Name: Microscopio video intravitale misurazioni della retina flusso sanguigno nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Impara a misurare il flusso sanguigno retinico nei topi utilizzando microscopia video intravitale con microsfere fluorescenti. Questo metodo consente di quantificare diametri vascolari e velocità ematiche per studiare patologie oculari.

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Finanziato da NIH EY017599 (NRH).

Le procedure che coinvolgono l'uso di animali sono state esaminate e approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali di LSUHSC-S ed eseguite secondo i criteri delineati dal National Institutes of Health.
1. Preparazione delle Soluzioni di Perfusione
<ol>
	<li>Sonicare una soluzione madre all'1% (in peso) di microsfere di diametro 1,9 μm.</li>
	<li>Prelevare ~25-30 x 106 microsfere fluorescenti verdi (cioè ~10 μl della soluzione madre) in una siringa da 300 μl. Diluire le microsfere prelevando altri 240 μl di soluzione fisiologica nella siringa.</li>
	<li>Preparare una soluzione da 50 μl di destrano fluorescente 2 x 10 a6 pesi molecolari disciolto in soluzione fisiologica sterile, con la dose iniettata nell'intervallo 3-10 mg/kg. Tenere il destrano coperto con un foglio di alluminio fino al momento della sua infusione.</li>
</ol>
2. Anestesia animale e incannulamento vascolare
<ol>
	<li>Anestetizzare l'animale per l'inserimento chirurgico di cannule vascolari e per il posizionamento stazionario sotto un obiettivo microscopico. Sono disponibili molte scelte di protocolli anestetici, con vari vantaggi e svantaggi e potenziali effetti sui parametri sistemici. Tra le molte scelte diverse ci sono una combinazione di ketamina (100-150 mg/kg), xilazina (10 mg/kg) e acepromazina (2 mg/kg), o una combinazione di ketamina (50 mg/kg) e pentobarbital (50 mg/kg). Le procedure descritte sono acute e si concludono con l'eutanasia indotta da un sovradosaggio di pentobarbital (150 mg/kg) seguito da una toracotomia; L'inclusione di un analgesico non è necessaria per la procedura terminale.</li>
	<li>Mantieni un termoforo sotto l'animale per il resto dell'esperimento.</li>
	<li>Mantenere gli occhi umidi con soluzione fisiologica tamponata con fosfato durante i successivi inserimenti chirurgici di cannule vascolari.</li>
	<li>Preparare una cannula vascolare per le successive infusioni di traccianti fluorescenti. Un tubo di polietilene lungo 20 cm (ad esempio, 0,28 mm di diametro interno; 0,61 mm di diametro esterno) viene posizionato sulla punta di un ago da siringa, con l'estremità affilata dell'ago precedentemente spezzata piegandola avanti e indietro con un emostato.</li>
	<li>Riempire una siringa e un tubo con soluzione fisiologica eparinizzata (25 U/ml).</li>
	<li>Radere un lato del basso addome e praticare un'incisione per esporre la vena femorale.</li>
	<li>Per incannulare la vena femorale, legare il vaso con una sutura 5.0, praticare un'incisione parziale del vaso (circa la metà del diametro del vaso) e inserire il tubo nel vaso, fissando il tubo con la sutura legata attorno alla sezione cannulata.</li>
</ol>
3. Preparazione per la microscopia intravitale
<ol>
	<li>Dilatare la pupilla dell'occhio con una goccia di soluzione oftalmica di tropicamide all'1% seguita da una goccia di soluzione oftalmica di ipromellosa al 2,5%.</li>
	<li>Coprire l'occhio con un vetrino coprioggetti da 5 mm.</li>
	<li>Posiziona l'animale su una tavola di plexiglass, che sarà posizionata sotto l'obiettivo del microscopio di un microscopio verticale. Posizionare strategicamente la garza chirurgica sotto la testa per consentire un asse diretto attraverso l'obiettivo fino alla retina centrale e al disco ottico.</li>
	<li>Mettere a fuoco attraverso il microscopio sul disco ottico, trovando il disco con un obiettivo 4X a bassa potenza e utilizzando un filtro a fluoresceina.</li>
</ol>
4. Infusione di microsfere fluorescenti per misurare le velocità
<ol>
	<li>Utilizzando un obiettivo 4X, mettere a fuoco la retina con il disco ottico al centro del campo visivo.</li>
	<li>Infuse la soluzione di microsfere fluorescenti a una velocità di 250 μl/min/kg.</li>
	<li>Video-registra la retina visibile attorno al disco ottico, utilizzando un tempo di esposizione della fotocamera di ~8 msec.</li>
	<li>Interrompere l'infusione di microsfere quando è stata registrata una durata sufficiente del video (1-2 minuti); è probabile che una parte della soluzione di microsfera rimanga inutilizzata.</li>
</ol>
5. Infusione di un marcatore al plasma fluorescente per misurare i diametri
<ol>
	<li>Utilizzando un obiettivo 4X, mettere a fuoco la retina con il disco ottico al centro del campo visivo.</li>
	<li>Infondere la soluzione preparata di destrano fluorescente nella vena femorale come bolo per ~5 secondi, durante la registrazione video. Questo video aiuterà a determinare l'identità delle arteriole rispetto alle venule, con le arteriole che vengono perfuse per prime. Eseguire questo passaggio con il tempo di esposizione della fotocamera impostato su ~8 msec, anche se il tempo di esposizione preciso non è critico.</li>
	<li>Passa a un obiettivo 10X e a un tempo di esposizione di 20-40 msec per una migliore risoluzione per il video di ciascuna delle 4-7 arteriole e 4-7 venule nella retina superficiale. Mettere a fuoco (e videoregistrare) circa un quadrante della retina visibile alla volta, con il centro del disco ottico in un angolo del campo visivo. Si dovrebbe cercare di ridurre al minimo il tempo in cui la luce del microscopio illumina il tessuto per ridurre la possibilità di fototossicità indotta da luce/colorante17.</li>
</ol>
6. Analisi video
<ol>
	<li>Utilizzando una scala micrometrica, calibrare il sistema video per una conversione di μm/pixel.</li>
	<li>Con il software di elaborazione delle immagini, riprodurre il video registrato.</li>
	<li>Dal video dell'infusione in bolo di destrano fluorescente, identificare arteriole vs venule.</li>
	<li>Per ciascuna delle 4-7 arteriole e 4-7 venule registrate con l'obiettivo 10X, misurare i diametri riempiti con destrano fluorescente, con una media di 5 misure di diametro per vaso lungo la lunghezza visibile.</li>
