Name: Dissezione dei Xenopus laevis Cresta neurale per In vitro Espianto Cultura o In vivo Trapianto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Impara la dissezione della cresta neurale di Xenopus laevis per studiare la migrazione cellulare in vitro e in vivo. Questo metodo consente di analizzare lo sviluppo embrionale e le transizioni epitelio-mesenchima.

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Gli autori ringraziano Adeline Dolly per le foto di espianto di fibronectina, Eric Theveneau per utili discussioni e il Fondo Animal dell&#39;Institut Curie. CM è un borsista postdottorato della Regione Ile de France (Domaine d&#39;interet Majeur Stelo Pole), Université Paris Sud (addetto Temporaire d&#39;Enseignement et de Recherche), e Agence Nationale de la Recherche. Questo lavoro è stato finanziato dalla Université Paris Sud (Attractivite 2011), il Centre National de la Recherche Scientifique (Programma d&#39;azione thématique et sur fonti di incentivi), Association pour la Recherche contre le Cancer di Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, e Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche programma Blanc).

Gli esperimenti sono conformi alla normativa nazionale ed europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e con i principi sanciti a livello internazionale di sostituzione, riduzione e perfezionamento. 1. Preparazione di piatti fibronectina rivestite 14 <ol><li> Pipettare 500 ml di 10 mg / ml grado fibronectina cultura diluito in 1x tampone fosfato (PBS) in un piatto di plastica standard di Petri (Ø 40 x 11 mm). Incubare a 37 ° C per 1 ora. Nota: se si utilizza piatti di vetro o vetrini per l&#39;imaging successiva, utilizzare un / soluzione fibronectina ml 100 mg. </li><li> Lavare tre volte con PBS 1x. </li><li> Sostituire PBS con 500 ml di 1x PBS/0.1% di sieroalbumina bovina (BSA). Incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Lavare tre volte con PBS 1x. </li><li> Riempire con 1x PBS e conservare a 4 ° C fino all&#39;uso (di solito per 24-48 ore). </li></ol> 2. La dissezione degli espianti NC &lt;ol&gt; <li> Preparare 3/4 Normale Anfibio Medium (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 MgSO mm 4, 0.1 mM EDTA, 1 NaHCO mm 3, 0.2x PBS, 50 mg / ml gentamicina 10,15). Non tenere più di 1 settimana per la dissezione, conservare a 4 ° C. NAM Older può essere utilizzato per la preparazione di piatti dissezione agarosio rivestite (in basso). </li><li> Preparare 60 millimetri piastre Petri per la dissezione, rivestiti con 10 ml di 2% agarosio in 3/4 NAM. </li><li> Raccolte strumenti di dissezione: pipette Pasteur in plastica, un perno insetto migliore montato su supporto del perno (vedi tabella materiali per riferimento), un &quot;coltello sopracciglio&quot; (fatta con capelli sopracciglio inclusi in paraffina sulla punta di una pipetta Pasteur di vetro 16), due belle Pinza per dissezione, P1000 pipetta e suggerimenti, uno stereoscopio binocolo con ingrandimento 8-40X a 50, una sorgente di luce brillante con fibre ottiche e guide. Tutti gli strumenti di dissezione