Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'effetto dei trattamenti desiderati sulla riparazione delle cellule danneggiate e studiare i processi subcellulari che aiutano a riparare le cellule danneggiate. Ciò si ottiene danneggiando le cellule in presenza di coloranti fluorescenti che non possono attraversare le membrane cellulari intatte per valutare la cinetica e la capacità delle cellule danneggiate di impedire l'ingresso di questi coloranti. Come secondo passo, monitoriamo la comparsa di proteine intracellulari sulla membrana cellulare lesa, che identifica la capacità di un compartimento cellulare di interesse di partecipare alla riparazione fondendosi con la membrana cellulare lesa.

Successivamente, monitoriamo la fusione dei compartimenti cellulari di interesse con la membrana cellulare danneggiata al fine di monitorare la cinetica del danno. Si ottengono risultati di fusione innescata di questo compartimento che mostrano che la riparazione del danno alla membrana cellulare è associata all'esocitosi lisosomiale basata su un aumento della comparsa della proteina di membrana associata al lisosoma, uno sulla superficie cellulare danneggiata e sull'imaging dal vivo della secrezione del contenuto lisosomiale da parte delle cellule lesimate. Questi metodi possono aiutare ad affrontare domande importanti nel danno e nella riparazione cellulare.

Ad esempio, questi possono essere utilizzati per determinare quali proteine e compartimenti cellulari rispondono a lesioni focali sulla membrana cellulare e quindi valutare la loro cinetica della risposta. A dimostrare la procedura sarebbero Aurelia D, quattro anni, e hammastra, due dei borsisti post-dottorato del mio laboratorio. Per contrassegnare separatamente le cellule ferite che guariscono e quelle che non riescono a guarire.

Seminare le cellule su vetrini coprioggetti sterili per le tre condizioni sperimentali. Coltivare le cellule fino a raggiungere una confluenza superiore al 50%, quindi lavare C uno e C due due volte con CIM a 37 gradi Celsius. Lavare C3 con PBS a 37 gradi Celsius.

Quindi trasferire i vetrini coprioggetto su O-ring in silicone. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di destrano fitzy preriscaldato in un tampone appropriato. Danneggiare la membrana plasmatica su C one e C3 aggiungendo 40 milligrammi di perle di vetro sul vetrino coprioggetti a temperatura ambiente e inclinando manualmente il coperchio.

Scivola avanti e indietro da sei a otto volte con un angolo di 30 gradi per lesioni lievi. Assicurarsi che le perle di vetro siano distribuite uniformemente, riducendo così al minimo le lesioni ripetute per migliorare la riproducibilità delle lesioni tra i campioni. Eseguire contemporaneamente la lesione della perla di vetro dei diversi campioni da confrontare, evitando un ulteriore rotolamento delle perle.

Trasferire tutti i vetrini coprioggetto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius a CO2 ambiente e lasciare che la riparazione proceda per cinque minuti senza far rotolare le perline. Rimuovere le perle di vetro e il destrano fitzy lavando con tampone o PBS. Ora riposizionare i vetrini coprioggetto sull'O-ring e aggiungere 100 microlitri di lisina preriscaldata.

Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti a CO2 ambiente. Lavare due volte i vetrini coprioggetto con CIM preriscaldato e fissare con PFA al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente dopo due lavaggi PBS. Incubare per due minuti nel colorante hersch e dopo due lavaggi PBS montare il campione su un vetrino utilizzando il terreno di montaggio.

Quindi, visualizzare le cellule utilizzando un microscopio a epifluorescenza dal campione C 2. Determinare l'intensità della colorazione rossa e verde di sfondo. Quindi utilizzare questo valore per soglie i canali rosso e verde per tutti i campioni.

Assegna un punteggio al numero totale di celle verdi. Segna anche le cellule rosse o sia rosse che verdi nei campioni C uno e C3. Ora conta oltre 100 cellule verdi danneggiate per ogni condizione ed esprimi la frazione di cellule che non sono riuscite a ripararsi come percentuale di tutte le cellule danneggiate.

Lavare le cellule cresciute oltre il 50% di confluenza con CIM pre-avvisato e montare il vetrino coprioggetto in CIM con colorante FM. In un supporto nello stage top incubatore mantenuto a 37 gradi Celsius. Selezionare una regione della membrana cellulare utilizzando una potenza ottimale che consenta lesioni costanti ma non letali.

