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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Test di chemiotassi

<em>C. elegans</em> Chemotaxis Assay

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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Chemotaxis Assay

3.9: C. elegans Development and Reproduction

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08:57 min

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April 30, 2023

Overview

La chemiotassi è un processo in cui cellule o organismi si muovono in risposta a uno stimolo chimico. In natura, la chemiotassi è importante per gli organismi per percepire e muoversi verso fonti di cibo e allontanarsi da stimoli che possono essere tossici o dannosi. La chemiotassi è importante anche a livello cellulare. Ad esempio, la chemiotassi è necessaria per il movimento dello sperma verso un uovo prima della fecondazione. In laboratorio, la chemiotassi viene spesso esaminata nel nematode, C. elegans, che è noto per migrare verso fonti di cibo nel suolo, ma lontano da tossine come metalli pesanti, sostanze con un pH basso e detergenti. Questo video dimostra come eseguire un test di chemiotassi, che include la preparazione delle piastre di chemiotassi e dei vermi, l’esecuzione del test e l’analisi dei dati. Quindi, discutiamo esempi di come i test di chemiotassi possono essere utilizzati in C. elegans come strumento per comprendere l’apprendimento e la memoria, l’adattamento olfattivo e le malattie neurologiche come il morbo di Alzheimer. Gli esperimenti di chemiotassi in C. elegans hanno possibilità quasi illimitate per saperne di più sui meccanismi cellulari e genetici di molti processi biologici e possono portare a una maggiore comprensione della biologia, dello sviluppo e della malattia umana.

Procedure

Il movimento di una cellula o di un organismo in risposta a uno stimolo chimico è un comportamento chiamato chemiotassi. In questo video, impareremo come eseguire un test di chemiotassi usando il nematode, C. elegans. Discuteremo anche di come i test di chemiotassi in C. elegans vengono applicati allo studio dell’apprendimento e della memoria, dell’adattamento olfattivo e del morbo di Alzheimer.

Discutiamo prima di due diversi tipi di chemiotassi. Il movimento verso uno stimolo chimico è chiamato chemiotassi positiva. Al contrario, il movimento lontano da uno stimolo chimico è chiamato chemiotassi negativa, consentendo agli organismi di allontanarsi dalle sostanze chimiche nocive.

La chemiotassi può verificarsi a livello di organismo, quando gli organismi si muovono verso una fonte di cibo. La chemiotassi avviene anche a livello cellulare, all’interno degli organismi. Ad esempio, le cellule immunitarie migrano verso agenti patogeni o siti di infiammazione. In un altro esempio, gli spermatozoi si muovono verso l’uovo in risposta a un chemio-attrattivo rilasciato dall’uovo. La chemiotassi è anche un processo importante durante lo sviluppo, in cui le cellule migrano in risposta a uno stimolo chimico, formando tessuti e organi nell’organismo in via di sviluppo.

Per C. elegans selvatico, che vive nel suolo, la chemiotassi è importante per il rilevamento e il movimento verso i batteri, la loro principale fonte di cibo. Al contrario, C. elegans è respinto da metalli pesanti, sostanze con un pH basso e detergenti, che sono tossici per l’organismo.

I saggi di chemiotassi in genere iniziano preparando piastre di chemiotassi. Usando un righello e un pennarello, dividere una piastra di 5 cm con mezzo di crescita del nematode in quattro quadranti uguali. Quindi, disegna un cerchio con un raggio di 0,5 cm attorno al centro del quadrante. Questo sarà il punto di partenza per i vermi. Contrassegnare ed etichettare un punto in ogni quadrante, in modo tale che ogni punto sia equidistante dal centro e l’uno dall’altro.

Quando si preparano i vermi per il test, è fondamentale utilizzare vermi giovani adulti sincronizzati con l’età in modo che le differenze nella chemiotassi non siano un artefatto della fase di sviluppo. Una volta sincronizzati i vermi, raccoglierli prima pipettando 2 ml di tampone S-basale su una piastra contenente giovani adulti. Ruotare e inclinare il piatto per lavare i vermi dal piatto.

Quindi, pipettare la soluzione worm/S-basale in un tubo microcentrifuga. Lavare i vermi centrifugando brevemente la soluzione worm/S-basal, rimuovendo il surnatante e aggiungendo un altro millilitro di soluzione S-basale al pellet di verme. Invertire il tubo e ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo il lavaggio, rimuovere tutti tranne circa 100 μl della soluzione S-basale. Quindi, aggiungere 2 μl della miscela worm/S-basale a una piastra NGM. Usando un microscopio, conta il numero di vermi presenti. Idealmente, ci saranno tra 50-250 vermi per 2 μl di S-basale.

