Name: Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Scopri i processi subcellulari coinvolti nella riparazione della membrana cellulare utilizzando marcatori fluorescenti e imaging in tempo reale. Questo metodo permette di studiare la cinetica della risposta cellulare all'infortunio.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni AR055686 e AR060836 e borsa di studio postdottorato al dC da Francese Distrofia Muscolare (AFM). L&#39;impianto di imaging cellulare utilizzato in questo studio è sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HD040677.

1. Imaging Membrana cellulare Repair Uso Bulk (perle di vetro) Ferimento Questo protocollo permette separatamente segnando le cellule danneggiate e quelli che non riescono a guarire. Quantificare queste popolazioni di cellule richiede l&#39;utilizzo di tre condizioni: 1. Test (C1) - Le cellule possono riparare in presenza di Ca 2 +, 2. Controllo 1 (senza pregiudizio C2) - Le cellule vengono incubate in presenza di Ca 2 +, ma non feriti, e 3. Control 2 (senza C3 riparazione) - le cellule sono autorizzati a riparare in assenza di Ca 2 +. <ol><li> Crescere le cellule a&gt; 50% di confluenza in tre coprioggetto sterili e lavare C1 e C2 due volte con CIM a 37 ° C e C3 con PBS a 37 ° C e di trasferimento coprioggetto su O-ring in silicone. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di destrano FITC preriscaldata in CIM su C1 e C2 o C3 in PBS su. </li><li> Ferire membrana plasmatica in C1 e C3 da dolci 40 perle mg di vetro sopra il vetrino a temperatura ambiente mediante lamelle inclinabili manualmente indietro evia 6-8 volte con un angolo di 30 °. Nota: per lesioni lievi, assicurano le perle di vetro sono distribuite in modo uniforme, riducendo così al minimo le lesioni ripetute. Per migliorare la riproducibilità del pregiudizio tra i campioni, contemporaneamente effettuare la lesione branello di vetro dei diversi campioni da confrontare. </li><li> Evitare inoltre di rotolamento di perline, trasferire tutti i vetrini di un incubatore 37 ° C a CO 2 ambiente e consentire la riparazione di procedere per 5 min. </li><li> Senza lasciare le perle rotolano, rimuovere le perline di vetro e FITC destrano mediante lavaggio con CIM (C1 e C2) o PBS (C3) a 37 ° C. </li><li> Luogo coprioggetto torna sul ring e aggiungere 100 ml di soluzione di lisina TRITC destrano risolvibile preriscaldata in CIM su C1 e C2 o in PBS su C3. </li><li> Incubare a 37 ° C per 5 min a CO 2 ambiente. </li><li> Lavare coprioggetti due volte con preriscaldata CIM e fissare con PFA 4% per 10 min a RT. </li><li> Lavare due volte con PBS e incubare per 2 min a RT in Hoechst colorante. </li><li> Wash samples due volte con PBS, montare su un vetrino utilizzando supporti di montaggio e celle di immagine utilizzando un microscopio a epifluorescenza. </li><li> Utilizzare cellule da C2 per determinare il fondo rosso e verde intensità di colorazione e utilizzare questo valore di soglia per i canali rosso e verde per tutti i campioni (C1-C3). </li><li> Punteggio numero totale di cellule che sono a) verde (infortunato e riparato) e b), rosso o entrambi rosso e verde (infortunato, ma non è riuscito a riparare) in campioni C1 e C3. </li><li> Conte&gt; 100 cellule verdi per ogni condizione ed esprimere la frazione di cellule che non sono riusciti a riparare come percentuale di tutte le cellule danneggiate (verde e rosso). </li></ol> 2. Immagini dal vivo della cinetica di membrana cellulare di riparazione Following Laser Injury <ol><li> Lavare le cellule con preriscaldata CIM e poi mettere il vetrino in CIM con la tintura FM. </li><li> Posizionare il coprioggetto in un supporto in incubatrice all&#39;inizio stadio mantenuto a 37 ° C. </li><li> Selezionare una regione della membrana cellulare 1-2 mm 2, e per irradiare &lt;; 10 msec con il laser pulsato. Attenuare la potenza laser attraverso il software al 40-50% della potenza di picco. Potenza ottimale consente pregiudizio consistente, ma non letale e questo deve essere determinato per tentativi per ogni singolo strumento e linea cellulare utilizzato. </li><li> Per monitorare la riparazione, un&#39;immagine ogni 10 secondi in epifluorescenza e chiaro, iniziando prima di pregiudizio e proseguire per 3-5 minuti dopo la lesione. Nota: Per nessun