Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

Gli obiettivi di questo protocollo sono di utilizzare la perfusione LOR per isolare miociti cardiaci da cuori di topo adulto con genetica nota e di analizzare la contrattilità e i transitori di calcio dei miociti. Dopo un'iniezione di eparina, il cuore viene rimosso da un topo anestetizzato. Viene montato rapidamente attraverso l'aorta su una cannula collegata a una siringa di tampone di perfusione.

L'aorta è fissata. Una sutura e un tampone vengono perfusi lentamente per liberare le arterie coronarie. La cannula viene quindi montata su un apparecchio LOR con tampone di perfusione scorrevole.

Il cuore viene digerito con una soluzione priva di calcio di collagenasi e proteasi fino a quando non è palpabilmente morbido. Il ventricolo sinistro viene inserito nel tampone privo di calcio e disperso con una pinza e un pipettaggio delicato. Dopo che la soluzione è stata filtrata attraverso la rete, le cellule vengono gradualmente introdotte a concentrazioni di calcio più elevate per rimuovere le cellule morte e garantire che i miociti siano tolleranti al calcio.

Le cellule sane sono a forma di bastoncello, mentre le cellule morte mancano di questa forma. I miociti vengono quindi caricati con un colorante legante il calcio radiometrico RA two A e posti sul tavolino del microscopio. Per l'analisi, le cellule vengono stimolate elettricamente mentre la contrattilità viene misurata utilizzando la lunghezza del sarcomero e il rilevamento dei bordi e i transienti di calcio vengono misurati analizzando lo spostamento spettrale delle due celle caricate di AR.

La cardiomiopatia dilatativa è causata da una varietà di mutazioni. Tuttavia, comprendere il meccanismo alla base di questa malattia cardiaca può essere difficile. L'isolamento dei cardiomiociti ci permette di analizzare la contrattilità e i transitori del calcio della cellula contrale del cuore, priva di calcio e 1,2 millimolare.

Le soluzioni di calcio tiroscopico possono essere preparate in anticipo il giorno dell'isolamento. Preparare il tampone di profusione privo di calcio, il tampone per la digestione, il tampone e i tamponi di trasferimento A e B secondo il protocollo scritto. Filtraggio di tutte le soluzioni attraverso un filtro da 0,2 micron prima dell'uso.

Realizzare i tamponi di trasferimento da uno a quattro con concentrazioni di calcio crescenti mescolando i tamponi A e B secondo il protocollo scritto. Impostare la portata di un apparecchio LOR a tre millilitri al minuto e impostare la temperatura del bagno d'acqua circolante in modo che il deflusso dalla punta della cannula sia di circa 37 gradi. Far scorrere l'etanolo al 70% attraverso il sistema per 15 minuti, seguito da cento millilitri di acqua, assicurandosi che tutte le bolle vengano rimosse dal sistema.

Prima del primo isolamento, crea una cannula attaccando un breve pezzo di tubo PE 50 alla punta di un adattatore per tronchetto per esche 20 3G e riscalda la punta del tubo per creare un piccolo labbro. Collegare la cannula a una piccola siringa lu lock riempita con tampone di perfusione. Assicurarsi che la cannula sia riempita di tampone.

Iniettare in un topo 200 eparina tramite iniezione IP. Iniziare a far scorrere il tampone a profusione attraverso l'L endorf in modo che sia completamente fatto scorrere attraverso il sistema prima che il cuore sia collegato. Dopo cinque minuti, anestetizzare il topo con fluoro.

Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato per un fermo pizzicamento bilaterale delle dita. Aprire il torace tagliando sotto lo sterno e su entrambi i lati della gabbia toracica, asportare rapidamente il cuore, facendo attenzione a lasciare quanta più aorta possibile attaccata al cuore. Metti immediatamente il cuore nel ghiaccio.

Tampone a profusione fredda, che funziona il più rapidamente possibile Con un microscopio di dissezione, rimuovere il tessuto in eccesso. Lavorare con attenzione per rimuovere il grasso in eccesso senza danneggiare l'Aorta sottostante. Taglia l'aorta immediatamente sotto i primi rami.

Usando due paia di pinze sottili, afferrare con cura il bordo dell'aorta e tirare delicatamente sulla punta della cannula. Assicurarsi che la punta della cannula non passi attraverso la valvola aortica nel ventricolo sinistro. Fissare l'aorta con un piccolo anello di sutura 5.0.

Spingere delicatamente una piccola quantità di tampone di perfusione attraverso la cannula, osservando che le arterie coronarie si liberino dal sangue. Rimuovere la cannula dalla siringa e collegarla all'apparecchio L endorf con perfusione fluente. Buffer. Attenzione a non introdurre bolle.

