Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare la dinamica di crescita delle inclusioni da clamidia in cellule vive. Questo viene ottenuto innanzitutto generando cellule ospiti fluorescenti che esprimono stabilmente una proteina fluorescente come la GFP nel loro citoplasma. Successivamente, le cellule ospiti vengono infettate con clamidia e lasciate incubare.

Quindi, le cellule infette vengono visualizzate mediante microscopia a fluorescenza in tempo reale. Infine, le caratteristiche delle inclusioni di Chlamydia vengono quantificate attraverso un software di analisi microscopica; in ultima analisi, la microscopia a fluorescenza in tempo reale viene utilizzata per visualizzare le inclusioni clamidiali all'interno della cellula ospite e per misurare parametri biologici delle inclusioni al fine di ottenere risultati quantitativi. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il conteggio basato su anticorpi, sono che questa strategia di imaging inverso può essere applicata su cellule vive e può essere utilizzata in combinazione con altre etichette fluorescenti per quantificare la dinamica delle inclusioni di tutte le specie di Chlamydia.

Inoltre, a differenza dei metodi convenzionali che etichettano i batteri all'interno delle cellule, questo approccio illumina la membrana dell'inclusione in cellule vive e può quindi rivelare importanti proprietà dinamiche di questo compartimento contenente il patogeno. Dopo aver generato cellule HeLa fluorescenti, secondo il protocollo descritto, piastrare le cellule HeLa-GFP su un contenitore da coltura desiderato, come piastre con fondo in vetro per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione, piastre a 24 pozzetti per la determinazione delle IFU e piastre multipozzetto per lo screening; scongelare un tubo congelato contenente Crich Cotus, oppure qualsiasi altro ceppo di Chlamydia desiderato, in ghiaccio e diluire in HBSS al multiplo di infezione desiderato. Per eseguire un'infezione statica con Crich Cotus, LGV serovar L2 (L2/434/Bu), aspirare il mezzo dai pozzetti e utilizzare HBSS per lavare le cellule HeLa-GFP.

Aggiungere batteri diluiti nei pozzetti e incubare a 25 gradi Celsius per due ore, aspirare le cellule e lavare con HBSS. Successivamente, dopo aver aggiunto il mezzo di crescita, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore a biossido di carbonio per eseguire un'infezione assistita da centrifugazione con crich verso il sierotipo D o qualsiasi altro ceppo di Chlamydia. Utilizzare HBSS per lavare le cellule HeLa GFP e aggiungere batteri diluiti alle cellule.

Quindi posizionare la piastra di cellule infette nel portaprolle a cestello oscillante di una centrifuga da banco. Centrifugare le cellule a 900 ×g e 25 °C per un'ora. Successivamente, posizionare i contenitori di coltura in un incubatore con anidride carbonica a 37 °C per un'ora all'interno di una cappa biologica, aspirare il liquido, lavare le cellule due volte con HBSS e aggiungere il mezzo di crescita.

Incubare la piastra di cellule infette a 37 gradi Celsius. Per visualizzare le inclusioni di chlamydia, rimuovere le cellule HeLa GFP infette da chlamydia dall'incubatore a biossido di carbonio e utilizzare RPMI senza fenolo rosso e con 5% di FBS per sostituire il mezzo. Posizionare la piastra o la piastra multipozzetta su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di obiettivo ad immersione in olio da 20x o superiore. Mediante software di acquisizione immagini, identificare le cellule HeLa GFP infette da chlamydia che appaiono come cellule verdi contenenti grandi fori neri.

Nella finestra di dialogo della configurazione dell'acquisizione, impostare il software in modo da acquisire il canale verde e qualsiasi altro canale aggiunto nel campione. Utilizzare il pulsante di acquisizione/registrazione per ottenere l'immagine nei momenti desiderati post-infezione. Rimuovere le cellule HeLa GFP infette da Chlamydia dall'incubatore e posizionare la piastra su un microscopio a fluorescenza invertito.

Concentrarsi sulla regione centrale delle cellule, dove le inclusioni raggiungono il diametro e la resa massimi. Acquisire immagini con bordi nitidi in almeno 10 campi per pozzetto. I pozzetti rappresentano tipicamente replicati o variabili sperimentali.

Per trovare le cellule GFP hela nella scheda delle misurazioni, utilizzare il comando "trova oggetti" e selezionare il canale verde. Regolare l'intensità della soglia in base alle intensità relative delle cellule. Contare manualmente il numero di inclusioni o compartimenti neri e le cellule GFP hela ad occhio oppure utilizzare algoritmi del software di imaging per identificare e contare automaticamente le inclusioni.

Filtrare gli oggetti selezionati mantenendo solo quelli maggiori di cinque micrometri quadrati. Definire questa popolazione come popolazione uno. Utilizzando questa popolazione, applicare il comando per riempire i fori negli oggetti, utilizzando come input il risultato di questo passaggio per generare la popolazione due.

Sottrarre la popolazione uno dalla popolazione due per ottenere inclusioni di clamidia positivamente marcate, designate come popolazione tre. Utilizzare il comando filtro popolazione per applicare un filtro dimensionale alla popolazione tre. Ad esempio, per mantenere oggetti di dimensioni superiori a 25 micrometri quadrati per le inclusioni in cellule infettate per 24 ore o più, nei tempi precoci di infezione impostare il filtro dimensionale in modo da mantenere oggetti di dimensioni superiori a quattro micrometri quadrati.

Essendo queste inclusioni molto più piccole, il filtro per dimensione consente di ottenere una popolazione di oggetti identificati come inclusioni. Utilizzare il software di imaging per calcolare dati quantitativi a partire dalle immagini, come il numero di inclusioni, la dimensione delle inclusioni e la circonferenza delle inclusioni. Dopo l'infezione con Chlamydia, le inclusioni sono facilmente visibili come punti neri e le cellule ospiti o la proteina fluorescente espressa da Chlamydia all'interno delle cellule ospiti possono essere chiaramente riconosciute, caratteristica che può essere sfruttata per l'identificazione automatizzata in numerosi campi visivi e/o trattamenti.

Come dimostrato in questo grafico, un'applicazione importante è la determinazione delle unità formanti inclusioni di clamidia in cellule infette vive, eliminando così la necessità di procedure di immunofluorescenza, che sono sia lunghe sia costose. Un'altra caratteristica fondamentale di questo approccio di imaging è che può essere facilmente applicato a qualsiasi specie o ceppo di clamidia. In questo esempio, è stata eseguita un'analisi temporale di cellule HeLa GFP infettate con una delle quattro specie o ceppi di clamidia, per ciascuna di queste specie e ceppi.

Le inclusioni sono state marcate e analizzate per calcolare la loro area media, lunghezza del perimetro e numero per cellula nei tempi indicati. Questi attributi forniscono informazioni importanti sulla biologia delle inclusioni clamidiali, inclusa la loro interazione con la cellula ospite. Qui viene mostrato un video di cellule m cherry HeLa infettate con GFPC, Tracom L due, composto da immagini a intervalli di ripresa temporale di cinque minuti per 125 minuti, a partire da 48 ore dopo l'infezione.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare questa tecnica di imaging inverso per visualizzare non solo le inclusioni da *Chlamydia*, ma anche per quantificare la dinamica delle inclusioni, come area, perimetro dell'inclusione e numero di inclusioni per cellula. Questa tecnica è conveniente rispetto ad altre tecniche di visualizzazione più tradizionali e funziona con tutte le specie e i ceppi di *Chlamydia*.