obiettivo&gt; 1,45 NA. Impostare l&#39;angolo per incidente TIRF fascio laser usando l&#39;approccio del produttore. </li><li> Danneggiare la membrana cellulare irradiando una regione piccola (1-2 mm 2) per &lt;100 msec, con il laser pulsato a 40-50% attenuazione. </li><li> Per monitorare la risposta dei lisosomi alla cella di pregiudizio, celle di immagine a 4-6 fotogrammi / sec per almeno 2 minuti o più, a seconda delle dinamiche di esocitosi nelle cellule di interesse. </li></ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
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<li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lesioni membrana cellulare in vivo verifica a causa di una varietà di stress fisiologici e diversi approcci sperimentali sono stati sviluppati per imitare questi. Questi includono il ferimento membrana cellulare delle cellule aderenti raschiando loro fuori il piatto o da passaging attraverso uno stretto 9,10 siringa foro. Seguendo tali lesioni guariscono le cellule in sospensione e non aderire alla matrice extracellulare, come avviene normalmente nel tessuto. Altri ancora, come l&#39;uso di pori form...

Membrana cellulare mantiene l&#39;integrità delle cellule, fornendo una barriera tra la cella e l&#39;ambiente extracellulare. Uno stimolo chimico, elettrico o meccanico che supera la normale soglia fisiologica così come la presenza di agenti patogeni invasori può ogni risultato lesioni alla membrana cellulare e innescare una risposta cellulare successiva per riparare questa lesione. Per sopravvivere queste lesioni alla membrana cellulare, cellule possiedono un meccanismo efficiente per la riparazione. Questo meccanismo è dipendente dal calcio e coinvolge traffico intracellulare di proteine ​​come MG53 annexins e tra gli altri, nonché compartimenti subcellulari come endosomi, lisosomi, Golgi vescicole derivate e mitocondri alla membrana cellulare feriti 1-7. Tuttavia, i dettagli della sequenza di eventi molecolari e subcellulari coinvolti nella riparazione membrana cellula danneggiata rimane poco compresa. Risposta di riparazione del cellulare può essere segregato in un orecchioly e risposte tardive. Le prime risposte, che si verificano in pochi secondi in scala minuti di tempo, sono estremamente importante nel determinare la natura delle risposte tardive che portano alla riparazione delle cellule successo o la morte delle cellule. Analisi del punto di arrivo sulla base di analisi biochimiche e cellulari di massa hanno contribuito a stabilire il coinvolgimento di processi molecolari e cellulari di riparazione. Ma, a causa della eterogeneità e rapidità di risposta di riparazione cellulare, saggi punto finale non riescono a fornire i dati cinetici e spaziali della sequenza di eventi che portano alla riparazione. Approcci che consentono pregiudizio controllata di membrana cellulare e permettono di monitorare la riparazione della membrana cellulare e subcellulare risposte associate ad alta risoluzione spaziale e temporale sono ideali per tali studi. Qui, tali approcci sono stati presentati. Due dei protocolli descrivono approcci per monitorare le reali cinetica momento della riparazione membrana cellulare e le risposte subcellulari associati al processo di riparazione in cellule vive seguenti inj laserury. Come complemento a queste analisi basate imaging cellulare dal vivo, saggi punto finale sono anche stati descritti che forniscono una misura basata sulla popolazione per il monitoraggio riparazione delle singole cellule e le risposte subcellulari associati. Per dimostrare la loro utilità questi approcci sono stati utilizzati per monitorare il traffico e l&#39;esocitosi dei lisosomi in risposta al danno membrana cellulare.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>Utilizzato per preparare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>Utilizzato per preparare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>Destrano FITC (Lisina fissabile)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml in CIM o PBS</td></tr><tr><td>Perle di vetro</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>destrano TRITC (lisina fissabile)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml in CIM o PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 in PBS</td></tr><tr><td>FM colorante</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &; g/&micro; l in destrano CIM o PBS</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml in terreno di coltura</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 in mezzo di crescita</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 pollo anti-ratto IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 in soluzione di blocco</td></tr><tr><td>Supporti di montaggio</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Petridish con fondo in vetro</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>O-ring</td> <td>in siliconeBellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per vetrino coprioggetti</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>Utilizzato per il terreno di crescita: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td></tr><tr><td>Penicillina/Sreptomicina</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>Utilizzato per il terreno di crescita: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td></tr><tr><td>Siero di pollo</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>Il siero di pollo al 5% in CIM viene utilizzato per bloccare la soluzione durante l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>PBS (senza Ca2+ e Mg2+)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore TIRF&nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore a epifluorescenza</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione e analisi delle immagini</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Laser pulsato</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a tavolino</td><td>Tokaihit, Giappone</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging membrana cellulare pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

La capacità delle cellule danneggiate per guarire è un processo cellulare fondamentale, ma i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella guarigione delle cellule feriti sono poco conosciute. Qui saggi sono descritti per monitorare la capacità e la cinetica di guarigione delle cellule in coltura dopo la lesione localizzata. Il primo protocollo descrive un approccio basato punto di fine di valutare simultaneamente cellule riparazione della membrana capacità di centinaia di cellule. Il secondo protocollo descrive un metodo di immagini in tempo reale per monitorare la cinetica di riparazione membrana cellulare in cellule singole seguenti lesioni localizzate con un laser pulsato. Come cellule di guarigione feriti comporta tratta di specifiche proteine ​​e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione, il terzo protocollo descrive l&#39;uso di approccio basato punto finale di cui sopra per valutare uno di questi eventi traffico (esocitosi lisosomiale) in centinaia di cellule danneggiate simultaneamente e l&#39;ultimo protocollo descrive l&#39;uso di lesioni laser pulsato con micros TIRFcopia di monitorare le dinamiche dei singoli compartimenti subcellulari in cellule danneggiate ad alta risoluzione spaziale e temporale. Mentre i protocolli che seguono descrivono l&#39;uso di questi approcci per studiare il legame tra riparazione membrana cellulare e lisosomiale esocitosi in cellule muscolari coltivate, possono essere applicate come tali per qualsiasi altra cellula in coltura aderente e compartimento subcellulare di scelta.

