Name: Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Impara a creare xenotrapianti ortotopici di cancro alla vescica in modo mini-invasivo con guida ecografica. Questa tecnica rapida e precisa riduce la morbilità rispetto alla laparotomia tradizionale nei modelli murini.

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Gli autori desiderano ringraziare Eliana Beraldi per l&#39;esecuzione di trasduzione virale di linee cellulari tumorali e Ben Deeley per la sua istruzione sull&#39;uso della piccola piattaforma ecografica animale. Questo progetto è stato sostenuto dalla Fondazione Sistema tedesco (DFG, JA 2117/1-1: 1), il Research Institute Canadian Cancer Society e Mentored medico Scientist Award da Vancouver Coastal Health Research Institute. La piattaforma di imaging ad ultrasuoni è stato finanziato dalla Fondazione canadese per l&#39;innovazione.

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida del Canadian Council on Animal Care (CCAC). Il protocollo è stato approvato dal Comitato Animal Care della University of British Columbia (Numero di protocollo: A10-0192). 1. Preparazione delle linee cellulari <ol><li> Confermare l&#39;identità delle rispettive linee di cellule di cancro della vescica umana di DNA fingerprinting 7. </li><li> Per l&#39;analisi della crescita di tumori trapiantati da bioluminescenza, linee cellulari transfettate con un costrutto lentivirale trasportano il gene della luciferasi di lucciola 3. </li><li> Scongelare ed espandere le linee cellulari esistenti in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) con 10% di siero bovino fetale (FBS) a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. Passage le cellule almeno 3 volte, ma evitare i tempi di coltura superiore a 3 mesi. </li></ol> 2. Preparazione della sospensione cellulare <ol><li> Scongelare Matrigel. Mantenere la temperatura al di sotto4 ° C per evitare un aumento della viscosità del gel. </li><li> Trypsinize le cellule ad una confluenza del 70% e sospendere in terreni di crescita normale. </li><li> Contare il numero di cellule con un emocitometro o contatore di cellule automatico. </li><li> Centrifugare la sospensione di cellule per 5 minuti a 200 x g. Rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere il volume appropriato di DMEM (10% FBS) e Matrigel (rapporto 1:1) per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata che dipende dalla linea cellulare utilizzata e cinetica di crescita desiderati (8-15 x 10 6 / ml). Il volume iniettato di sospensione cellulare tumorale sarà di 40 microlitri. </li><li> Mescolare bene pipettando su e giù (P1000), evitare di creare bolle d&#39;aria nella sospensione. </li></ol> 3. Preparazione degli animali Nota: A causa della potenziale necessità di cateterizzazione transuretrale nella fase 4.7, topi di sesso femminile sono il genere preferito in questo modello animale. <ol><li> Mice House secondo gu istituzionale e la cura degli animali nazionaleidelines. Ottenere l&#39;approvazione del comitato etico per tutti gli esperimenti che coinvolgono topi. </li><li> Anestetizzare i topi con 3% miscela di isoflurano / ossigeno. Verificare il corretto anestesia degli animali (ad esempio mancata risposta a pizzichi punta). </li></ol> 4. Setup sperimentale <ol><li> Tagliare la stabilizzazione vescica da qualsiasi tipo di materiale plastico rigido piatta [Figura 2 I]. Ispezionare con