devono essere tenuti puliti, dopo ogni esperimento, sciacquare due volte con acqua distillata, una volta with 100% di etanolo e lasciare asciugare. Conservare lontano dalla polvere. </li><li> Compila il piatto dissezione con NAM fresco quasi al top. </li><li> Ottenere X. laevis embrioni secondo procedure standard 10 e li invecchiare fino a raggiungere neurula fase 16 (vedere Nieuwkoop e Faber tabella di sviluppo 17). </li><li> Posizionare fase 16 embrioni nel piatto dissezione con il pipetta Pasteur di plastica. </li><li> Eseguire tutti i passaggi successivi sotto l&#39;ambito binoculare. Rimuovere la membrana vitellina con due coppie di pinze. Fare attenzione a non danneggiare la parte dorsale degli embrioni. </li><li> Attendere fino a quando gli embrioni hanno raggiunto la fase 17 per iniziare la dissezione. Fase 17 è corretto poiché la cresta neurale è chiaramente distingue dal tubo neurale, in contrasto con le fasi precedenti. Dopo la tappa 17, NC inizia la migrazione e mescolanza con mesenchima circostante. </li><li> Scavare un piccolo foro nel agarosio con una pinza per fare una nicchia per gli embrioni per mantenereloro durante la dissezione. Posizionare un embrione dorsale verso l&#39;alto. Nota: modellare l&#39;argilla può essere utilizzato per mantenere gli embrioni invece scavando un buco nel agarosio. </li><li> Fare un&#39;incisione nella parte laterale della piega neurale anteriore con il coltello sopracciglio e il perno insetti. Fare attenzione a non andare troppo in profondità l&#39;embrione: lo scopo di tagliare 2-3 strati di cellule (mai raggiungere il profondo come il archenteron!). Durante l&#39;intero processo di dissezione, non permettono ai tessuti dissezionati di entrare in contatto con l&#39;interfaccia aria-liquido dal X. tessuti embrionali laevis sono lisate mediante tensione superficiale. </li><li> Fare una seconda incisione parallela nella parte più dorsale della piega neurale con gli stessi strumenti. </li><li> Se necessario, ruotare il piatto di circa 90 °. Effettuare una terza incisione perpendicolare con il coltello sopracciglio e il perno insetto, sul lato posteriore delle prime due incisioni. La NC è una massa densa di cellule sotto lo strato esterno pigmentato della ectoderma, lateraleal tubo neurale. </li><li> Utilizzare la punta del coltello sopracciglio per staccare lo strato pigmentato ectoderm dal sottostante, NC, a partire dal terzo bordo incisione. </li><li> Utilizzare il lato del coltello sopracciglio per staccare il tessuto NC partire dal terzo incisione. Il tessuto NC è piuttosto grigiastro, mentre il mesoderma cefalico sottostante è bianco. Separare con attenzione il NC dal mesoderma. </li><li> Staccare il tessuto NC anteriormente dalla vescicola ottica, e tagliare a questo livello per liberare l&#39;espianto. Come controllo per i primi esperimenti, controllando l&#39;espressione snail2 (un marcatore canonico NC) in alcuni espianti l&#39;ibridazione in situ è raccomandato. </li></ol> 3. Espianti placcatura su fibronectina <ol><li> Inserire nel piatto fibronectina rivestite con Modified Danilchick