Ora che le piastre di chemiotassi e i vermi sono pronti, possiamo iniziare il test di chemiotassi. In primo luogo, mescolare volumi uguali della soluzione di prova con 0,5 M di sodio azide, un anestetico che paralizzerà i vermi una volta raggiunta la loro destinazione. Fai lo stesso con la tua soluzione di controllo. Successivamente, pipettare 2 μl di miscela verme / S-basale sul centro della piastra di chemiotassi. Quindi, pipettare 2 μl della soluzione di prova o di controllo e posizionare su punti opportunamente etichettati sulla piastra di chemiotassi. Una volta che le soluzioni di prova e controllo sono state assorbite, rimettere il coperchio, invertire la piastra e impostare un timer per 1 ora.

Dopo che ai vermi è stata data un’ora per rispondere agli stimoli chimici sulla piastra, i dati possono essere analizzati. Contare manualmente il numero di worm all’interno di ciascun quadrante. Se i vermi sono attratti dalla sostanza chimica in esame, ci saranno più vermi presenti in quei quadranti. Se sono neutri nei confronti di quella sostanza chimica, i vermi saranno presenti in ogni quadrante allo stesso modo.

Utilizzare questi dati per calcolare l’indice chemiotattico, che è il numero di vermi nei quadranti di test meno il numero di vermi nel quadrante di controllo, diviso per il numero totale di vermi. Un indice chemiotattico vicino a +1 suggerisce attrazione, mentre un indice chemiotattico vicino a -1 indica repulsione.

Ora che abbiamo imparato come impostare un test di chemiotassi, diamo un’occhiata a come questi esperimenti vengono applicati per rispondere a domande scientifiche.

Uno dei modi in cui sono stati applicati i saggi di chemiotassi in C. elegans è per lo studio dell’apprendimento e della memoria. Ad esempio, i vermi possono essere condizionati ad associare uno stimolo chimico a una fonte di cibo. I vermi ben nutriti sono affamati per un’ora, e poi sono condizionati con il cibo, così come una sostanza chimica come il butanone.

Successivamente, i vermi sono tenuti su un piatto con cibo, ma senza butanone. L’esecuzione di un test di chemiotassi determinerà quindi se i vermi hanno imparato ad associare il butanone al cibo. Molte varianti di questo esperimento possono essere eseguite per determinare altre informazioni come quali geni o neuroni sono importanti per l’apprendimento e la memoria.

L’adattamento olfattivo è un fenomeno che si verifica quando i neuroni sensoriali diminuiscono la loro risposta a uno stimolo nel tempo, consentendo all’animale di rispondere ad altri stimoli, forse più importanti. Ad esempio, I C. elegans selvatici esposti a un odore per un periodo di tempo, ignoreranno quell’odore durante un test di chemiotassi a causa dell’adattamento olfattivo, piuttosto che essere attratti da esso. Pertanto, è possibile eseguire screening genetici ad alto rendimento per rivelare i regolatori genetici dell’adattamento olfattivo, come egl-4. Inoltre, i vermi transgenici che esprimono proteine marcate in modo fluorescente possono essere osservati per i cambiamenti nella localizzazione durante l’adattamento olfattivo.

Infine, i test di chemiotassi possono essere utilizzati in C. elegans per studiare la malattia di Alzheimer. Gli scienziati possono esprimere il peptide beta amiloide umano marcato in modo fluorescente – un segno distintivo della malattia di Alzheimer – nei neuroni di C. elegans. È interessante notare che i test di chemiotassi hanno rivelato che i vermi che esprimono l’amiloide-beta in una popolazione di neuroni mostrano una chemiotassi ridotta verso un attrattivo chemio rispetto al controllo. Molte varianti di questo esperimento potrebbero essere eseguite, tra cui l’espressione di amiloide-beta in altre popolazioni di neuroni o tessuti, o determinare se alcuni composti possono alleviare gli effetti dell’espressione dell’amiloide-beta, portando infine a una potenziale terapia.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla chemiotassi in C. elegans. In primo luogo, abbiamo definito cos’è la chemiotassi e perché è importante in natura per organismi e cellule. Quindi abbiamo dimostrato come eseguire un test di chemiotassi con C. elegans. Infine, abbiamo discusso di come la chemiotassi può essere applicata per comprendere l’apprendimento e la memoria, l’adattamento olfattivo e il morbo di Alzheimer. Grazie per l’attenzione!

Transcript

The movement of a cell or organism in response to a chemical stimulus is a behavior called chemotaxis. In this video, we will learn how to perform a chemotaxis assay using the nematode, C. elegans. We will also discuss how chemotaxis assays in C. elegans are applied to study learning and memory, olfactory adaptation, and Alzheimer’s disease.

Let’s first discuss two different types of chemotaxis. Movement toward a chemical stimulus is called positive chemotaxis. In contrast, movement away from a chemical stimulus is called negative chemotaxis, allowing organisms to move away from harmful chemicals.