cura la cinghia e rimuovere eventuali spigoli vivi prima applicazione per i topi. </li><li> Montare l&#39;animale sul tavolo di imaging riscaldata [Figura 1 I] della piccola piattaforma di imaging animale con monitoraggio continuo dei parametri vitali. Fissare gli arti inferiori con un elastico [Figura 1 III]. </li><li> Disinfettare l&#39;addome con 2% clorexidina gluconato e pulire la pelle con una punta di cotone sterile. </li><li> Immobilizzare la vescica con la cinghia di stabilizzazione vescica [Figura 2 II]. Così, un evasionedella vescica durante l&#39;iniezione intramurale nel passaggio 5.6 sarà evitata. </li><li> Applicare il gel per ultrasuoni sterile al basso ventre. </li><li> Lentamente avvicinare la sonda ad ultrasuoni (frequenza 40 MHz) [Figura 1 IV] per la pelle (longitudinale con un angolo di 45-70 ° cranica) e visualizzare la vescica sullo schermo ultrasuoni [Figura 3 I]. </li><li> Se la vescica è vuota, riempirla con 50 ml sterile, calda salina tampone fosfato (PBS) attraverso un G angiocatheter transuretrale 24. </li></ol> 5. Separazione degli strati della parete della vescica <ol><li> Attaccare una siringa da 1,0 ml riempito con PBS e collegato ad un 30 G, ¾ in ago (smussatura rivolta anteriormente) al morsetto della siringa. </li><li> Posizionare l&#39;ago verso la pelle appena sopra l&#39;osso pubico in un angolo di 30-45 ° (80-90 ° rispetto all&#39;asse longitudinale la sonda ad ultrasuoni [Figura 1]). </li><li> Rileva l&#39;agosullo schermo ultrasuoni. </li><li> Lentamente perforare la pelle ed i muscoli della parete addominale [Figura 3 II]. </li><li> Girare la smussatura dell&#39;ago 180 ° (ora diretto posteriormente). </li><li> Inserire la punta dell&#39;ago nella parete della vescica senza penetrare la mucosa [Figura 3 III] </li><li> Iniettare lentamente 50 ml di PBS tra lo strato muscolare e la mucosa al fine di creare uno spazio artificiale [Figura 3 IV]. Nota: Se la mucosa viene accidentalmente forata durante la fase 5.6, lentamente tirare indietro l&#39;ago e iniettare 50 ml di PBS dopo strato mucoso ha capovolto di nuovo sulla punta dell&#39;ago. </li><li> Ritirare l&#39;ago. </li></ol> 6. Intramurale inoculazione delle cellule del cancro della vescica <ol><li> Attaccare una seconda siringa 1,0 ml (riempito con cellule tumorali sospese in Matrigel) con 30 G, ¾ in dell&#39;ago al morsetto della siringa. </li><li> Guida la punta dell&#39;ago alla stessaSpazio PBS-riempita che è stato creato nel passo 5.7. </li><li> Iniettare 40 ml di sospensione cellulare in questo spazio [figure 3 V e VI]. </li><li> Ritirare l&#39;ago. </li></ol> 7. Post-interventistica terapia di supporto <ol><li> Smontare il mouse dalla piattaforma di imaging. </li><li> Tenere l&#39;animale in un ambiente caldo e confortevole sotto sorveglianza continua, mentre il recupero dall&#39;anestesia. </li><li> Dopo aver ripreso coscienza e riprendere la deambulazione normale, posizionare l&#39;animale torna nella sua gabbia casa. </li></ol>

<ol><li>Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+orthotopic+models+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Mouse orthotopic models for bladder cancer research.</a> BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).</li>
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</ol>

Accesso aperto per questo video-articolo è sponsorizzato da FUJIFILM VisualSonics, Inc.