Lasciare che il tampone di perfusione fluisca attraverso il cuore per due o tre minuti. Perfuse otto dovrebbe passare dal flusso di commutazione sanguinolento a quello chiaro alla digestione, tamponare e digerire per sette-10 minuti. Dopo che il tampone si è riempito, il flusso di lang endorf può essere riciclato una volta che il cuore è palpabile.

Flacido, togliere dalla cannula e mettere in un piatto P 60 con Buffer a. Rimuovere gli atri, i grandi vasi e il ventricolo destro e trasferire in un secondo piatto di buffer a. Usando una pinza.

Separare delicatamente il ventricolo sinistro in piccoli pezzi. Se il cuore è adeguatamente digerito, il tessuto deve separarsi facilmente pipettare delicatamente più volte con una pipetta sterile da cinque mil per disperdere ulteriormente le cellule. Utilizzare una pipetta sterile per trasferire la soluzione contenente cellule e tessuti attraverso un filtro a rete di nylon da 250 micron in una provetta conica da 50 millilitri.

Lasciare che le celle si blocchino per circa 10 minuti. Le cellule vive si depositeranno sul fondo del pellet e le cellule morte galleggeranno. Trasferire il pellet nel tampone di trasferimento del calcio da 0,06 millimolari.

Lasciare riposare per 10 minuti, aspirare il surnatante contenente le cellule morte e trasferire il pellet nella soluzione di calcio 0,24 millimolare. Ripetere l'aspirazione e il trasferimento attraverso soluzioni di calcio crescenti fino a quando le cellule non si sono pellettate nel tampone di trasferimento del calcio da 1,2 millimolari. A questo punto, il pellet conterrà molte celle sane a forma di bastoncino, che non si contrarranno spontaneamente alle celle di carico con meno o due coloranti.

Trasferire un mil di cellule risospese in una provetta orph da un mil di eend. Aggiungere un microlitro di un millimolare fira due in DMSO anidro. Mescolare capovolgendo delicatamente il tubo.

Lasciare che le cellule si pellettino per 15-20 minuti al buio dopo che le cellule sono state lavate con i pellet, aspirando il surnatante e aggiungendo 1,2 millimolari di soluzione di calcio tiroscopico. Mescolare e lasciare riposare le cellule per altri 5-10 minuti. Quindi ripetere il lavaggio.

Impostare il microscopio invertito per la raccolta dei dati. Per prima cosa posizionare un vetrino coprioggetto su un inserto di tavolino progettato per l'aspirazione a profusione e per la stimolazione elettrica delle cellule. Se si utilizza un obiettivo a olio, posizionare una goccia d'olio sulla lente 40x e posizionare l'inserto del tavolino sul microscopio.

Collegare gli elettrodi. Impostare una profusione riscaldata per gravità di 1,2 millimolari di soluzione di calcio tiroscopico e collegare l'aspirazione al vuoto. Accendere il microscopio e il sistema di stimolazione cellulare.

Aprire il software della procedura guidata ionica. Caricare alcune gocce di alcune o due celle caricate sul tavolino bloccando il flusso di perfusione. Per consentire alle cellule sane di stabilirsi, ripristinare la profusione, molte delle cellule morte rimanenti verranno lavate via.

Utilizzare l'oculare per individuare una cellula sana a forma di bastoncino che si contrae spontaneamente durante la stimolazione da cinque a 20 volt, le cellule contratte dovrebbero essere evitate a causa della perdita della membrana. Modificare l'output visivo per la fotocamera. Regola la rotazione della lente in modo che la cella sia visibile nella finestra.

Regola l'apertura in modo che la maggior parte dello sfondo venga rimossa. Posizionare il marcatore di misurazione del sarcomero su un'area della cellula con sarcomeri uniformi. Se necessario, modificare le dimensioni della casella per assicurarsi che il marcatore non copra diverse popolazioni.

Allineare anche le barre di rilevamento dei bordi. Inizia a stimolare le celle da 10 a 15 secondi prima di iniziare l'esperimento. Avvia la registrazione.

Analizza l'accorciamento del sarcomero e le tracce del rapporto a due URA con il software di procedura guidata degli ioni. I possibili confronti tra cardiomiociti wild type e knockout includono il tempo di accorciamento frazionario al picco di accorciamento del tempo al 50% di rilassamento per l'analisi della contrattilità, nonché il tempo di picco al basale al picco e il tempo al 50% di paura basale o due rapporti per valutare il flusso di calcio. Le cellule prodotte con questo protocollo sono ideali per molti altri esperimenti e procedure, tra cui la colorazione per i componenti subcellulari e la coltura a breve termine.

Ora che hai visto questo video, dovresti essere in grado di isolare i cardiomiociti da topi wild type e knockout e di analizzare la contrattilità e i transitori del calcio di queste cellule. Buona fortuna con il tuo esperimento.