Medium (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO 3 5 mm, K gluconato 4,5 mm, Na gluconato 32 mm, MgSO 4 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, regolare il pH a 8,3 con 1 M Bicine <sup&gt; 18). </li><li> Trasferire gli espianti nel piatto fibronectina rivestite con una pipetta P1000. Non lasciare mai che gli espianti di toccare l&#39;interfaccia aria-liquido. Primo, pipettare po &#39;di liquido nella punta, poi gli espianti, poi alcuni di nuovo liquido. Non lasciare che l&#39;aria nella punta durante il trasferimento espianti nel piatto fibronectina rivestite. Una volta che la punta è all&#39;interno del liquido del piatto fibronectina rivestite, lasciare che gli espianti lentamente scendono per gravità, o spingere molto delicatamente. Evitare di espellere gli espianti troppo veloce. </li><li> Mettere 10-30 espianti nel piatto con il coltello sopracciglio. Evitare i lati del piatto, che non sono adeguate per l&#39;imaging successiva. </li><li> Cercate di non spostare la parabola fino a quando gli espianti hanno attaccato la fibronectina (ci vogliono circa 15-30 min). Se necessario, spostare il piatto con molta attenzione. </li><li> Porre la capsula in un incubatore refrigerato (tra 15-20 ° C, per la tabella delle temperature vedi 17). Quando posto a 15 ° C, le cellule are di solito la migrazione in modo efficiente e di scattering, dopo 6 ore di incubazione (questa tempistica può variare tra esperimenti). </li></ol> 4. L&#39;innesto espianti in embrioni Host <ol><li> Tagliare un bel vetrino di vetro in pezzi molto piccoli che utilizzano pinze grossolani. Le dimensioni dei pezzi dovrebbe essere di circa 1,5 mm 2. Immergere i pezzi in una capsula di Petri contenente tre quarti NAM o PBS usando le pinze. </li><li> Preparazione dell&#39;embrione ospitante: sezionare l&#39;ospite NC 3/4 NAM come descritto al punto 3), con particolare attenzione a non danneggiare l&#39;embrione di accoglienza durante la rimozione della membrana vitellina e sviscerare il NC. La tensione del tessuto tende ad aumentare la dimensione dell&#39;ablazione: lasciare l&#39;embrione ospite guar parzialmente mentre sezionare l&#39;embrione donatore. </li><li> In un altro piatto agarosio rivestite o in un&#39;altra parte dello stesso piatto, sezionare l&#39;espianto NC dall&#39;embrione donatore come descritto nel protocollo 3. Trasferire l&#39;innesto NC nella capsula contenente l&#39;host con cura, come descritto inProtocollo 3. </li><li> Porre immediatamente l&#39;espianto NC sulla zona ablazione host utilizzando una pinza. L&#39;espianto deve allegare parzialmente. Mettere un pezzo di vetro coprioggetto sul embrione innestato a mantenere l&#39;innesto in posizione. Scegliere un pezzo di vetro più grande di embrione per evitare di danneggiarlo. L&#39;embrione sarà un po &#39;appiattito. </li><li> Attendere almeno 15-20 minuti, quindi rimuovere delicatamente il vetrino. Lasciate che l&#39;embrione recuperare per altri 10 minuti e pipettare con cura in un piatto pulito riempito con 3/4 NAM, utilizzando la pipetta Pasteur di plastica. </li></ol>