Quasi tutti i grandi progressi nella terapia del cancro richiedono test su modelli animali prima di iniziare le sperimentazioni cliniche. Modelli animali di cancro sono strumenti essenziali che permettono ai ricercatori di studiare la biologia del tumore in vivo. Modelli di xenotrapianto ortotopico rimangono l&#39;oro standard di 1,2 e continuano ad offrire la massima flessibilità (in termini di selezione delle linee di cellule) e hanno l&#39;utility più pratico. La procedura illustrata è una modifica minimamente invasiva del modello ortotopico precedentemente descritto da Dinney et al. 12 Abbiamo stabilito tumori xenotrapianto da ecoguidato iniezione percutanea di tre linee cellulari differenti con un tasso di successo tecnico del 100%. Durante continuo follow-up, il 98% dei topi ha dimostrato costante aumento del volume del tumore. Eseguendo una tecnica minimamente invasiva siamo stati in grado di affrontare i limiti attuali del modello intramurale. Oltre respeamen benessere degli animali, l&#39;invasività ridotta di questo procedimento contribuisce anche alla riproducibilità di esperimenti in vivo diminuendo il numero di complicazioni chirurgiche. E &#39;molto tempo efficace per evitare una laparotomia addominale e conseguente necessità per la chiusura della ferita. Siamo riusciti a ridurre significativamente il tempo di procedura per animale a 3,4 min (± 1.6). Tuttavia, il vantaggio principale del nostro nuovo approccio è la sua precisione. Ad alta risoluzione ultrasuoni ci permette di visualizzare lo spazio creato da iniezione salina sotto la mucosa della parete della vescica. Questa prima iniezione passo facilita l&#39;iniezione delle cellule tumorali in una seconda fase e minimizza il rischio di fuoriuscita delle cellule tumorali. Ciò contrasta con la tecnica di iniezione intramurale dopo laparotomia, dove è impossibile visualizzare posizionamento dell&#39;ago e c&#39;è sempre un elemento di incertezza circa l&#39;esatta profondità di iniezione. Inoltre, come stiamo inoculando cellule tumorali rigorosamente nella parete vescicale anteriore, growt tumoreh sulla parete posteriore della vescica è evitata. Successivamente il tasso di complicanze ostruttive causa della crescita del tumore in prossimità degli orifizi ureterali è estremamente raro. Questo effetto di accompagnamento consente periodi di crescita e di trattamento più lunghi. La limitazione principale del tumore inoculazione ecografico è la necessità di misure tecniche adeguate. Pertanto le prestazioni di questa procedura sarà probabilmente limitata ai centri che sono specializzati in modelli animali di cancro umano. Ciò dovrebbe incoraggiare le collaborazioni tra gruppi di ricerca al di fuori di queste istituzioni e dei gruppi con competenze in tale modellizzazione animali romanzo. Anche se dipende dalla familiarità con ecografia e una certa destrezza manuale, questo modello è facile da imparare sotto istruzione competente. Il passaggio chiave nella procedura è la creazione di un sottomucosa spazio artificiale nella parete della vescica con soluzione fisiologica. Una volta che questo spazio è creato senza perforazione of strato mucoso, rimane stabile per diversi minuti. La guida del secondo ago in questo spazio per inoculare le cellule tumorali è relativamente semplice. La complicazione principale durante la creazione dello spazio sottomucosa è perforazione dell&#39;ago nel lume della vescica. La creazione di uno spazio sottomucosa, tuttavia, rimane fattibile. L&#39;ago deve essere ritirato lentamente nella parete della vescica e la soluzione salina iniettata solo quando lo strato mucoso ribalta la punta dell&#39;ago. Dopo questa manovra spazio sottomucosa è meno stabile (soluzione fisiologica fluisca al lume vescicale entro 30-60 sec) e l&#39;iniezione delle cellule tumorali deve essere eseguita rapidamente. Fuoriuscita di cellule tumorali nel lume della vescica può verificarsi in questi casi con perforazione della mucosa. Anche se la perdita di cellule tumorali dallo spazio intramurale potrebbe portare a un volume del tumore è diminuito durante il follow-up, non abbiamo mai osservato alcun assorbimento del tumore intravesical. Un altro potenziale complication è la fuoriuscita di cellule tumorali nella cavità peritoneale attraverso il canale di iniezione. Abbiamo osservato una sola intraperitoneale disseminazione tumorale delle cellule in 50 animali, e questo si è verificato in uno dei nostri primi tentativi. Noi attribuiamo questo l&#39;iniezione di un volume eccessivo sospensione di cellule tumorali. Ciò è stato confermato dal fatto che la riduzione del volume di 50-40 ml non ha comportato ulteriori spargimenti intraperitoneale. Questo inoculazione minimamente invasiva murino ortotopico xenotrapianto cancro della vescica rappresenta una modifica innovativa del &quot;modello intramurale&quot; esistenti, beneficiando sia l&#39;investigatore e gli animali allo stesso modo. I vantaggi di questo modello incoraggiare il suo adattamento ad altri organi come il rene, prostata e fegato per stabilire tumori xenotrapianto ortotopiche in modo minimamente invasivo.