controllo la riparazione, ripetere i passaggi 2,1-2,4 con le cellule feriti in PBS contenente colorante FM. </li><li> Per quantificare la cinetica di riparazione, misurare FM cellulare colorante fluorescente e tracciare la variazione di intensità (ΔF/F0) nel corso di imaging. Questi dati devono essere in media per oltre 10 celle in ogni stato e tracciata come media o il valore della singola cella, se necessario. </li></ol> 3. Imaging Bulk (perle di vetro) Infortunio Induced lisosomiale Esocitosi Gli esempi includono seguenti cellule cresciute a&gt; 50%confluenza: 1. Test (C1) - Cellule permesso di riparare in presenza di Ca 2 +, 2. Controllo 1 (C2; Nessun danno) - Cellule né feriti né incubate con l&#39;anticorpo primario, e 3. Control 2 (C3, n riparazione) - Cellule autorizzati a riparare in assenza di Ca 2 +. <ol><li> Lavare coprioggetto C1 e C2 due volte con CIM a 37 ° C e C3 con PBS a 37 ° C e trasferirli su O-ring in silicone. </li><li> Aggiungere 100 pl di preriscaldata lisina fissabile destrano TRITC in CIM su C1 e C2 e C3 in PBS su. </li><li> Ferire membrana plasmatica su C1 e C3 come al punto 1.3. </li><li> Evitare inoltre di rotolamento di perline, trasferire tutti i vetrini di un incubatore 37 ° C a CO 2 ambiente e consentire la riparazione di procedere per 5 min. </li><li> Rimuovere le perline di vetro e TRITC destrano lavando i coprioggetti in terreno di crescita freddo, assicurando ancora nessun rotolamento delle sfere di vetro sulle cellule. </li><li> Lavare i coprioggetti due volte con mezzo di crescita freddo e trasferire gli O-ring. </li><li> Per C1 e C3, Aggiungere 100 ml di ratto anticorpo anti LAMP1 topo in mezzi di crescita complete freddo e aggiungere il freddo, terreno di coltura completo C2. </li><li> Per consentire legame dell&#39;anticorpo lamelle incubare per 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavare i coprioggetti tre volte con CIM freddo e fissare tutti i vetrini con il 4% PFA per 10 min a RT e poi risciacquare 3x con CIM. </li><li> Incubare tutte coprioggetto in 100 ml di soluzione di blocco per 15 minuti a RT </li><li> Incubare tutte coprioggetto in 100 microlitri Alexa Fluor 488 anticorpo anti ratto per 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavare due volte con PBS e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente in Hoechst. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS, montare su un vetrino utilizzando supporti di montaggio e immagine utilizzando un microscopio a epifluorescenza. </li><li> Utilizzo di immagini di cellule C2, determinare la colorazione di fondo aspecifica in rosso (TRITC destrano) e verde (Alexa Fluor 488 anticorpi) canali e usare questi valori colorazione di fondo di soglia i canali rosso e verde per tutti i campioni (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li> Utilizzare i rossi etichettati&gt; 100 cellule da C1 e C3 per misurare l&#39;intensità della colorazione LAMP1 (verde) in cellule danneggiate. Per un esperimento riuscito colorazione LAMP1 in celle da C3 sarà notevolmente inferiore rispetto alle cellule di C1. </li></ol> 4. Immagini dal vivo di Cell Membrane Injury Attivato Traffico subcellulare <ol><li> Fluorescently etichettare il vano di interesse trasfettando opportuno giornalista (es. CD63-GFP per lisosomi 8) oppure utilizzando coloranti fluorescenti 9. </li><li> Per i lisosomi etichettatura con colorante fluorescente, incubare cellule cresciute al 50% di confluenza in terreni di coltura contenente FITC-destrano </li><li> Lasciare destrano da endocitato per 2 ore (o più, se necessario per l&#39;etichettatura sufficiente endosomal con destrano dalla linea cellulare di interesse) in CO 2 incubatore. </li><li> Lavare le cellule con i media di crescita preriscaldate e incubare per 2 ore in un incubatore CO 2 per consentire a tuttiendocitosi destrano ad accumularsi nel lisosoma. </li><li> Prima di imaging, sciacquare il vetrino in preriscaldata CIM e montare in un supporto vetrino sul incubatore cima fase a 37 ° C. </li><li> Eseguire widefield (per il movimento in tutta la cellula) o TIRF (movimento alla superficie cellulare e esocitosi) immagini - le cellule che non hanno affollato FITC destrano lisosomi etichettati sono l&#39;ideale per l&#39;imaging dei movimenti e esocitosi dei singoli lisosomi. </li><li> Allineamento laser TIRF per microscopio di imaging: Usa 60X o 100X con obiettivo&gt; 1,45 NA. Impostare l&#39;angolo per incidente TIRF fascio laser usando l&#39;approccio del produttore. </li><li> Danneggiare la membrana cellulare irradiando una regione piccola (1-2 mm 2) per &lt;100 msec, con il laser pulsato a 40-50% attenuazione. </li><li> Per monitorare la risposta dei lisosomi alla cella di pregiudizio, celle di immagine a 4-6 fotogrammi / sec per almeno 2 minuti o più, a seconda delle dinamiche di esocitosi nelle cellule di interesse. </li></ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
