Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti

La tecnica istituita per inoculare ortotopici xenotrapianti carcinoma vescicale invasivo primarie richiede laparotomia e la mobilitazione della vescica. Questa procedura infligge significativa morbilità sui topi, è tecnicamente difficile e richiede molto tempo. Abbiamo quindi sviluppato una alta precisione, approccio percutaneo utilizzando guida ecografica.

L'obiettivo generale di questa procedura è creare xenotrapianti di cancro ortotopico della vescica in modo rapido, preciso e minimamente invasivo. Ciò si ottiene espandendo prima la particolare linea cellulare tumorale e la sospensione delle cellule tumorali in Matrigel. Successivamente, l'animale viene montato sulla piattaforma di imaging e la vescica viene visualizzata con gli ultrasuoni.

Quindi gli strati mucosi e muscolari della vescica vengono separati con un'iniezione di soluzione fisiologica. Infine, la sospensione di matrigel delle cellule tumorali viene iniettata in questo spazio creato artificialmente. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la crescita del tumore attraverso l'ecografia e la bioluminescenza.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come l'uso della laparotomia per l'inoculazione di xenotrapianti primari, è che questo approccio è rapido, preciso e minimamente invasivo. Le implicazioni di queste tecniche si estendono alla diagnosi e alla terapia del cancro della vescica perché gli autoxenotrapianti sono il gold standard per lo studio preclinico di nuovi trattamenti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di iniezione sono piuttosto difficili da imparare e l'acqua era molto sottile, dimostrando questa procedura sarà.

Igor Mosca ha un assistente di ricerca e Wolfgang Yeager, un borsista post-dottorato. Entrambi sono urologi Dopo aver confermato l'identità delle rispettive linee cellulari di cancro alla vescica umana. Per questo studio attraverso l'impronta digitale del DNA, utilizzare un costrutto lentivirale che trasporta il gene della luciferasi della lucciola per l'analisi della crescita in bioluminescenza di tumori xenotrapianto per trasfettare le linee cellulari.

Quando si è pronti per iniziare la procedura, scongelare e utilizzare DMEM con il 10% di FBS per espandere le linee cellulari esistenti, incubare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2. Per preparare una sospensione cellulare per l'iniezione dopo lo scongelamento, matrigel e mantenendo gli occhi di tripsina sul ghiaccio, il 70% delle cellule di confluenza e utilizzare il normale mezzo di crescita per sospendere, quindi contare le cellule e far girare la sospensione a 200 volte G per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere la quantità appropriata di volumi uguali di D-M-E-M-F-B-S e MATRIGEL per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata per l'iniezione di un volume di 40 microlitri per animale.

Mescolare bene ed evitare di creare bolle d'aria da qualsiasi tipo di materiale plastico piatto e rigido. Tagliare uno stabilizzatore della vescica, ispezionare attentamente la cinghia e rimuovere eventuali spigoli vivi prima dell'applicazione sui topi. Dopo aver anestetizzato topi femmina con isoflurano al 3% in ossigeno ed eseguito un pizzicamento delle dita.

Per garantire un'adeguata sedazione, montare l'animale sul tavolo di imaging riscaldante della piattaforma di imaging per piccoli animali, monitorandone continuamente i segni vitali con un elastico. Fissare gli arti inferiori e utilizzare clorexidina gluconato allo 0,5% per disinfettare l'addome prima di utilizzare una punta di cotone sterile per pulire la pelle. Successivamente, utilizzando la cinghia di stabilizzazione della vescica, immobilizzare la vescica per evitare un'evasione di essa durante l'iniezione intramurale.

Quindi applicare il gel sterile per ultrasuoni sul basso addome. Avanza lentamente l'ecografia, dirigiti verso la pelle e visualizza la vescica sullo schermo dell'ecografia. Se la vescica è vuota, utilizzare 50 microlitri di PBS caldo in un angiocatetere transuretrale calibro 24 per riempirlo e separare gli strati della parete vescicale.

Inizia collegando una siringa da 1,0 millilitri riempita di PBS e collegata a un ago da 30 gauge da tre quarti di pollice al morsetto della siringa. Posizionare l'ago verso la pelle appena sopra l'osso pubico. Con un angolo compreso tra 30 e 45 gradi, rilevare l'ago sullo schermo ecografico prima di perforare lentamente la pelle e i muscoli della parete addominale.

Quindi, ruotare lo smusso dell'ago di 180 gradi in modo che sia rivolto posteriormente e inserire la punta dell'ago nella parete della vescica senza penetrare nella mucosa. Quindi, per creare uno spazio artificiale, iniettare lentamente 50 microlitri di PBS tra lo strato muscolare e la mucosa prima di ritirare l'ago. Per iniettare le cellule tumorali della vescica, collegare una seconda siringa da 1,0 millilitri riempita con la sospensione di matrigel per cellule tumorali e un ago da 30 gauge da tre quarti di pollice al morsetto della siringa.

Guidare la punta dell'ago fino allo spazio riempito con PBS. Appena creato e iniettare 40 microlitri di sospensione nello spazio. Quindi estrarre l'ago dopo aver smontato il mouse dalla piattaforma di imaging.

Conservalo in un ambiente caldo e confortevole sotto monitoraggio continuo. Dopo aver ripreso conoscenza e la normale deambulazione, rimetti l'animale nella sua gabbia di casa. L'iniezione intramurale di tre diverse linee cellulari tumorali è stata eseguita in 50 animali sotto guida ecografica per tre giorni consecutivi.

L'inoculazione è stata eseguita in modo efficiente e non è stata associata ad alcuna complicanza intra o post intervento. Il monitoraggio della crescita tumorale è stato eseguito mediante ecografia e bioluminescenza. Il terzo giorno, un tumore poteva essere rilevato mediante ecografia nella vescica anteriore di tutti i 50 animali e il 98% dei topi mostrava una crescita tumorale costante durante il periodo di follow-up successivo all'inoculazione di UC. Tre.

Luke un topo ha sviluppato una disseminazione tumorale intraperitoneale e il tumore si è involuto dopo il settimo giorno in un secondo animale. Questo è stato il primo gruppo di topi inoculati con questa nuova tecnica dopo l'inoculazione di uc. Tre. Luca uc, un Luca, e uc.

13 Luca. I topi sono stati sacrificati rispettivamente nei giorni 24, 28 e 37. I tumori xenotrapianti sono stati prelevati ed esaminati tramite sezioni h e d.

Tutti i tumori erano muscolo-invasivi e alcuni si infiltravano nel grasso perviscerale, ma non è stata osservata alcuna invasione negli organi adiacenti. Il 60% della UC, il 13 di Luke e il 20% della CU. Tre topi portatori di tumore Luke hanno sviluppato metastasi linfonodali retroperitoneali, che sono state confermate dalla colorazione h ed e.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre minuti. La familiarità con l'ecografia è un prerequisito per l'esecuzione di questa procedura Dopo che i tumori sono stati inoculati in questo modo, l'ecografia ci consente non solo di monitorare la crescita del tumore nel tempo, ma anche di osservare la perfusione tumorale con microbolle. Ci permette anche di eseguire iniezioni intratumorali con nuovi agenti sperimentali.