La ricerca sul cancro dipende da modelli animali di cancro umano utilizzando linee cellulari derivate da tumori di pazienti, al fine di approfondire la nostra comprensione della biologia del tumore. Per l&#39;analisi in vivo crescita sotto strategie di trattamento diversi modelli murini ortotopici cancro della vescica rimane lo standard di riferimento 1,2. L&#39;inoculazione delle cellule tumorali della vescica umane in topi immunocompromessi (modello di xenotrapianto) si basa sulla instillazione intravescicale (&quot;modello intravesical&quot;) 3,4,5 o iniezione diretta nella parete vescicale (&quot;modello intramoenia&quot;) 6,7. Entrambe le tecniche possono essere condotti in ratti 8,9. Instillazione intravescicale induce la formazione di tumori sulla superficie uroteliale della vescica che poi sono suscettibili di successiva instillazione intravescicale di agenti terapeutici innovativi. Tuttavia, il numero di linee cellulari che sono attendibilmente oncogeno quando distribuito mediante questo metodo è limitato und una di queste linee cellulari, KU7, è stato recentemente dimostrato di essere HeLa 4,10. Instillazione intravescicale è anche molto tempo a causa di tempi di sosta necessarie, e induce frequentemente la crescita tumorale in elementi adiacenti del tratto urinario, incluse uretra, uretere e pelvi renale 11. Inoltre, l&#39;instillazione intravescicale spesso porta alla crescita del tumore sul pavimento della vescica in cui gli ureteri entrano nella vescica, e questo può causare ostruzione del tratto superiore ed insufficienza renale concomitante. Xenotrapianti primarie carcinoma vescicale invasivo che sono adatti per trattamenti sistemici sono creati mediante iniezione diretta di cellule tumorali nella parete della vescica 12. Sebbene numerose linee cellulari crescono adeguatamente in questo modello, la sua limitazione è l&#39;invasività del modello relativo alla necessità di un&#39;incisione addominale 13. Il modello è anche difficile da imparare a causa della difficoltà tecnica di iniezione di cellule precisamente nella parete muscolaredella vescica. Un nuovo approccio per stabilire ortotopici xenotrapianti tumorali della vescica invasivo primarie nei topi è stato sviluppato nel nostro reparto, al fine di affrontare le carenze esistenti del &quot;modello intramurale&quot;. Siamo stati in grado di ottimizzare l&#39;iniezione percutanea eco-guidata delle cellule tumorali della vescica nella parete vescicale anteriore, con conseguente questa nuova tecnica per sostituire con successo il modello invasiva stabilita. Inoltre abbiamo potenzialmente migliorato l&#39;accuratezza e la riproducibilità del &quot;modello intramurale&quot;.