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<li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li>
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<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lesioni membrana cellulare in vivo verifica a causa di una varietà di stress fisiologici e diversi approcci sperimentali sono stati sviluppati per imitare questi. Questi includono il ferimento membrana cellulare delle cellule aderenti raschiando loro fuori il piatto o da passaging attraverso uno stretto 9,10 siringa foro. Seguendo tali lesioni guariscono le cellule in sospensione e non aderire alla matrice extracellulare, come avviene normalmente nel tessuto. Altri ancora, come l&#39;uso di pori form...

Membrana cellulare mantiene l&#39;integrità delle cellule, fornendo una barriera tra la cella e l&#39;ambiente extracellulare. Uno stimolo chimico, elettrico o meccanico che supera la normale soglia fisiologica così come la presenza di agenti patogeni invasori può ogni risultato lesioni alla membrana cellulare e innescare una risposta cellulare successiva per riparare questa lesione. Per sopravvivere queste lesioni alla membrana cellulare, cellule possiedono un meccanismo efficiente per la riparazione. Questo meccanismo è dipendente dal calcio e coinvolge traffico intracellulare di proteine ​​come MG53 annexins e tra gli altri, nonché compartimenti subcellulari come endosomi, lisosomi, Golgi vescicole derivate e mitocondri alla membrana cellulare feriti 1-7. Tuttavia, i dettagli della sequenza di eventi molecolari e subcellulari coinvolti nella riparazione membrana cellula danneggiata rimane poco compresa. Risposta di riparazione del cellulare può essere segregato in un orecchioly e risposte tardive. Le prime risposte, che si verificano in pochi secondi in scala minuti di tempo, sono estremamente importante nel determinare la natura delle risposte tardive che portano alla riparazione delle cellule successo o la morte delle cellule. Analisi del punto di arrivo sulla base di analisi biochimiche e cellulari di massa hanno contribuito a stabilire il coinvolgimento di processi molecolari e cellulari di riparazione. Ma, a causa della eterogeneità e rapidità di risposta di riparazione cellulare, saggi punto finale non riescono a fornire i dati cinetici e spaziali della sequenza di eventi che portano alla riparazione. Approcci che consentono pregiudizio controllata di membrana cellulare e permettono di monitorare la riparazione della membrana cellulare e subcellulare risposte associate ad alta risoluzione spaziale e temporale sono ideali per tali studi. Qui, tali approcci sono stati presentati. Due dei protocolli descrivono approcci per monitorare le reali cinetica momento della riparazione membrana cellulare e le risposte subcellulari associati al processo di riparazione in cellule vive seguenti inj laserury. Come complemento a queste analisi basate imaging cellulare dal vivo, saggi punto finale sono anche stati descritti che forniscono una misura basata sulla popolazione per il monitoraggio riparazione delle singole cellule e le risposte subcellulari associati. Per dimostrare la loro utilità questi approcci sono stati utilizzati per monitorare il traffico e l&#39;esocitosi dei lisosomi in risposta al danno membrana cellulare.