Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione Chlamydia Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare le dinamiche di crescita dell'inclusione della clamidia nelle cellule viventi. Ciò si ottiene generando prima cellule ospiti fluorescenti che esprimono stabilmente una proteina fluorescente come la GFP nel loro citoplasma. Successivamente, le cellule ospiti vengono infettate con clamidia e lasciate incubare.

Quindi le cellule infette vengono visualizzate mediante microscopia a fluorescenza dal vivo. Infine, le caratteristiche di inclusione della clamidia vengono quantificate attraverso un software di analisi al microscopio, infine la microscopia a fluorescenza dal vivo viene utilizzata per visualizzare le inclusioni di clamidia all'interno della cellula ospite e per misurare i parametri biologici delle inclusioni per ottenere risultati quantitativi. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'enumerazione basata su anticorpi sono che questa strategia di imaging inverso può essere utilizzata su cellule vive e anche in collaborazione con altre marcature fluorescenti per quantificare le dinamiche di inclusione di tutte le specie di clamidia.

Inoltre, a differenza dei metodi di routine che marcano i batteri nelle cellule, questo approccio illumina la membrana di inclusione nelle cellule viventi e può quindi rivelare importanti proprietà dinamiche di questo compartimento contenente patogeno. Dopo aver generato cellule Hela fluorescenti, secondo la piastra del protocollo di testo, le cellule Hela GFP su un recipiente di coltura desiderato, come piastre con fondo di vetro per l'imaging ad alta risoluzione, 4 piastre da 24 pozzetti per la determinazione delle istruzioni per l'uso e lo screening multi-pozzetto, scongelano una provetta congelata contenente crich cotus, o qualsiasi altro ceppo di clamidia desiderato sul ghiaccio e diluiscono in HBSS fino alla molteplicità di infezione desiderata. Per eseguire un'infezione statica con Crich Cotus, LGV zero VL 2 aspira il terreno dai pozzetti e utilizza HBSS per lavare le cellule GFP hela.

Aggiungere i batteri diluiti ai pozzetti e incubare a 25 gradi Celsius per due ore, aspirare le cellule e lavare con HBSS. Quindi, dopo aver aggiunto il terreno di crescita, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica per eseguire un'infezione assistita da centrifugazione con crich a sierotipo D o qualsiasi altro ceppo di clamidia. Utilizzare HBSS per lavare le cellule GFP hela e aggiungere batteri diluiti alle cellule.

Quindi posizionare la capsula delle cellule infette in un supporto per piastre multipozzetto di un rotore a secchiello oscillante in una centrifuga da banco. Centrifugare le celle a 900 volte G e 25 gradi Celsius per un'ora. Quindi posizionare i recipienti di coltura in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora in una cappa di biosicurezza, aspirare le cellule, lavare due volte con HBSS e aggiungere il terreno di crescita.

Incubare il piatto di cellule infette a 37 gradi Celsius. Per visualizzare le inclusioni di clamidia, rimuovere le cellule GFP hela infette da clamidia dall'incubatore di anidride carbonica e utilizzare RPMI senza rosso fenolo e 5% FBS Per sostituire il terreno, posizionare la piastra o la piastra a più pozzetti su un microscopio a fluorescenza invertito con un obiettivo a olio 20x o superiore. Utilizzando il software di imaging, è possibile identificare le cellule GFP hela infette da clamidia che appaiono come cellule verdi contenenti grandi buchi neri.

Nella finestra di dialogo di configurazione dell'acquisizione, configurare il software per acquisire il canale verde e qualsiasi altro canale aggiunto nel campione. Utilizzare il pulsante di acquisizione, barra, registrazione per acquisire l'immagine nei momenti desiderati. Post-infezione. Rimuovere le cellule GFP hela infette da clamidia dall'incubatrice e posizionare il piatto su un microscopio a fluorescenza inverter.

Concentrati sulle pianure medie delle cellule dove le inclusioni sono al loro massimo diametro e resa. I bordi nitidi acquisiscono immagini in almeno 10 campi per pozzetto. I pozzetti rappresentano tipicamente repliche o variabili sperimentali.

Per trovare le celle hela GFP nella scheda delle misurazioni, utilizzare il comando Trova oggetti e selezionare il canale verde. Regolare l'intensità della soglia in base all'intensità relativa delle celle. Conta manualmente il numero di inclusioni o compartimenti neri e le cellule GFP hela a occhio o utilizza algoritmi software di imaging per identificare e contare automaticamente le inclusioni.

Filtra gli oggetti selezionati mantenendo solo quelli superiori a cinque micrometri quadrati. Riferirsi a questo come popolazione uno. Utilizzando questa popolazione, applicare il comando Riempi fori negli oggetti come input in questo passaggio genera la popolazione due.

Sottrai la popolazione uno dalla popolazione due per ottenere inclusioni di clamidia contrassegnate positivamente designate come popolazione tre. Utilizzare il comando filter population per applicare un filtro di dimensione alla popolazione tre. Ad esempio, mantenendo gli oggetti più grandi di 25 micrometri quadrati per le inclusioni nelle cellule, infettati per 24 ore o più per i primi tempi di infezione, impostare il filtro delle dimensioni per mantenere gli oggetti più grandi di quattro micrometri quadrati.

Poiché queste inclusioni sono molto più piccole, il filtro delle dimensioni risulta in una popolazione di oggetti designati come inclusioni. Utilizza il software di imaging per calcolare i dati quantitativi dalle immagini come il numero di inclusione, l'inclusione, le dimensioni e l'inclusione. La circonferenza dopo l'infezione da inclusioni di clamidia è facilmente visibile come macchie nere e le cellule ospiti o la proteina fluorescente che esprime la clamidia all'interno delle cellule ospiti, e la loro chiarezza può essere sfruttata per l'identificazione automatizzata in numerosi campi visivi e/o trattamenti.

Come dimostrato in questo grafico, una delle principali applicazioni è la determinazione delle unità di formazione dell'inclusione della clamidia nelle cellule vive infette, che ovvia alla necessità di procedure di immunofluorescenza, che richiedono tempo e denaro. Un'altra caratteristica chiave di questo approccio di imaging è che può essere facilmente applicato a qualsiasi specie o ceppo di clamidia. In questo esempio, è stata eseguita un'analisi dell'andamento temporale delle cellule GFP hela infettate con una delle quattro specie o ceppi di clamidia per ciascuna di queste specie e ceppi.

Le inclusioni sono state contrassegnate e analizzate per calcolare la lunghezza media del perimetro dell'area e il numero per cella nei tempi indicati. Questi attributi forniscono informazioni importanti sulla biologia delle inclusioni di clamidia, compreso il modo in cui interagiscono con la cellula ospite. Qui è mostrato un video di cellule m cherry hela infettate con GFPC, Tracom L due composto da immagini time-lapse scattate a intervalli di cinque minuti per 125 minuti, a partire da 48 ore dopo l'infezione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questa tecnica di imaging inverso non solo per visualizzare le inclusioni di clamidia, ma per quantificare le dinamiche di inclusione come il perimetro dell'area di inclusione e il numero di inclusioni per cellula. Questa tecnica è conveniente rispetto alle tecniche di visualizzazione più tradizionali e funziona con tutte le specie e i ceppi di clamidia.