<table><tbody><tr><td>Clorexidina gluconato (2%)</td><td>Aplicare</td><td>82-319</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3008101</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Corporation</td><td>402-069-02</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,25%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3004202</td><td></td></tr><tr><td>Siringa (1 ml)</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Ago ipodermico (30 G; &frac34; in)</td><td>Kendall</td><td>830340</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatheter (24 G)</td><td>BD Bioscience</td><td>381112</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 piattaforma di imaging per piccoli animali</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RMV 706 testina di scansione a ultrasuoni</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III</td><td>Caliper Life Science</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mini-invasiva istituzione di murini ortotopico vescica xenotrapianti

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Ortotopici xenotrapianti cancro della vescica sono il gold standard per lo studio manipolazioni cellulari molecolari e di nuovi agenti terapeutici in vivo. Le linee cellulari adeguate sono inoculate mediante instillazione intravescicale (modello di crescita invasiva non muscolari) o iniezione intramurale nella parete vescicale (modello di crescita invasiva). Entrambe le procedure sono complesse e molto tempo. Inoltre, il modello superficiale ha i suoi difetti dovuti alla mancanza di linee cellulari che sono oncogeno seguente instillazione. Iniezione intramurale, d&#39;altra parte, è viziata da l&#39;invasività della procedura e la morbilità associata per il mouse ospitante. Con queste carenze in mente, abbiamo modificato i metodi precedenti per sviluppare un approccio mini-invasivo per la creazione di ortotopici xenotrapianti cancro della vescica. Utilizzando guida ecografica abbiamo svolto con successo l&#39;inoculazione percutanea delle linee di cellule di cancro alla vescica UM-UC1, UM-UC3 e UM-UC13 in 50 nude atimico. Siamo stati in grado di dimostrare che questo approccio è tempo efficiente, preciso e sicuro. Con questa tecnica, inizialmente uno spazio viene realizzato sotto la mucosa vescicale con PBS, e le cellule tumorali sono poi iniettato in questo spazio in una seconda fase. La crescita del tumore è monitorata ad intervalli regolari con bioluminescenza e gli ultrasuoni. I volumi medi di tumore sono aumentati costantemente in in tutti, ma uno dei nostri 50 topi durante il periodo di studio. Nel nostro istituto, questo nuovo approccio, che permette di xenotrapianto cancro alla vescica inoculazione in modo minimamente invasivo, rapido ed estremamente preciso, ha sostituito il modello tradizionale.

<html> Iniezione intramurale di tre diverse linee cellulari tumorali (UM-UC1 luc, UM-UC3 luc e UM-UC13 luc) è stata eseguita in 50 animali sotto ultrasuono-guida per tre giorni consecutivi. L&#39;inoculazione è stata eseguita in modo efficiente (tempo medio di 5.7 min / animale) e non era associata a complicazioni intra o post-interventistiche. Monitoraggio della crescita tumorale è stata eseguita ecografia e bioluminescenza. Il giorno # 3 un tumore potrebbe essere rilevato con l&#39;ecografia nella vescica anteriore di tutti i 50 animali [Figura 4 I]. 98% di topi hanno mostrato crescita tumorale costante durante il periodo di follow-up [Figure 4 e 5]. A seguito della inoculazione di UM-UC3 luc, un mouse sviluppato intraperitoneale diffusione del tumore e il tumore involuta dopo giorno # 7 in un secondo animale [Tabella 1]. Questo è stato il primo gruppo di topi inoculati con questa nuova tecnica. nt &quot;&gt; I topi sono stati sacrificati il ​​giorno # 24, # 28 e # 37 dopo l&#39;inoculazione di UM-UC3 luc, UM-UC1 luc e UM-UC13 luc, rispettivamente. tumori xenotrapianto sono state raccolte ed esaminate in ematossilina ed eosina (H &amp; E sezioni). Tutti i tumori erano muscolo invasiva e alcuni infiltrati nel grasso perivescicale, ma nessuna invasione in organi adiacenti è stato osservato [Figura 6 I]. il 60% dei topi portatori di tumori luc UM-UC13 e il 20% dei topi portatori di UM-UC3 luc I tumori retroperitoneali sviluppato metastasi linfonodali che sono state confermate dalla colorazione H &amp; E [Figura 6 II]. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1.jpg" /> Figura 1. Immagine e illustrazione schematica del setup sperimentale. Il mouse è montato sul tavolo operatorio riscaldato (I) e tenuto sotto anestesia (&lt;strong&gt; II) con 3% miscela isoflurano / ossigeno. Gli arti inferiori sono fissate con un nastro di gomma (III). Dopo aver raggiunto la sonda ad ultrasuoni (IV) alla pelle (allineamento longitudinale con un angolo di 45-70 ° cranica) vescica (V) viene visualizzato sullo schermo ultrasuoni. Una siringa con un ago 30 G (VI) è guidato alla pelle con un angolo di 30-45 ° (80-90 ° rispetto all&#39;asse longitudinale la sonda ad ultrasuoni). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2.jpg" /> Figura 2. Immobilizzazione della vescica. Dimensioni e illustrazione per costruire la cinghia di stabilizzazione vescica (I) la cinghia viene fissata al basso addome e immobilizza la vescica (II). Così un evasione del<html> vescica durante l&#39;iniezione intramurale è evitata. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3.jpg" /> Figura 3. Intramurale inoculazione delle cellule tumorali. Visualizzazione della vescica sullo schermo ultrasuoni (I). Perforazione della pelle e dei muscoli della parete addominale (II). Inserimento dell&#39;ago nella parete della vescica senza penetrazione della mucosa (III). PBS (50 microlitri) tra lo strato muscolare e la mucosa dopo l&#39;iniezione lenta (IV). Le cellule tumorali sospese in Matrigel in intramurale spazio creato artificialmente (V, VI). 1123fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. . Follow-up con l&#39;ecografia di follow-up continuo con l&#39;ecografia ha mostrato significativo aumento del volume del tumore (I: giorno # 3, II: giorno # 7, III: giorno # 13). <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5.jpg" /> Figura 5. Follow-up da bioluminescenza. Follow-up continuo per bioluminescenza ha mostrato costante incremento luminescenza durante il periodo di studio. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6.jpg" /> Figura 6. Istologia del tumore xenotrapianto e di metastasi linfonodali. In toto H &amp; E della sezione di un xenotrapianto rappresentante tu<html> mor dimostrando crescita invasiva nel muscolo senza invasione in organi adiacenti (I). Il 60% dei topi portatori di tumori luc UM-UC13 e il 20% dei topi portatori di UM-UC3 luc tumori metastasi linfonodali retroperitoneali presentati (II). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320"><colgroup><col span="5" /></colgroup><tbody><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Linea cellulare inoculato </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> UM-UC1 luc </td><td style="width:64px;"> UM-UC3 luc </td><td style="width:64px;"> Luc UM-UC13 </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> Numero di topi </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 20 </td><td style="width:64px;"> 15 </td><td style="width:64px;"> 15 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Volume iniettato, microlitri </td>idth: 64px; &quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> 40 </td><td style="width:64px;"> 50 </td><td style="width:64px;"> 50 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Il conteggio delle cellule, assoluta </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3,6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 5,5 x 10 5 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Tempo per animali, min </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3.4 (± 1.6) </td><td style="width:64px;"> 7.7 (± 3.7) </td><td style="width:64px;"> 6.8 (± 2.9) </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Incidenza di tumori </td><td style="width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:192px;"> 49 (98%) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"&gt; </td><td style="width:64px;"> 20 (100%) </td><td style="width:64px;"> 14 (93%) </td><td style="width:64px;"> 15 (100%) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Metastasi linfonodali </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 0 </td><td style="width:64px;"> 3 (20%) </td><td style="width:64px;"> 9 (60%) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Follow up (giorni) </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 28 </td><td style="width:64px;"> 22 [prima del trattamento] </td><td style="width:64px;"> 28 [prima del trattamento] </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Volume del tumore (microlitri) </td><td style="width:64px;"> giorno 4 </td><td style="width:64px;"> 11.6 (± 1.3) </td><td style="width:64px;"> 12,5 (± 1,7) </td><td style="width:64px;"> 14.4 (± 1.3) </td></tr><tr height="20"><td height="61" rowcampata = &quot;2&quot; style = &quot;height: 61px; width: 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> fine </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 394,6 (± 72,4) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 288,7 (± 66.1) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 78,3 (± 13,4) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> follow-up </td></tr><tr height="56"><td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:64px;"> Tumore luminescenza (fotoni / sec) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> giorno 4 </td><td style="width:64px;"> 4,6 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 2,0 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 5,8 x 10 8 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> (± 9.4 x 10 7) </td><td style="width:64px;"> (± 3,7 x 10 7) </td><td style="width:64px;"> (± 1,3 x 10 8) </td></tr><tr height="23"><td height="67" rowspan="2"style = &quot;height: 67px; width: 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> fine </td><td style="width:64px;"> 1,9 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1,4 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1,5 x 10 10 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> follow-up </td><td style="width:64px;"> (± 4,0 x 10 9) </td><td style="width:64px;"> (± 2,3 x 10 9) </td><td style="width:64px;"> (± 1,9 x 10 9) </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Iniezione di cellule tumorali eco-guidata - procedura e risultati.