Protocolli descritti qui per l&#39;imaging singola cellula sono di monitorare la capacità e la cinetica di riparazione della membrana cellulare (protocolli 1 e 2) e il traffico subcellulare e la fusione dei lisosomi durante la riparazione (protocolli 3 e 4). Protocollo 1 mostra un saggio di massa che permette la marcatura tutte le cellule danneggiate e individuare le cellule danneggiate che non sono riusciti a riparare. I risultati in figura 1 mostrano che mentre le cellule ...

Il processo di guarigione cellule feriti comporta tratta di specifiche proteine ​​e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione membrana cellulare. Questo protocollo descrive saggi per monitorare questi processi.

Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'effetto di trattamenti desiderati sulla riparazione di cellule danneggiate e studiare i processi subcellulari che contribuiscono alla riparazione delle cellule lesionate. Questo viene ottenuto danneggiando le cellule in presenza di coloranti fluorescenti che non possono attraversare membrane cellulari integre, al fine di valutare la cinetica e la capacità delle cellule danneggiate di impedire l'ingresso di questi coloranti. Come secondo passaggio, monitoriamo la comparsa di proteine intracellulari alla membrana cellulare lesionata, il che indica la capacità di un compartimento cellulare d'interesse di partecipare alla riparazione fondendosi con la membrana cellulare danneggiata.Successivamente, monitoriamo la fusione di compartimenti cellulari di interesse con la membrana cellulare danneggiata, al fine di seguire la cinetica della lesione. La fusione indotta di questo compartimento fornisce risultati che indicano come la riparazione del danno alla membrana cellulare sia associata all’esocitosi lisosomiale, basata sull’aumentata comparsa della proteina della membrana associata ai lisosomi, una, sulla superficie della cellul

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Un protocollo dettagliato è descritto per l'imaging in tempo reale la formazione di complessi di riparazione del DNA...

Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis</em

Qui descritte sono protocolli utilizzati per visualizzare il processo dinamico della MG53-mediata riparazione membrana cellulare in animali interi ed a livello cellulare. Questi metodi possono essere applicati per studiare la biologia cellulare della medesima membrana plasmatica e la medicina rigenerativa.

Visualizzazione di MG53-mediata di riparazione della membrana cellulare Utilizzando In vivo E In vitro Sistemi

Vivo imaging di cellule esposte al colorante lipofilo FM1-43 consente una determinazione precisa della cinetica con cui tossine formanti pori vengono rimossi dalla membrana plasmatica. Questo è un test sensibile che può essere utilizzato per valutare requisiti di Ca 2 +, sfingomielinasi e altri fattori sulla membrana plasmatica di riparazione.

Vivere Imaging test per la valutazione dei ruoli di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E sfingomielinasi nella riparazione di Pore-formano ferite Tossina

Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .

Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

Fluorescenza confocale microscopia e laser micro-irradiazione offrire strumenti per indurre il danno del DNA e monitoraggio della risposta delle proteine di riparazione del DNA in determinate aree sub-nucleare. Questa tecnica ha avanzato significativamente la nostra conoscenza di rilevamento dei danni, di segnalazione e di reclutamento. Questo manoscritto viene illustrato queste tecnologie per esaminare riparazione singola e doppia uscita.

Applicazione di Micro-irradiazione del Laser per l'esame di Single e Double Strand Break Repair in cellule di mammifero

Membrana cellulare ferendo tramite due fotoni laser è un metodo ampiamente usato per la valutazione della membrana risigillazione capacità e può essere applicato a più tipi di cellule. Qui, descriviamo un protocollo in vitro live-imaging per membrana menzionerà in disferlinopatia paziente cellule dopo ablazione laser del due-fotone.

Analisi di riparazione della membrana cellulare usando un microscopio a due fotoni Laser

Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

La risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni attivata dal fascio misto di neutroni utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boronica (BNCT) non è stata completamente stabilita. Questo protocollo fornisce una procedura graduale per rilevare i foci indotti da radiazioni (RIF) delle proteine di riparazione mediante colorazione immunofluorescenza nelle linee cellulari del cancro del colon umano dopo l'irradiazione con il fascio di neutroni misto.

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.

Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Il metodo di puntura termoplasmonica integra microscopia confocale, pinzette ottiche e nanoparticelle d'oro per studiare le risposte proteiche durante la riparazione della membrana plasmatica nelle cellule e nelle vescicole unilamellari giganti. La tecnica consente una puntura di membrana rapida e localizzata, consentendo l'identificazione di proteine chiave e dei loro ruoli funzionali nell'intricato meccanismo di riparazione della membrana plasmatica.

Un approccio termoplasmonico per lo studio della riparazione della membrana plasmatica in cellule viventi e membrane modello

Scopri i processi subcellulari coinvolti nella riparazione della membrana cellulare utilizzando marcatori fluorescenti e imaging in tempo reale. Questo metodo permette di studiare la cinetica della risposta cellulare all'infortunio.

Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

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