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>Utilizzato per preparare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>Utilizzato per preparare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>Destrano FITC (Lisina fissabile)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml in CIM o PBS</td></tr><tr><td>Perle di vetro</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>destrano TRITC (lisina fissabile)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml in CIM o PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 in PBS</td></tr><tr><td>FM colorante</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &; g/&micro; l in destrano CIM o PBS</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml in terreno di coltura</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 in mezzo di crescita</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 pollo anti-ratto IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 in soluzione di blocco</td></tr><tr><td>Supporti di montaggio</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Petridish con fondo in vetro</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>O-ring</td> <td>in siliconeBellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per vetrino coprioggetti</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>Utilizzato per il terreno di crescita: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td></tr><tr><td>Penicillina/Sreptomicina</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>Utilizzato per il terreno di crescita: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td></tr><tr><td>Siero di pollo</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>Il siero di pollo al 5% in CIM viene utilizzato per bloccare la soluzione durante l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>PBS (senza Ca2+ e Mg2+)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore TIRF&nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore a epifluorescenza</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione e analisi delle immagini</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Laser pulsato</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a tavolino</td><td>Tokaihit, Giappone</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging membrana cellulare pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

La capacità delle cellule danneggiate per guarire è un processo cellulare fondamentale, ma i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella guarigione delle cellule feriti sono poco conosciute. Qui saggi sono descritti per monitorare la capacità e la cinetica di guarigione delle cellule in coltura dopo la lesione localizzata. Il primo protocollo descrive un approccio basato punto di fine di valutare simultaneamente cellule riparazione della membrana capacità di centinaia di cellule. Il secondo protocollo descrive un metodo di immagini in tempo reale per monitorare la cinetica di riparazione membrana cellulare in cellule singole seguenti lesioni localizzate con un laser pulsato. Come cellule di guarigione feriti comporta tratta di specifiche proteine ​​e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione, il terzo protocollo descrive l&#39;uso di approccio basato punto finale di cui sopra per valutare uno di questi eventi traffico (esocitosi lisosomiale) in centinaia di cellule danneggiate simultaneamente e l&#39;ultimo protocollo descrive l&#39;uso di lesioni laser pulsato con micros TIRFcopia di monitorare le dinamiche dei singoli compartimenti subcellulari in cellule danneggiate ad alta risoluzione spaziale e temporale. Mentre i protocolli che seguono descrivono l&#39;uso di questi approcci per studiare il legame tra riparazione membrana cellulare e lisosomiale esocitosi in cellule muscolari coltivate, possono essere applicate come tali per qualsiasi altra cellula in coltura aderente e compartimento subcellulare di scelta.

Protocolli descritti qui per l&#39;imaging singola cellula sono di monitorare la capacità e la cinetica di riparazione della membrana cellulare (protocolli 1 e 2) e il traffico subcellulare e la fusione dei lisosomi durante la riparazione (protocolli 3 e 4). Protocollo 1 mostra un saggio di massa che permette la marcatura tutte le cellule danneggiate e individuare le cellule danneggiate che non sono riusciti a riparare. I risultati in figura 1 mostrano che mentre le cellule ...

Il processo di guarigione cellule feriti comporta tratta di specifiche proteine ​​e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione membrana cellulare. Questo protocollo descrive saggi per monitorare questi processi.

Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'effetto di trattamenti desiderati sulla riparazione di cellule danneggiate e studiare i processi subcellulari che contribuiscono alla riparazione delle cellule lesionate. Questo viene ottenuto danneggiando le cellule in presenza di coloranti fluorescenti che non possono attraversare membrane cellulari integre, al fine di valutare la cinetica e la capacità delle cellule danneggiate di impedire l'ingresso di questi coloranti. Come secondo passaggio, monitoriamo la comparsa di proteine intracellulari alla membrana cellulare lesionata, il che indica la capacità di un compartimento cellulare d'interesse di partecipare alla riparazione fondendosi con la membrana cellulare danneggiata.Successivamente, monitoriamo la fusione di compartimenti cellulari di interesse con la membrana cellulare danneggiata, al fine di seguire la cinetica della lesione. La fusione indotta di questo compartimento fornisce risultati che indicano come la riparazione del danno alla membrana cellulare sia associata all’esocitosi lisosomiale, basata sull’aumentata comparsa della proteina della membrana associata ai lisosomi, una, sulla superficie della cellula danneggiata, e sull’imaging in tempo reale della secrezione del contenuto lisosomiale da parte delle cellule danneggiate. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande importanti nel campo dello studio del danno e della riparazione cellulare.Ad esempio, questi possono essere utilizzati per determinare quali proteine e compartimenti cellulari rispondono a lesioni focali della membrana cellulare e successivamente valutare la cinetica di tale risposta. A dimostrare la procedura saranno Aurelia D four e hamma stra two, due borsisti postdottorandi del mio laboratorio. Per marcare separatamente le cellule lesionate che guariscono e quelle che non riescono a guarire.Sezionare le cellule su coprioggetti sterili per le tre condizioni sperimentali. Coltivare le cellule fino a quando raggiungono una confluenza superiore al 50%, quindi lavare C uno e C due due volte con CIM a 37 gradi Celsius. Lavare C3 con PBS a 37 gradi Celsius.Quindi trasferire le lamelle su anelli di silicone. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di dextran preriscaldata nel tampone appropriato. Lesionare la membrana plasmatica su C1 e C3 aggiungendo 40 milligrammi di perline di vetro sulla lamella a temperatura ambiente e inclinando manualmente la lamella.Scivolare avanti e indietro da sei a otto volte con un angolo di 30 gradi per provocare un danno lieve. Assicurarsi che i granuli di vetro siano distribuiti uniformemente, riducendo così al minimo lesioni ripetute e migliorando la riproducibilità del danno tra i campioni. Eseguire contemporaneamente il danno con granuli di vetro sui diversi campioni da confrontare, evitando ulteriori rotolamenti dei granuli.Trasferire tutti i coprioggetti in un incubatore a 37 gradi Celsius con CO2 ambiente e lasciare procedere la riparazione per cinque minuti senza far rotolare le perle. Rimuovere le perle di vetro e il dextran fitto lavando con tampone o PBS. Ora riposizionare i coprioggetti sull'O-ring e aggiungere 100 microlitri di lisina preriscaldata.Incubare la soluzione di destrano fissabile trissy a 37 gradi Celsius per cinque minuti in presenza di CO2 ambiente. Lavare due volte i coverslip con CIM preriscaldato e fissare con PFA al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente dopo due lavaggi con PBS. Incubare per due minuti nel colorante di Hersch e, dopo due ulteriori lavaggi con PBS, montare il campione su un vetrino utilizzando un mezzo di montaggio.Successivamente, acquisire le immagini delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza episcopica dal campione C due. Determinare l'intensità di fondo della colorazione rossa e verde. Utilizzare quindi questo valore per impostare la soglia dei canali rosso e verde per tutti i campioni.Valutare il numero totale di cellule verdi. Valutare anche le cellule che sono rosse o sia rosse che verdi nei campioni C1 e C3. Contare ora oltre 100 cellule danneggiate verdi per ogni condizione ed esprimere la frazione di cellule che non hanno riparato come percentuale di tutte le cellule danneggiate.Lavare le cellule cresciute fino a oltre il 50% di confluenza con CIM preriscaldato e montare il coverslip in CIM con il colorante FM. In un supporto all'interno dell'incubatore posto sul tavolo microscopico, mantenuto a 37 gradi Celsius. Selezionare una regione della membrana cellulare utilizzando una potenza ottimale che consenta un danno costante ma non letale.Irradiare il campione per meno di 10 millisecondi con il laser a impulsi per ottenere questo risultato. Attenuare