	<li>Per ciascuna delle stesse arteriole e venule, misurare la lunghezza della striscia delle microsfere fluorescenti, utilizzando 10 strisce di microsfere successive in ciascun vaso per evitare distorsioni di selezione. Dividere le lunghezze delle strisce per il tempo di esposizione per calcolare la velocità della microsfera, ad esempio, 160 μm/8 msec = 20 μm/msec = 2 cm/sec. Fare la media delle 10 velocità per nave.</li>
	<li>Calcolare la portata volumetrica per ogni recipiente con la seguente equazione: flusso = velocità media × π × diametro2/4.</li>
	<li>Sommare le portate arteriolari e separatamente le portate venulari per ottenere il flusso sanguigno retinico totale.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+method+for+ocular+blood+flow+measurement+in+rats%3A+size+and+dose+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization.</a> Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).</li>
<li>Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+and+choroidal+vasoreactivity+to+altered+PaCO2+in+rat+measured+with+a+modified+microsphere+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique.</a> Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).</li>
<li>Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+retinal+blood+flow+by+kinin+B%281%29+receptor+in+Streptozotocin-diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats.</a> Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).</li>
<li>Pouliot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+regional+measurement+of+retinal+blood+flow+in+rats+using+N-isopropyl-p-%5B14C%5D-iodoamphetamine+%28%5B14C%5D-IMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP).</a> Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+and+quantitative+imaging+of+retinal+blood+flow+in+rats+with+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).</li>
<li>Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+intraocular+pressure+on+changes+of+blood+flow+in+the+retina%2C+choroid%2C+and+optic+nerve+head+in+rats+investigated+by+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).</li>
<li>Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+blood-flow+MRI+of+retinitis+pigmentosa+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats.</a> Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).</li>
<li>Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ocular+blood+flow+as+an+early+indicator+of+diabetic+retinopathy+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).</li>
<li>Wright, W. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+attenuates+early+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina.</a> Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).</li>
<li>Lee, S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losartan+and+ozagrel+reverse+retinal+arteriolar+constriction+in+non-obese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice.</a> Microcirculation. 15, 379-387 (2008).</li>
<li>Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+diabetes-induced+retinal+vasoconstriction+by+a+thromboxane+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist.</a> Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+streptozotocin-induced+microvascular+changes+in+the+mouse+retina+with+the+endothelin+receptor+A+antagonist+atrasentan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan.</a> Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).</li>
<li>Yadav, A. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tempol+on+diabetes-induced+decreases+in+retinal+blood+flow+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse.</a> Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+20-HETE+attenuates+diabetes-induced+decreases+in+retinal+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics.</a> Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).</li>
<li>Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+blood+flow+abnormalities+following+six+months+of+hyperglycemia+in+the+Ins2%28Akita%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse.</a> Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).</li>
<li>Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+reverses+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina.</a> Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Sial, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phototoxicity+of+fluorescent+dye-labeled+albumin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates.</a> Microcirculation. 6, 205-213 (1999).</li>
<li>Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+leukocyte+dynamics+in+the+retinal+capillaries+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice.</a> Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).</li>
<li>Walsh, M. K., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+fluorescence+imaging+of+individual+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).</li>
<li>Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+of+chorioretinal+vascular+oxygen+tension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rat.</a> Vis. Res. 19, 569-588 (1979).</li>
<li>Remtulla, S., Hallett, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+mouse%2C+and+comparisons+with+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat.</a> Vis. Res. 25, 21-31 (1985).</li>
<li>Schmucker, C., Schaeffel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biometry+in+the+mouse+eye+with+low+coherence+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry.</a> Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).</li>
<li>Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-+and+ischemia-induced+shedding+of+venular+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).</li>
<li>Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venular+constriction+of+submucosal+arterioles+induced+by+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate.</a> Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa tecnica di microscopia video intravitale può essere applicata non solo ai topi, ma anche ai ratti. Questo protocollo si basa solo su alcune ipotesi, ma è limitato all'uso in anestesia e con dilatazione della pupilla come lo abbiamo descritto. Le altre ipotesi e limitazioni sono le seguenti:
1. Assunzione di un errore minimo di ingrandimento ottico derivante dalla natura rifrattiva dell'occhio. Come descritto da altri18-20, il metodo di riempire lo spazio tra l...