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<li>Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Xenopus+hnRNP+expressed+in+neural+and+neural+crest+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues.</a> Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).</li>
<li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions%3A+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive una tecnica facile da espiantare premigratory cranica NC in X. laevis embrioni. Gli embrioni utilizzati per tali esperimenti devono essere robusti e guarire bene. Eliminare ogni partita di embrioni sani. Inoltre, crescere embrioni a diverse temperature (da 12 a 18-20 ° C), al fine di asportare cresta neurale nella fase 17 e non più tardi. Dopo stadio 17, cresta neurale può essere miscelata con mesoderma cefalico e non può essere rimosso completamente. Tessuti Xenopus guarisco...

La cresta neurale (NC) è una popolazione di cellule embrionali transitoria che emerge dal tubo neurale a fine neurulazione negli embrioni dei vertebrati. Gli eventi di segnalazione e genetici che controllano specifiche NC iniziano già nel gastrulazione. La NC è specificato al confine tra la neurale e ectoderma neurale non da segnali dai tessuti dorsali circostanti. Alla fine del neurulazione, celle NC subiscono una transizione epitelio-to-mesenchima (EMT) e migrano ampiamente nell&#39;embrione seguendo percorsi stereotipati rispondendo al circostante spunti guida. Una volta che hanno raggiunto la loro destinazione finale, si differenziano in una vasta gamma di derivati, ad esempio, i neuroni, glia, ossa, cartilagine e cellule pigmentate 1-5. A causa del loro contributo a molti tipi di cellule e tessuti embrionali, difetti in ogni fase di sviluppo celle NC, dalla induzione alla differenziazione finale, può causare sindromi congenite denominate neurocristopathies 6. Emanipolazione Xperimental del CN ​​sviluppare in fasi diverse - specifica, EMT, migrazione e differenziamento - permetterà di migliorare la nostra comprensione di neurocristopathies e permettere la progettazione di potenziali strategie terapeutiche. L&#39;embrione laevis Xenopus è un modello di scelta per studiare lo sviluppo NC. Un gran numero di embrioni sono facili da ottenere, e la fecondazione esterna dà accesso alle prime fasi di sviluppo. Molti strumenti sono a disposizione per manipolare sperimentalmente X. laevis sviluppo embrionale. Gene guadagno-di-funzione e atterramento sono facili da eseguire da microinjecting singole cellule dei primi blastulas. Tessuti embrionali possono essere tagliati per riassociazione in vitro 7-11 o saggi di back-innesto 12,13. In questo protocollo, si descrive come sezionare fuori premigratory cranica NC in X. laevis neurulas fine, prima della migrazione. Tali espianti possono essere coltivate su fibronectina-coated piastre per studiare la migrazione e la differenziazione in vitro controllati in condizioni sperimentali. Espianti NC possono anche essere innestati in normali o manipolato gli embrioni di accoglienza per studiare la loro migrazione e differenziamento in vivo.

<table><tbody><tr><td>Fibronectina dal plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>F4759-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina, frazione V</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-C</td><td>Il grado di qualità inferiore può essere adatto a questa applicazione</td></tr><tr><td>Perni per insetti in acciaio inossidabile, dimensione 000</td><td>FST</td><td>26001</td><td></td></tr><tr><td>pinza Dumont #5 0,05 mm x 0,02 mm</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione dei<em&gt; xenopus laevis</em&gt; cresta neurale per<em&gt; in vitro</em&gt; espianto cultura o<em&gt; in vivo</em&gt; trapianto

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

La cresta neurale (NC) è una popolazione cellulare dorsale tubo neurale transitoria che subisce una transizione epitelio-to-mesenchima (EMT) alla fine di neurulazione, migra verso estesamente vari organi, e si differenzia in molti tipi di derivati ​​(neuroni, glia, cartilagine e osso, le cellule pigmentate ed endocrine). In questo protocollo, si descrive come sezionare il premigratory cranica NC da Xenopus laevis embrioni, al fine di studiare lo sviluppo NC in vivo e in vitro. Il modello di rana offre molti vantaggi per studiare lo sviluppo precoce; lotti abbondanti sono disponibili, gli embrioni si sviluppano rapidamente, il guadagno in vivo e la perdita di strategie funzionali consentono la manipolazione dell&#39;espressione genica prima di NC dissezione del donatore e / o embrioni di accoglienza. Gli espianti NC possono essere piastrate su fibronectina e utilizzati per studi in vitro. Essi possono essere coltivate per diversi giorni in un mezzo definito privo di siero. Abbiamo anche descritto come innestare espianti NC indietroin embrioni di accoglienza per lo studio della migrazione NC e la differenziazione in vivo.

Quando placcato in fibronectina, gli espianti cresta neurale attaccano rapidamente (15-30 min) e l&#39;espianto si diffonde piatta entro 2 ore (Figura 1A). Dopo 3-6 cellule hr cominciano a disperdersi. A 24 ore a 15 ° C, molte cellule hanno iniziato a migrare dalla espianto (Figure 1B e 1C). Tuorlo rende le cellule molto luminoso in contrasto di fase (Figura 1B). Sporgenze cellulari (filopodes e lamellipodes) sono chiaramente visibili dopo falloidina co...

Questo protocollo descrive come sezionare premigratory cresta neurale cranica (NC) da Xenopus laevis neurulas. Tali espianti possono essere placcati in fibronectina e coltivate in vitro, o innestate di nuovo in embrioni di accoglienza. Questa tecnica consente di studiare i meccanismi di NC epitelio a mesenchima transizione, migrazione e differenziazione.