la potenza del laser tramite il software al 40-50% della potenza massima, al fine di monitorare, riparare e acquisire immagini ogni due-dieci secondi in epifluorescenza, fluorescenza e campo chiaro, a partire prima della lesione e proseguendo per tre-cinque minuti dopo la lesione stessa. Per quantificare la cinetica della riparazione, misurare la fluorescenza del colorante FM cellulare.Calcolare la variazione di intensità nel corso dell'acquisizione delle immagini. Mediare i dati su oltre 10 cellule per ogni condizione e rappresentarli come valori medi o come singole cellule. Lavare le lamelle di C uno e C due.Preparare le colture con CIM a 37 gradi Celsius e lavare C3 con PBS a 37 gradi Celsius. Successivamente, trasferire i campioni su anelli di silicone O-ring. Aggiungere 100 microlitri di dextrano trissy fissabile con lisina preriscaldato.Lesionare la membrana plasmatica su C1 e C3 come mostrato in precedenza. Quindi, evitando ulteriori rotolamenti delle perle, trasferire tutte le lamelle in un incubatore a 37 gradi Celsius con CO2 ambiente e lasciare che il processo di riparazione proceda per cinque minuti.Ora, per rimuovere le perline di vetro e la destrana Trixie, lavare le lamelle con mezzo di crescita freddo, assicurandosi che le perline di vetro non rotolino sulle cellule. Risciacquare le lamelle due volte con mezzo di crescita freddo e trasferirle sugli O-ring di C1 e C3. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo ratto anti-US lamp 1 in mezzo di crescita completo freddo e aggiungere il mezzo di crescita completo freddo a C2 per consentire il legame dell'anticorpo. Incubare le lamelle per 30 minuti a quattro gradi Celsius dopo tre lavaggi con CIM freddo.Fissare tutti i vetrini con PFA al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi eseguire tre risciacqui con CIM. Successivamente, incubare tutti i vetrini in 100 microlitri di soluzione bloccante per 15 minuti, seguiti da 100 microlitri di anticorpo anti-ratto 488 per 15 minuti.Lavare due volte con PBS e incubare nel colorante Her per due minuti a temperatura ambiente dopo due lavaggi con PBS. Montare i campioni su un vetrino, quindi acquisire le immagini dei campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza in epifluorescenza con immagini di cellule C due. Determinare la colorazione di fondo non specifica nei canali rosso e verde.Utilizzare questi valori di colorazione di fondo per impostare la soglia dei canali rosso e verde per tutti i campioni. Utilizzare le cellule marcate in rosso superiori a 100 provenienti da C1 e C3 per misurare l'intensità della colorazione di lamp1 nelle cellule danneggiate. In un esperimento riuscito, le cellule colorate per lamp1 provenienti da C3 saranno significativamente meno intense rispetto a quelle provenienti da C1. Per etichettare i lisosomi con un colorante fluorescente, incubare le cellule cresciute fino a una confluenza del 50% in terreno di crescita contenente dextrano marcato con fitzio.Lasciare che il destrano venga endocitato per due ore nell'incubatore per colture cellulari. Lavare le cellule con mezzo di crescita preriscaldato e incubarle per due ore in un incubatore a CO2, in modo che tutto il destrano endocitato si accumuli nei lisosomi prima dell'acquisizione delle immagini. Risciacquare il coprivetrino con mezzo di imaging cellulare (CIM) preriscaldato e montarlo in CIM su un supporto per coprivetrini all'interno dell'incubatore da piastra a 37 gradi Celsius.Selezionare cellule in cui i lisosomi marcati con fitzdextrano non siano sovraffollati per l'acquisizione di immagini. Il movimento e l'esocitosi di singoli lisosomi. Acquisire immagini a campo ampio per seguire il movimento dei lisosomi in tutta la cellula.Acquisire alternativamente immagini del movimento sulla superficie cellulare e monitorare la loro esocitosi. Danneggiare la membrana cellulare mediante irradiazione, come mostrato in precedenza, per monitorare la risposta del lisosoma al danno cellulare; acquisire immagini delle cellule a una velocità di quattro-sei fotogrammi al secondo per almeno due minuti o più a lungo, a seconda della dinamica dell'esocitosi nelle cellule di interesse. In questo saggio collettivo, tutte le cellule danneggiate vengono marcate e quelle che non riescono a ripararsi vengono identificate, mentre le cellule non danneggiate rimangono non marcate.Le cellule danneggiate da microsfere di vetro in presenza di dextrano fitzy vengono marcate in verde quando si permette alle cellule di ripararsi in presenza di calcio. La maggior parte delle cellule danneggiate riesce a ripararsi e non viene marcata dal dextrano trissy durante il riparo. In assenza di calcio, la maggior parte delle cellule danneggiate viene