Irradiare il campione per meno di 10 millisecondi con il laser pulsato per ottenere ciò. Attenuare la potenza del laser attraverso il software al 40-50% della potenza di picco per monitorare, riparare, acquisire immagini ogni 2-10 secondi in epi, fluorescenza e campo chiaro a partire da prima dell'infortunio e continuando da tre a cinque minuti dopo l'infortunio. Per quantificare la cinetica di riparazione, misurare la fluorescenza del colorante FM cellulare.

Calcola la variazione di intensità durante il corso dell'imaging. Calcolare la media dei dati per oltre 10 celle in ogni condizione e tracciare il valore medio o le singole celle. Lavare i vetrini coprioggetto di C one e C two.

Preparazioni colturali con CIM a 37 gradi Celsius e lavaggio C3 con PBS a 37 gradi Celsius. Quindi trasferire i campioni su O-ring in silicone. Aggiungere 100 microlitri di trissy dextran preriscaldabile in lisina.

Danneggiare la membrana plasmatica su Cone e C3 come mostrato in precedenza. Evitando poi ulteriori rotolamenti di perline. Trasferire tutti i vetrini di copertura in un incubatore a 37 gradi Celsius a CO2 ambiente e lasciare che la riparazione proceda per cinque minuti.

Ora per rimuovere le perle di vetro e il destrano Trixie, lavare i vetrini di copertura in un terreno di crescita freddo, assicurandosi che le perle di vetro non rotolino sulle celle. Sciacquare due volte i vetrini coprioggetto con un terreno di coltura freddo e trasferirli sugli O-ring a C uno e C3. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo anti-US di ratto in un terreno di crescita completo a freddo e aggiungere il terreno di crescita completo a freddo a C due per consentire il legame degli anticorpi. Incubare i vetrini coprioggetto per 30 minuti a quattro gradi Celsius dopo tre lavaggi con CIM freddo.

Fissare tutti i vetrini coprioggetti con il 4% di PFA per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi risciacquare tre volte con CIM. Successivamente, incubare tutti i vetrini coprioggetti in 100 microlitri di una soluzione bloccante per 15 minuti, seguita da 100 microlitri di ofor, 4 88 anticorpi anti ratto per 15 minuti.

Lavare due volte con PBS e incubare nella sua macchia per due minuti a temperatura ambiente dopo due lavaggi PBS. Montare i campioni su un vetrino, quindi visualizzare i campioni utilizzando un microscopio a epifluorescenza utilizzando immagini di cellule C due. Determinare la colorazione di fondo aspecifica nei canali rosso e verde.

Utilizzare questi valori di colorazione di fondo per limitare i canali rosso e verde per tutti i campioni. Usa le oltre 100 celle marcate in rosso di C one e C3 per misurare l'intensità della colorazione della lampada uno nelle celle danneggiate. In un esperimento di successo, le cellule della lampada uno che colorano il C3 saranno significativamente più basse rispetto alle cellule del C uno per la marcatura dei lisosomi con colorante fluorescente incubano le cellule cresciute al 50% di confluenza in terreni di crescita contenenti destrano fitzy.

Lasciare che il destrano sia endocitoso per due ore nell'incubatore per colture cellulari. Lavare le cellule con il terreno di coltura Prewarm e incubarle per due ore in un incubatore a CO2 per consentire a tutto il destrano endocitoso di accumularsi nel lisosoma prima dell'imaging. Sciacquare il vetrino coprioggetto in Prewarm CIM e montarlo in CIM su un supporto per vetrino coprioggetto sull'incubatrice da palco a 37 gradi Celsius.

Selezionare le cellule che non hanno lessomi marcati con destrano fitzy affollato per l'imaging. Il movimento e l'esocitosi dei singoli lisosomi. Acquisizione di immagini ad ampio campo per il movimento dei lisosomi in tutta la cellula.

Acquisire alternativamente immagini del tappeto erboso per il movimento sulla superficie cellulare e per monitorare la loro esocitosi. Danneggiare la membrana cellulare mediante irradiazione, come mostrato in precedenza, per monitorare la risposta del lisosoma alle cellule dell'immagine del danno cellulare a quattro o sei fotogrammi al secondo per almeno due minuti o più a seconda della dinamica dell'esocitosi nelle cellule di interesse. In questo test di massa, tutte le cellule danneggiate vengono contrassegnate e quelle che non sono riuscite a ripararsi vengono identificate, mentre le cellule non danneggiate rimangono non etichettate.

Le cellule danneggiate dalle perle di vetro in presenza di destrano fitzy sono etichettate in verde quando le cellule sono lasciate riparare in presenza di calcio. La maggior parte delle cellule ferite riesce a ripararsi e non sono contrassegnate dal destrano trissy quando le cellule sono autorizzate a ripararsi. In assenza di calcio, la maggior parte delle cellule danneggiate sono anche etichettate in rosso dal destrano trissy.