La retina è uno dei tessuti metabolicamente più attivi del corpo, e di conseguenza richiede un generoso apporto di sangue. Due circolazioni separate soddisfano questa richiesta: la circolazione coroideale per la porzione esterna della retina e la circolazione retinica per la porzione interna della retina. Le indagini sulla perfusione retinica sono indispensabili per comprendere i meccanismi patologici e le conseguenze della retinopatia diabetica, della retinopatia indotta da ossigeno, dell'occlusione dell'arteria o della vena retinica e dell'ictus. Sono stati impiegati diversi metodi per quantificare il flusso sanguigno retinico, ognuno dei quali presenta vantaggi, svantaggi, limitazioni e presupposti. Tra queste tecniche vi sono l'infusione di microsfere di 7-8 μm di diametro che si depositano nelle arteriole precapillari1,2, l'autoradiografia quantitativa3,4, la microangiopatia ottica-tomografia a coerenza ottica5,6, la risonanza magnetica7,8 e la videomicroscopia intravitale9-16. I vantaggi di quest'ultimo includono la visualizzazione diretta dal vivo dei vasi retinici e del flusso, la dipendenza da poche ipotesi minori e l'accessibilità economica per i laboratori che dispongono di un microscopio a fluorescenza con una videocamera collegata. In precedenti studi di videomicroscopia intravitale9-16, il destrano fluorescente è stato utilizzato come marcatore plasmatico e i globuli rossi marcati in fluorescenza (da un animale donatore) sono stati utilizzati come marcatori di velocità. Nel protocollo attuale, per misurare la velocità vengono utilizzate microsfere marcate in fluorescenza di 1,9 μm di diametro, invece dei globuli rossi, con questa alterazione che annulla la necessità di un donatore di cellule del sangue.