inoltre marcata in rosso dal dextrano trissy.Questo esperimento valuta la cinetica della riparazione della membrana cellulare monitorando l'ingresso del colorante FM nella cellula. Quando incubate con il colorante FM, le cellule integre mostrano una colorazione intracellulare scarsa o nulla. Dopo un danno localizzato al laser della membrana cellulare, il colorante FM inizia a entrare nella cellula e a legarsi alle membrane endocellulari, provocando un brusco aumento della fluorescenza del colorante FM; questa capacità della membrana cellulare di ripararsi dopo il danno da laser dipende dal calcio.Una cellula danneggiata in presenza di calcio è in grado di ripararsi, il che determina l'interruzione dell'ingresso del colorante FM entro un minuto dal danno. Al contrario, una cellula lasciata riparare in assenza di calcio non riesce a ripararsi, con conseguente ingresso continuo del colorante e quindi aumento continuo della fluorescenza di FM d anche quattro minuti dopo il danno. Pertanto, la riparazione della membrana cellulare porta a un plateau della colorazione con il colorante FM.Sebbene la mancanza di riparazione della membrana cellulare causi un ingresso continuo di colorante che non raggiunge un plateau. L'approccio di lesione con perline di vetro in massa può essere utilizzato per monitorare la traslocazione sulla superficie cellulare di vescicole e proteine in risposta alla lesione. Qui, le cellule vengono lesionate in presenza di dextrano marcato con trissy.Pertanto, mentre le cellule non danneggiate non sono marcate in rosso, tutte le cellule danneggiate sono marcate in rosso. Si noti che le cellule non danneggiate e non trattate con l'anticorpo primario mostrano un'etichettatura di fondo per lamp uno sulla superficie cellulare. Tuttavia, quando le cellule sono danneggiate e lasciate riparare in presenza di calcio, i lisosomi subiscono esocitosi e, di conseguenza, si osserva un aumento del marcatore lamp uno sulla superficie delle cellule danneggiate.Questo aumento dell'etichettatura di lamp uno sulla superficie cellulare è molto minore nelle cellule che vengono lasciate guarire in assenza di calcio. Pertanto, sia la quantificazione del numero di cellule con intensa colorazione di lamp uno sulla superficie cellulare, sia la misurazione del livello di colorazione di lamp.1 sulla superficie cellulare in singole cellule lesionate forniscono parametri per valutare la capacità della cellula di eseguire l'esocitosi lisosomiale indotta dal danno.Questo esperimento monitora direttamente la cinetica, la natura e la localizzazione della fusione individuale dei lisosomi. In risposta a un danno della membrana cellulare, le cellule vengono lesionate mediante un laser a impulsi e i lisosomi della superficie cellulare vengono osservati tramite imaging turf, tecnica che permette di monitorare l'esocitosi innescata dal danno a livello dei singoli lisosomi in singole cellule. Questa figura mostra una cellula visualizzata mediante imaging a contrasto di fase nel riquadro sinistro e mediante microscopia turf nel riquadro centrale.Il pannello destro mostra l'immagine turf della stessa cellula 105 secondi dopo la lesione. In questo caso, la lesione ha innescato il reclutamento di un lisosoma alla membrana cellulare, seguito da esocitosi, come mostrato. Questo lisosoma non è visibile nell'immagine turf prima della lesione, ma dopo la lesione, il lisosoma raggiunge la membrana cellulare e diventa rilevabile.Quando la vescicola si avvicina alla membrana cellulare, viene eccitata più efficacemente dall'illuminazione in campo chiaro, determinando il raggiungimento del valore massimo della fluorescenza del filamento fitico di dex lisosomiale. Quando si apre il poro di fusione, ciò provoca la neutralizzazione del pH lisosomiale e, di conseguenza, la desoppressione della fluorescenza del filamento fitico DExT. Successivamente, il filamento DExT viene rilasciato dalla vescicola all'esterno della cellula, causando una diffusione laterale della fluorescenza ZI e un graduale calo della fluorescenza vescicolare; inoltre, possono essere misurate varie risposte legate a danni indotti ai lisosomi.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come monitorare la capacità delle cellule di ripararsi da lesioni focali estese e di come osservare i compartimenti subcellulari e le proteine che rispondono alla lesione e contribuiscono al processo di riparazione. Possono essere eseguiti ulteriori esperimenti utilizzando diverse etichettature vitali con marcatori, compartimenti o proteine, al fine di monitorare la risposta alla lesione e il coinvolgimento nelle cellule IND durante il processo di riparazione.

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