Chemotaxis can occur at the organismal level, as organisms move toward a food source. Chemotaxis also takes place at the cellular level, within organisms. For example, immune cells migrate toward pathogens or sites of inflammation. In another example, sperm cells move toward the egg in response to a chemo-attractant released by the egg. Chemotaxis is also an important process during development, in which cells migrate in response to a chemical stimulus, forming tissues and organs in the developing organism.

For wild, soil-dwelling C. elegans, chemotaxis is important for detection and movement toward bacteria, their main food source. In contrast, C. elegans are repelled by heavy metals, substances with a low pH, and detergents, which are toxic to the organism.

Chemotaxis assays typically begin by preparing chemotaxis plates. Using a ruler and a marker, divide a 5 cm plate with nematode growth medium into four equal quadrants. Then, draw a circle with a 0.5 cm radius around the center of the quadrant. This will be the starting point for the worms. Mark and label a point in each quadrant, such that each point is equidistant from the center, and from each other.

When preparing worms for the assay, it’s critical to use age synchronized young adult worms so that differences in chemotaxis are not an artifact of the developmental stage. Once worms are synchronized, collect them by first pipetting 2 ml of S-basal buffer onto a plate containing young adults. Swirl and tilt the dish to wash the worms from the plate.

Next, pipette the worm/S-basal solution into a microcentrifuge tube. Wash the worms by briefly centrifuging the worm/S-basal solution, removing the supernatant, and adding another milliliter of S-basal solution to the worm pellet. Invert the tube and repeat the wash two more times. After washing, remove all but approximately 100 μl of the S-basal solution. Next, add 2 μl of the worm/S-basal mixture to an NGM plate. Using a microscope, count the number of worms present. Ideally, there will be between 50-250 worms per 2 μl of S-basal.

Now that the chemotaxis plates and the worms are ready, we can get started on the chemotaxis assay. First, mix equal volumes of your test solution with 0.5 M sodium azide, an anesthetic that will paralyze worms once they reach their destination. Do the same with your control solution. Next, pipette 2 μl of worm/S-basal mixture onto the center of your chemotaxis plate. Then, pipette 2 μl of the test or control solution and place on appropriately labeled points on the chemotaxis plate. Once the test and control solutions have been absorbed, place the lid back on, invert the plate, and set a timer for 1 hour.

After the worms have been given one hour to respond to the chemical stimuli on the plate, the data can be analyzed. Manually count the number of worms within each quadrant. If the worms are attracted to the test chemical, there will be more worms present in those quadrants. If they are neutral towards that chemical, worms will be present in each quadrant equally.

Use these data to calculate the chemotactic index, which is the number of worms in the test quadrants minus the number of worms in the control quadrant, divided by the total number of worms. A chemotactic index close to +1 suggests attraction, while a chemotactic index close to -1 indicates repulsion.

Now that we’ve learned how to set up a chemotaxis assay, let’s have a look at how these experiments are applied to answer scientific questions.

One of the ways chemotaxis assays in C. elegans have been applied is for studying learning and memory. For example, worms can be conditioned to associate a chemical stimulus with a food source. Well-fed worms are starved for one hour, and then they are conditioned with food, as well as a chemical such as butanone.

Next, the worms are held on a plate with food, but without butanone. Running a chemotaxis assay will then determine whether the worms have learned to associate butanone with food. Many variations of this experiment can be performed to determine other information such as which genes or neurons are important for learning and memory.

Olfactory adaptation is a phenomenon that occurs when sensory neurons decrease their response to a stimulus over time, allowing the animal to respond to other, possibly more important, stimuli. For example, wild-type C. elegans exposed to an odor for a period of time, will ignore that odor during a chemotaxis assay due to olfactory adaptation, rather than be attracted to it. Therefore, high throughput genetic screens can be performed to reveal the genetic regulators of olfactory adaptation, such as egl-4. Additionally, transgenic worms expressing fluorescently tagged proteins can be observed for changes in localization during olfactory adaptation.

Finally, chemotaxis assays can be used in C. elegans to study Alzheimer’s disease. Scientists can express fluorescently tagged human amyloid beta peptide – a hallmark of Alzheimer’s disease – in the neurons of C. elegans. Interestingly, chemotaxis assays revealed that worms expressing amyloid beta in a population of neurons show reduced chemotaxis towards a chemo-attractant compared to the control. Many variations of this experiment could be performed, including expressing amyloid beta in other neuron populations or tissues, or determining whether any compounds can alleviate the effects of amyloid beta expression, ultimately leading to a potential therapy.

You’ve just watched JoVE’s introduction to chemotaxis in C. elegans. First, we defined what chemotaxis is and why it is important in nature for organisms and cells. Then we demonstrated how to perform a chemotaxis assay with C. elegans. Finally, we discussed how chemotaxis can be applied to understand learning and memory, olfactory adaptation, and Alzheimer’s disease. Thanks for watching!

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