<table><tbody><tr><td>Microsfere fluorescenti Bangs</td><td>Laboratories</td><td>FS04F/10584 (verde)</td><td></td></tr><tr><td>Sonde molecolari</td> <td>fluorescenti destrano ad alto peso molecolare</td><td>D-7137 (verde); D-7139 (rosso)</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di microscopio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN + accessori</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo 4X</td><td>Nikon</td><td>Plan Fluor 4X</td><td>apertura numerica 0,13; distanza di lavoro 17,2 mm</td></tr><tr><td>Obiettivo 10X</td><td>Nikon</td><td>Plan 10X</td><td>apertura numerica 0,25; distanza di lavoro 10,5 mm</td></tr><tr><td>Soluzione oftalmica Tropicamide</td><td>Bausch Lomb</td><td>1% Tropicamide</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione oftalmica ipromellosa</td><td>HUB Pharmaceuticals</td><td>2,5% Goniovisc</td><td></td></tr><tr><td>Software di elaborazione delle immagini</td><td>Università della California San Francisco Vale Lab</td><td>Micro-Manager</td><td></td></tr><tr><td>Videocamera digitale per microscopia</td><td>Fotometria</td><td>CoolSnap ES</td><td>Risoluzione 1392 x 1040 pixel; dimensione dei pixel 6,45 x 6,45 &mu; m</td></tr></tbody></table>

microscopio video intravitale misurazioni della retina flusso sanguigno nei topi

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Le alterazioni del flusso sanguigno retinico possono contribuire a, o essere una conseguenza di, malattie oculari e disfunzioni visive. Pertanto, la quantificazione della perfusione alterata può aiutare la ricerca sui meccanismi delle patologie retiniche. La microscopia video intravitale di traccianti fluorescenti può essere utilizzata per misurare i diametri vascolari e le velocità del flusso sanguigno del sistema vascolare retinico, in particolare le arteriole che si diramano dall'arteria centrale della retina e delle venule che portano alla vena centrale della retina. Le velocità del flusso sanguigno possono essere calcolate dai diametri e dalle velocità, con la somma del flusso arteriolare e del flusso venulare separato, fornendo i valori del flusso sanguigno retinico totale. Questo articolo e il video associato descrivono i metodi per applicare questa tecnica ai topi, che include 1) la preparazione dell'occhio per la microscopia intravitale dell'animale anestetizzato, 2) l'infusione endovenosa di microsfere fluorescenti per misurare la velocità del flusso sanguigno, 3) l'infusione endovenosa di un destrano fluorescente ad alto peso molecolare, per aiutare la visualizzazione microscopica della microvascolarizzazione retinica, 4) l'uso di una fotocamera digitale per microscopio per ottenere video della retina perfusa, e 5) l'uso di software di elaborazione delle immagini per analizzare il video. Le stesse tecniche possono essere utilizzate per misurare la velocità del flusso sanguigno retinico nei ratti.

Figura 1 mostra singoli fotogrammi di un video proveniente da un esperimento, con i pannelli da A a D e da F a I che mostrano tracce di microsfere fluorescenti acquisite con un obiettivo 4X&#160;e un tempo di esposizione di 8 msec (e binnaggio 2 x&#160;2 pixel per ridurre le dimensioni del file video). Figura 1E mostra l'orientamento dei vasi retinici negli altri pannelli della figura. Non ogni fotogramma del video presenterà una traccia fluorescente a fuoco; tuttavia, alcuni fotogrammi ...