La tecnica istituita per inoculare ortotopici xenotrapianti carcinoma vescicale invasivo primarie richiede laparotomia e la mobilitazione della vescica. Questa procedura infligge significativa morbilità sui topi, è tecnicamente difficile e richiede molto tempo. Abbiamo quindi sviluppato una alta precisione, approccio percutaneo utilizzando guida ecografica.

Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare xenotrapianti ortotopici di cancro della vescica in modo rapido, preciso e minimamente invasivo. Questo viene ottenuto innanzitutto espandendo la specifica linea cellulare tumorale e sospendendo le cellule tumorali in Matrigel. Successivamente, l'animale viene posizionato sulla piattaforma di imaging e la vescica viene visualizzata mediante ultrasuoni.Quindi, gli strati mucosale e muscolare della vescica vengono separati mediante un'iniezione di soluzione salina. Infine, la sospensione di cellule tumorali in matrigel viene iniettata in questo spazio artificialmente creato. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la crescita tumorale mediante imaging ecografico e bioluminescenza.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come l'uso della laparotomia per l'inoculazione di xenotrapianti primari, è che questo approccio è rapido, preciso e minimamente invasivo. Le implicazioni di queste tecniche si estendono alla diagnosi e alla terapia del cancro della vescica poiché gli autoxenotrapianti rappresentano lo standard di riferimento per lo studio preclinico di nuovi trattamenti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi dell'iniezione sono molto difficili da apprendere e la parete della vescica è estremamente sottile. La dimostrazione di questa procedura sarà quindi essenziale.Igor Mosca ha un assistente di ricerca e Wolfgang Yeager, un ricercatore postdottorato. Entrambi sono urologi. Dopo aver confermato l'identità delle rispettive linee cellulari di carcinoma della vescica umana mediante analisi del profilo del DNA, utilizzare un costrutto lentivirale portatore del gene della luciferasi della lucciola per l'analisi della crescita mediante bioluminescenza dei tumori xenotrapiantati per trasfettare le linee cellulari.Quando si è pronti per iniziare la procedura, scongelare e utilizzare il DMEM con il 10% di FBS per espandere le linee cellulari esistenti, incubando a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con 5% di CO2. Per preparare una sospensione cellulare da iniettare dopo lo scongelamento, aggiungere matrigel e mantenere in ghiaccio la tripsina; raccogliere le cellule a una confluenza del 70% e sospenderle nel normale mezzo di crescita, quindi contare le cellule e centrifugare la sospensione a 200 × g per cinque minuti. Dopo aver rimosso il soprannatante, aggiungere la quantità appropriata di volumi equi di D-M-E-M-F-B-S e MATRIGEL per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata, necessaria per iniettare un volume di 40 microlitri per animale.Mescolare bene ed evitare di creare bolle d'aria utilizzando un materiale plastico piatto e rigido qualsiasi. Tagliare con cura un stabilizzatore della vescica, ispezionare attentamente la cinghia e rimuovere eventuali bordi taglienti prima dell'applicazione sui topi. Dopo aver anestetizzato i topi femmina con isoflurano al 3% in ossigeno ed eseguito una compressione del dito del piede.Per garantire una sedazione adeguata, posizionare l'animale sul tavolo riscaldato della piattaforma di imaging per piccoli animali, monitorandone continuamente i parametri vitali con un laccio di gomma. Fissare gli arti inferiori e utilizzare clorhexidina gluconato allo 0,5% per disinfettare l'addome prima di asciugare la cute con un batuffolo di cotone sterile. Successivamente, utilizzando la cinghia di