Questo esperimento valuta la cinetica della riparazione della membrana cellulare monitorando l'ingresso del colorante FM nella cellula. Quando incubate in FM muoiono, le cellule intatte mostrano poca o nessuna colorazione intracellulare. A seguito di una lesione laser localizzata della membrana cellulare, la FM D inizia a entrare nella cellula e a legare le membrane endo, causando un improvviso aumento della fluorescenza del colorante FM poiché la capacità della membrana cellulare di ripararsi a seguito di una lesione laser dipende dal calcio.

Una cellula ferita in presenza di calcio è in grado di ripararsi, il che provoca la cessazione dell'ingresso del colorante FM entro un minuto dalla lesione. Al contrario, una cellula a cui è permesso di ripararsi in assenza di calcio non riesce a ripararsi, il che si traduce in un continuo ingresso di colorante e quindi in un aumento continuo della fluorescenza FM d anche quattro minuti dopo l'infortunio. Pertanto, la riparazione della membrana cellulare porta ad un plateau della colorazione del colorante FM.

Mentre la mancanza di riparazione della membrana cellulare provoca l'ingresso continuo di colorante che non riesce a stabilizzarsi. L'approccio della lesione con perle di vetro può essere utilizzato per monitorare la traslocazione della superficie cellulare di vescicole e proteine in risposta alla lesione. Qui, le cellule vengono ferite in presenza di destrano trissy.

Pertanto, mentre le cellule illese non sono etichettate in rosso, tutte le cellule danneggiate sono etichettate in rosso. Si noti che le cellule non danneggiate che non vengono trattate con anticorpi primari mostrano un'etichettatura del livello di fondo per la prima lampada sulla superficie cellulare. Tuttavia, quando le cellule sono danneggiate e lasciate guarire in presenza di calcio, i lisosomi subiscono esocitosi e quindi c'è un aumento del livello di macchia sulla superficie delle cellule lese.

Questo aumento della superficie cellulare è molto più basso nelle cellule che possono guarire in assenza di calcio. In questo modo sia quantificando il numero di celle con una colorazione della lampada ad alta superficie cellulare, sia misurando il livello della lampada sulla superficie cellulare. Uno. La colorazione su singole cellule danneggiate fornisce misure per la capacità della cellula di subire l'esocitosi lisosomiale innescata da lesioni.

Questo esperimento monitora direttamente la cinetica, la natura e la posizione della fusione dei singoli lisosomi. In risposta alla lesione della membrana cellulare, le cellule vengono danneggiate dal laser pulsato e i lisosomi della superficie cellulare vengono ripresi mediante imaging del tappeto erboso, che consente di monitorare l'esocitosi innescata dalla lesione dei lisosomi nelle singole cellule. Questa figura mostra una cellula che viene visualizzata mediante imaging a contrasto di fase nel pannello di sinistra e mediante microscopia del tappeto erboso nel pannello centrale.

Il pannello di destra mostra l'immagine del tappeto erboso della stessa cella 105 secondi dopo l'infortunio. Qui, viene mostrato il reclutamento innescato di un lisosoma nella membrana cellulare, seguito da esocitosi. Questo lisosoma non è visibile nell'immagine del tappeto erboso prima della lesione, ma dopo la lesione, il lisosoma arriva alla membrana cellulare e diventa rilevabile.

Man mano che la vescicola si avvicina alla membrana cellulare, è meglio eccitata dall'illuminazione del tappeto erboso, facendo sì che la fluorescenza del filamento lisosomiale di dex fitsy raggiunga il valore massimo. Quando la colata di fusione si apre, ciò provoca la neutralizzazione del pH lisosomiale e quindi l'estinzione della fluorescenza del filamento di DExT fitzy. Successivamente, il filamento DExT viene scaricato dalla vescicola all'esterno della cellula, causando la diffusione laterale della fluorescenza ZI e la diminuzione graduale della fluorescenza della vescicola di varie risposte innescate dalla lesione dei lisosomi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare la capacità delle cellule di ripararsi da grandi lesioni focali e di monitorare i compartimenti subcellulari e le proteine che rispondono e aiutano con il processo di riparazione. Ulteriori esperimenti utilizzando diverse marcature vitali, compartimenti o proteine possono essere eseguiti al fine di monitorare la risposta al danno e il coinvolgimento nella riparazione delle cellule IND.