Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti

L'obiettivo generale di questa procedura è creare xenotrapianti ortotopici di cancro della vescica in modo rapido, preciso e minimamente invasivo. Questo viene ottenuto innanzitutto espandendo la specifica linea cellulare tumorale e sospendendo le cellule tumorali in Matrigel. Successivamente, l'animale viene posizionato sulla piattaforma di imaging e la vescica viene visualizzata mediante ultrasuoni.

Quindi, gli strati mucosale e muscolare della vescica vengono separati mediante un'iniezione di soluzione salina. Infine, la sospensione di cellule tumorali in matrigel viene iniettata in questo spazio artificialmente creato. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la crescita tumorale mediante imaging ecografico e bioluminescenza.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come l'uso della laparotomia per l'inoculazione di xenotrapianti primari, è che questo approccio è rapido, preciso e minimamente invasivo. Le implicazioni di queste tecniche si estendono alla diagnosi e alla terapia del cancro della vescica poiché gli autoxenotrapianti rappresentano lo standard di riferimento per lo studio preclinico di nuovi trattamenti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi dell'iniezione sono molto difficili da apprendere e la parete della vescica è estremamente sottile. La dimostrazione di questa procedura sarà quindi essenziale.

Igor Mosca ha un assistente di ricerca e Wolfgang Yeager, un ricercatore postdottorato. Entrambi sono urologi. Dopo aver confermato l'identità delle rispettive linee cellulari di carcinoma della vescica umana mediante analisi del profilo del DNA, utilizzare un costrutto lentivirale portatore del gene della luciferasi della lucciola per l'analisi della crescita mediante bioluminescenza dei tumori xenotrapiantati per trasfettare le linee cellulari.

Quando si è pronti per iniziare la procedura, scongelare e utilizzare il DMEM con il 10% di FBS per espandere le linee cellulari esistenti, incubando a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con 5% di CO2. Per preparare una sospensione cellulare da iniettare dopo lo scongelamento, aggiungere matrigel e mantenere in ghiaccio la tripsina; raccogliere le cellule a una confluenza del 70% e sospenderle nel normale mezzo di crescita, quindi contare le cellule e centrifugare la sospensione a 200 × g per cinque minuti. Dopo aver rimosso il soprannatante, aggiungere la quantità appropriata di volumi equi di D-M-E-M-F-B-S e MATRIGEL per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata, necessaria per iniettare un volume di 40 microlitri per animale.

Mescolare bene ed evitare di creare bolle d'aria utilizzando un materiale plastico piatto e rigido qualsiasi. Tagliare con cura un stabilizzatore della vescica, ispezionare attentamente la cinghia e rimuovere eventuali bordi taglienti prima dell'applicazione sui topi. Dopo aver anestetizzato i topi femmina con isoflurano al 3% in ossigeno ed eseguito una compressione del dito del piede.

Per garantire una sedazione adeguata, posizionare l'animale sul tavolo riscaldato della piattaforma di imaging per piccoli animali, monitorandone continuamente i parametri vitali con un laccio di gomma. Fissare gli arti inferiori e utilizzare clorhexidina gluconato allo 0,5% per disinfettare l'addome prima di asciugare la cute con un batuffolo di cotone sterile. Successivamente, utilizzando la cinghia di stabilizzazione della vescica, immobilizzare la vescica per evitare spostamenti durante l'iniezione intramurale.

Applicare quindi del gel ecografico sterile sull'addome inferiore. Avanzare lentamente la sonda ecografica, appoggiandone la testa sulla pelle, e visualizzare la vescica sullo schermo ecografico. Se la vescica è vuota, utilizzare 50 microlitri di PBS tiepido in un catetere angio da 24 gauge transuretrale per riempirla e separare gli strati della parete vescicale.

Iniziare fissando una siringa da 1,0 millilitro riempita con PBS e collegata a un ago da 30 gauge lungo tre quarti di pollice al morsetto per siringa. Posizionare l'ago verso la cute appena sopra l'osso pubico. Con un angolo compreso tra 30 e 45 gradi, individuare l'ago sullo schermo dell'ecografo prima di perforare lentamente la cute e i muscoli della parete addominale.

Successivamente, ruotare il bisellino dell'ago di 180 gradi in modo che sia rivolto posteriormente, e inserire la punta dell'ago nella parete della vescica senza penetrare la mucosa. Poi, per creare uno spazio artificiale, iniettare lentamente 50 microlitri di PBS tra il strato muscolare e la mucosa prima di ritirare l'ago. Per iniettare le cellule tumorali della vescica, collegare una seconda siringa da 1,0 millilitro riempita con la sospensione di cellule tumorali in matrigel, e un ago da 30 gauge lungo tre quarti di pollice al morsetto della siringa.

Guidare la punta dell'ago verso lo spazio riempito con PBS appena creato e iniettare 40 microlitri della sospensione nello spazio. Successivamente, ritirare l'ago dopo aver rimosso il topo dalla piattaforma di imaging.

Mantenerlo in un ambiente caldo e confortevole sotto monitoraggio continuo. Dopo il recupero della coscienza e della normale deambulazione, riposizionare l'animale nella sua gabbia di provenienza. L'iniezione intramurale di tre linee cellulari tumorali diverse è stata eseguita in 50 animali sotto guida ecografica per tre giorni consecutivi.

L'inoculazione è stata eseguita in modo efficiente e non è stata associata a complicanze intra o post-interventistiche. Il monitoraggio della crescita tumorale è stato effettuato mediante imaging ecografico e bioluminescenza. Al terzo giorno, un tumore è stato rilevato mediante ecografia nella vescica anteriore di tutti e 50 gli animali, e il 98% dei topi ha mostrato una crescita tumorale costante durante il periodo di follow-up successivo all'inoculazione di uc.Three.

In un topo di Luke si è sviluppata una disseminazione tumorale intraperitoneale e il tumore si è involuto dopo il giorno sette in un secondo animale. Questo è stato il primo gruppo di topi inoculati con questa nuova tecnica dopo l'inoculazione di uc.Three. Luke uc, un Luke e uc.

13 Luke. I topi sono stati sacrificati rispettivamente ai giorni 24, 28 e 37. I tumori xenotrapiantati sono stati prelevati ed esaminati mediante sezioni ematossilina ed eosina.

Tutti i tumori erano infiltranti il muscolo e alcuni si estendevano nel grasso periviscerale, ma non è stata osservata alcuna invasione negli organi adiacenti. 60% dei uc, 13 Luke e 20% dei uc. In tre topi portatori di tumore Luke si sono sviluppate metastasi nei linfonodi retroperitoneali, confermate dalla colorazione ematossilina ed eosina.

Una volta acquisita la padronanza, questa tecnica può essere eseguita in tre minuti. La familiarità con l'imaging ecografico è un prerequisito per effettuare questa procedura. Dopo che i tumori sono stati inoculati in questo modo, l'ecografia ci permette non solo di monitorare la crescita tumorale nel tempo, ma anche di valutare la perfusione tumorale mediante microbolle. Inoltre, ci consente di eseguire iniezioni intratumorali con nuovi agenti sperimentali.