La microscopia intravitale può essere utilizzata negli animali per visualizzare e misurare i diametri vascolari della retina, la velocità del flusso sanguigno e il flusso sanguigno retinico totale.

Microscopio video intravitale misurazioni della retina flusso sanguigno nei topi

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare il flusso sanguigno retinico nei topi. Ciò si ottiene infondendo prima microsfere fluorescenti attraverso la vena femorale cannulata di un topo anestetizzato. Il secondo passo consiste nel registrare video le microsfere che scorrono attraverso i vasi retinici del topo.Successivamente, infondere il destrano fluorescente attraverso la vena femorale e acquisire un video mentre scorre attraverso i vasi retinici. Il passaggio finale consiste nel misurare le velocità delle microsfere e i diametri dei vasi dai video registrati per un calcolo del flusso sanguigno retinico. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è la capacità di misurare con precisione il flusso sanguigno della retina utilizzando un microscopio a fluorescenza standard.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della retina, come la misura in cui i cambiamenti nel flusso sanguigno contribuiscono alla retinopatia diabetica. Anche se dimostreremo questa tecnica nella retina di un topo. Il metodo generale può essere utilizzato in altri tessuti e anche nei ratti.Sonicare una soluzione madre all'1% di microsfere di 1,9 micron di diametro, prelevare

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Questo articolo riporta un metodo dettagliato per la misurazione dinamica e la quantificazione della velocità del flusso sanguigno all'interno dei singoli vasi sanguigni del sistema vascolare epatico di topo utilizzando l'imaging al microscopio intravitale in combinazione con una metodologia specifica per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.

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Etichettatura fluorescente colorante di eritrociti e leucociti per studiare la dinamica del flusso nella circolazione retinica del mouse

Molte malattie oculare visione-minacciose sono associata con disfunzionali microvasi retinici. Pertanto, la misura delle risposte arteriola retinica è importante approfondire i meccanismi fisiopatologici sottostanti. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per mouse arteriola retinica isolamento e la preparazione per valutare gli effetti di sostanze vasoattive il diametro vascolare.

Procedura di preparazione per la misura della reattività in Mouse arteriole retiniche Ex Vivo

Un approccio a finestra vaso aperta che utilizza traccianti fluorescenti fornisce una risoluzione sufficiente per la misurazione del flusso sanguigno cocleare (CoBF). Il metodo facilita lo studio dei cambiamenti strutturali e funzionali del CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche.

Misurazione del flusso sanguigno striale nella coclea di topo utilizzando una finestra del vaso aperta e microscopia a fluorescenza intravitale

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione e la colorazione con immunofluorescenza dei supporti piatti retinici dei topi e l'analisi. Anche l'uso della fluorangiografia del fondo oculare (FFA) per i cuccioli di topo e l'elaborazione delle immagini sono descritti in dettaglio.

Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno

Questo articolo descrive un saggio di colorazione lectina ben consolidato e riproducibile per l'intero monte di preparati retinici e i protocolli necessari per la misurazione quantitativa di parametri vascolari frequentemente alterati nelle retinopatie proliferative e non proliferative.

Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

Qui, presentiamo tre protocolli di analisi dei dati per l'angiografia fluoresceina (FA) e le immagini di tomografia a coerenza ottica (OCT) nello studio dell'occlusione venosa retinica (RVO).

In vivo Letture di lesioni vascolari nella retina del topo per promuovere la riproducibilità

La vascolarizzazione retinica del topo è particolarmente interessante per comprendere i meccanismi di formazione del pattern vascolare. Questo protocollo misura automaticamente il diametro dei vasi retinici di topo da immagini del fondo oculare dell'angiografia fluorescente a una distanza fissa dal disco ottico.

Misurazione del diametro dei vasi retinici da immagini di angiografia fluorescente di topo

Impara a misurare il flusso sanguigno retinico nei topi utilizzando microscopia video intravitale con microsfere fluorescenti. Questo metodo consente di quantificare diametri vascolari e velocità ematiche per studiare patologie oculari.

Microscopio video intravitale misurazioni della retina flusso sanguigno nei topi

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