stabilizzazione della vescica, immobilizzare la vescica per evitare spostamenti durante l'iniezione intramurale.Applicare quindi del gel ecografico sterile sull'addome inferiore. Avanzare lentamente la sonda ecografica, appoggiandone la testa sulla pelle, e visualizzare la vescica sullo schermo ecografico. Se la vescica è vuota, utilizzare 50 microlitri di PBS tiepido in un catetere angio da 24 gauge transuretrale per riempirla e separare gli strati della parete vescicale.Iniziare fissando una siringa da 1,0 millilitro riempita con PBS e collegata a un ago da 30 gauge lungo tre quarti di pollice al morsetto per siringa. Posizionare l'ago verso la cute appena sopra l'osso pubico. Con un angolo compreso tra 30 e 45 gradi, individuare l'ago sullo schermo dell'ecografo prima di perforare lentamente la cute e i muscoli della parete addominale.Successivamente, ruotare il bisellino dell'ago di 180 gradi in modo che sia rivolto posteriormente, e inserire la punta dell'ago nella parete della vescica senza penetrare la mucosa. Poi, per creare uno spazio artificiale, iniettare lentamente 50 microlitri di PBS tra il strato muscolare e la mucosa prima di ritirare l'ago. Per iniettare le cellule tumorali della vescica, collegare una seconda siringa da 1,0 millilitro riempita con la sospensione di cellule tumorali in matrigel, e un ago da 30 gauge lungo tre quarti di pollice al morsetto della siringa.Guidare la punta dell'ago verso lo spazio riempito con PBS appena creato e iniettare 40 microlitri della sospensione nello spazio. Successivamente, ritirare l'ago dopo aver rimosso il topo dalla piattaforma di imaging.Mantenerlo in un ambiente caldo e confortevole sotto monitoraggio continuo. Dopo il recupero della coscienza e della normale deambulazione, riposizionare l'animale nella sua gabbia di provenienza. L'iniezione intramurale di tre linee cellulari tumorali diverse è stata eseguita in 50 animali sotto guida ecografica per tre giorni consecutivi.L'inoculazione è stata eseguita in modo efficiente e non è stata associata a complicanze intra o post-interventistiche. Il monitoraggio della crescita tumorale è stato effettuato mediante imaging ecografico e bioluminescenza. Al terzo giorno, un tumore è stato rilevato mediante ecografia nella vescica anteriore di tutti e 50 gli animali, e il 98% dei topi ha mostrato una crescita tumorale costante durante il periodo di follow-up successivo all'inoculazione di uc.Three.In un topo di Luke si è sviluppata una disseminazione tumorale intraperitoneale e il tumore si è involuto dopo il giorno sette in un secondo animale. Questo è stato il primo gruppo di topi inoculati con questa nuova tecnica dopo l'inoculazione di uc.Three. Luke uc, un Luke e uc.13 Luke. I topi sono stati sacrificati rispettivamente ai giorni 24, 28 e 37. I tumori xenotrapiantati sono stati prelevati ed esaminati mediante sezioni ematossilina ed eosina.Tutti i tumori erano infiltranti il muscolo e alcuni si estendevano nel grasso periviscerale, ma non è stata osservata alcuna invasione negli organi adiacenti. 60% dei uc, 13 Luke e 20% dei uc. In tre topi portatori di tumore Luke si sono sviluppate metastasi nei linfonodi retroperitoneali, confermate dalla colorazione ematossilina ed eosina.Una volta acquisita la padronanza, questa tecnica può essere eseguita in tre minuti. La familiarità con l'imaging ecografico è un prerequisito per effettuare questa procedura. Dopo che i tumori sono stati inoculati in questo modo, l'ecografia ci permette non solo di monitorare la crescita tumorale nel tempo, ma anche di valutare la perfusione tumorale mediante microbolle. Inoltre, ci consente di eseguire iniezioni intratumorali con nuovi agenti sperimentali.

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