Dissezione dei<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cresta neurale per<em&gt; In vitro</em&gt; Espianto Cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trapianto

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

L'obiettivo generale della procedura seguente è quello di tracciare la migrazione delle cellule della cresta neurale opus Lavis. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando le creste neurali da embrioni allo stadio neurale. Nel secondo passaggio, gli espianti vengono seminati in una piastra rivestita con fibronectina per studiare la migrazione cellulare in vitro.In alternativa, dopo la rimozione della cresta neurale da un embrione ospite, gli espianti possono essere trapiantati nuovamente per seguire la loro migrazione in vivo. In definitiva, si può studiare il contributo della migrazione delle cellule della cresta neurale embrionale nello sviluppo dell'opus lavis. Generalmente, le persone nuove a questo metodo potrebbero trovarlo difficile perché gli embrioni precoci sono fragili.La cresta neurale è una popolazione cellulare piuttosto ridotta e bisogna preparare da soli gli strumenti per la dissezione. La dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale. Ogni elemento del processo di dissezione è stato ottimizzato per garantire un'asportazione accurata della cresta neurale.Nel giorno dell'esperimento, prendere una piastra di dissezione da 60 millimetri rivestita con circa

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Culture Explant neurali di<em&gt; Xenopus laevis</em

Il mesenchima cranica subisce movimenti morfogenetici drammatici che fornisce probabilmente una forza trainante per l'elevazione delle pieghe...

Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

Xenopus laevis fornisce un sistema modello ideale per studiare il destino specificazione delle cellule e la funzione fisiologica delle singole cellule retiniche in colture cellulari primarie. Presentiamo qui una tecnica per la dissezione e la generazione di tessuti retinici colture cellulari primarie che vengono esposte ad attività calcio e analizzati mediante ibridazione in situ.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

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Isolamento delle pieghe neurali craniche da un embrione di pollo per una coltura di cellule neurali in cresta

Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che...

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

Una tecnica per il trapianto "Extreme anteriore dominio" dei tessuti del viso tra Xenopus laevis embrioni è stato sviluppato. Tessuto può essere spostato da un gene espressione sfondo in un'altra, permettendo lo studio delle esigenze locali di sviluppo craniofacciale e di segnalazione interazioni tra regioni facciali.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Negli embrioni di Xenopus, le cellule del tetto del blastocele sono pluripotenti e possono essere programmate per generare vari tessuti. Qui, descriviamo i protocolli per utilizzare gli espianti di tetti di blastocele di anfibi come sistema di analisi per studiare le caratteristiche chiave in vivo e in vitro dello sviluppo neurale precoce.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

La transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT) consente ai tumori di diventare invasivi. Per studiare l'EMT, viene descritto un modello in vitro basato su cellule staminali neurali (NSC) privo di siero ed enzimi. Questo sistema standardizzato consente la valutazione quantitativa e qualitativa della migrazione cellulare, dell'espressione genica e proteica. Il modello è adatto per la scoperta di farmaci.

Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery

Questo protocollo descrive la dissezione e la coltura delle cellule creste neurali craniche dai modelli murini, principalmente per lo studio della migrazione cellulare. Descriviamo le tecniche di imaging dal vivo utilizzate e l'analisi dei cambiamenti di velocità e forma delle cellule.

Dissezione, cultura e analisi delle cellule staminali primarie dal mouse per lo studio della delaminazione e della migrazione delle cellule creste neurali

Vi presentiamo un protocollo in due parti che combina l'imaging fluorescente del calcio con l'ibridazione in situ, permettendo allo sperimentatore di correlare i modelli di attività del calcio con i profili di espressione genica a livello unicellulare.

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Impara la dissezione della cresta neurale di Xenopus laevis per studiare la migrazione cellulare in vitro e in vivo. Questo metodo consente di analizzare lo sviluppo embrionale e le transizioni epitelio-mesenchima.

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