Name: Utilizzo di proteine fluorescenti per visualizzare e Quantificazione Chlamydia Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Scopri come visualizzare e quantificare la dinamica di crescita delle inclusioni di Chlamydia in cellule viventi utilizzando proteine fluorescenti. Questo metodo consente l'analisi in tempo reale dell'infettività batterica.

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Gli autori ringraziano Ian Clarke e P. Scott Hefty per i plasmidi pGFP-SW2 e pASK-GFP-mKate2-L2, rispettivamente. Ringraziamo Paul Miller per l'assistenza tecnica e Richard Stephens per le altre risorse. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NIH AI095603 (KH).

1. Generazione di linee cellulari Host fluorescente <ol><li> Giorno 1. Cellule piastra 293T (o altra linea di confezionamento retrovirali) su 6 pozzetti a 2 x 10 6 cellule / Beh, per essere ~ 75% confluenti il giorno successivo. Se lo si desidera, da utilizzare piastre pozzetti in duplicato per ciascuna retrovirus. </li><li> Giorno 2. Le cellule Aspirare e aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutammina). Trasfettare le cellule con 5-8 mcg ciascuna di vettore retrovirale (contenente GFP) e la confezione vettore (ad es., PVSVg) utilizzando Lipofectamine 2000 o reagente simile e seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Incubare le cellule con il DNA per 4-6 ore in una C CO 2 incubatore 37 °, e successivamente sostituire medio con 1 ml di terreno di coltura. </li><li> Incubare le cellule per 48 ore a 37 ° C CO 2 incubatore. </li><li> 3. Piatto cellule Day bersaglio (ad es., HeLa) su 6 pozzetti a una densità approssimativa di 10 5 cellule / pozzetto, per essere ~ 50% confluenti ilIl giorno dopo. Verificare trasfezione in cellule 293T positivo monitorando fluorescenza GFP su un microscopio invertito. </li><li> Giorno 4. Raccogliere-retrovirus contenente supernatanti le cellule 293T con una pipetta e filtrare il surnatante attraverso un filtro siringa da acetato di 0,45 micron di cellulosa. </li><li> Rimuovere medio da cellule HeLa e aggiungere 0,5 ml di mezzo di crescita, contenente 16 mg / ml polibrene. Aggiungi ~ 0,5 ml di retrovirus filtrato alle cellule goccia a goccia e incubare le cellule in una C CO 2 incubatore 37 ° per 24 ore. Conservare eventuali retrovirus rimanenti (cioè dal duplicare pozzo) a 4 ° C. </li><li> Giorno 5. Se sono stati fatti pozzetti in duplicato per generare retrovirus in più, ripetere il punto 1.7 di infettare in serie con le restanti particelle retrovirali. </li><li> Giorno 6. Passaggio transfettate cellule HeLa 1: 1 in 10 cm piatto contenente selezione antibiotica (ad esempio 500 mg / ml di neomicina). </li><li> Attendere un tempo sufficiente per cellule trasdotte a ricrescere in presenza di selezione antibiotic, dopo di che le cellule possono essere propagate per tecniche standard con una minore concentrazione di selezione antibiotica (es., 200 ug / ml di neomicina). Nota: Le cellule possono anche essere selezionati per clonale luminosità ideale in questo momento, se necessario. </li></ol> 2. Generazione di GFP che esprimono Chlamydia trachomatis <ol><li> Preparare 2x CaCl 2 tampone (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl 2) e tampone 4SP (0,4 M di saccarosio, 16 mM Na 2 HPO 4). </li><li> Giorno 1. Scongelare congelato C. trachomatis magazzino dal ghiaccio e portare subito 10 microlitri di batteri in 50 microlitri 2x CaCl buffer di 2. Aggiungere 3 mg plasmide DNA (ad es., Pask-GFP-mKate2-L2), mescolare bene e incubare per 30 minuti a 25 ° C. </li><li> Durante questa fase, preparare cellule ospiti da trypsinizing un pallone T-75 di cellule McCoy in una provetta da centrifuga. Centrifugare la sospensione cellulare a 50 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Resuspend pellet cellulare in volume appropriato di 1x tampone CaCl 2 per ottenere una concentrazione finale di 4 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Dopo 30 min di incubazione (dal punto 2.2), aggiungere 100 ml preparati cellule McCoy per tubo miscela trasformazione (volume totale 200 ml) ed incubare un ulteriore 20 min a 25 ° C. Aggiungere 100 ml di questa miscela cellula trasformata per un singolo bene da un 6-pozzetti e overlay con mezzo di 2 ml di crescita. Incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 2 giorni. </li><li> Giorno 3. Le cellule Lyse McCoy infettate con C. trachomatis sostituendo medio con 1 ml di dH 2 O e raschiare le cellule con un piegato punta pipetta 1000 ml. Aggiungere 1 ml di tampone 4SP e passare sospensione attraverso un ago 27,5 G ~ 5 volte per lisi cellulare efficiente e il rilascio di C. trachomatis. </li><li> Trasferimento 2 ml di lisato cellulare contenente C. trachomatis in un pallone T-75 contenente un monostrato confluente di fresco placcato McCcellule Oy; aggiungere 8 ml DMEM (senza FBS) e incubare per 2 ore a 25 ° C per consentire C. trachomatis di aderire alle cellule. </li><li> Aspirare le cellule e aggiungere terreno di coltura fresco supplementato con 10 U / ml di penicillina G e 1 mg / ml cicloeximide. Incubare per 48 h beuta in un incubatore a 37 ° C CO 2. </li><li> Giorno 4. Verificare al microscopio ottico che le cellule sono infettate e inclusioni contengono Chlamydia aberrante. Identificare inclusioni come vacuoli luminosi su un microscopio a luce normale, e corpi clamidia aberranti come oggetti anulari all&#39;interno di inclusioni che sono maggiori di 2 micron di diametro. </li><li> Giorno 5. Lyse cultura sostituendo medie, con 2 ml di dH 2 O e raschiare le cellule in una sospensione. Aggiungere 2 ml di tampone 4SP e passare sospensione attraverso un ago 27,5 G ~ 5 volte. </li><li> Utilizzare 2 ml di lisato cellulare per infettare un nuovo monostrato di cellule McCoy in un singolo pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Incubare le cellule con lisato per 2 ore a 25 ° C, aspirare e aggiungere la crescita frescoterreno contenente penicillina G e cicloesimide. </li><li> Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C CO 2 per 3-5 giorni, a seconda di salute generale delle cellule. </li><li> Ripetere i punti 2.9-2.10 una o più volte, se necessario, le culture passaging nei pozzetti fresche in un 6-bene fino a quando le normali inclusioni ricerca (privi di organi aberranti) sono emerse. In questo momento utilizzare un microscopio a fluorescenza invertito per controllare che C. trachomatis esprimere mKate2 (rosso). </li><li> Scalare colture infette per la produzione delle scorte di clamidia ad alto titolo, ad esempio raccogliendo trasformanti Chlamydia da cellule infettate McCoy o HeLa cresciute in T-150 palloni. </li></ol> 3. infettare le cellule con Chlamydia <ol><li> Piastra cellule GFP-HeLa sulla nave cultura desiderato, ad esempio piatti di vetro inferiore o diapositive da camera per imaging ad alta risoluzione, o piastre da 24 pozzetti per la determinazione IFU e lo screening pozzetti. </li><li> Scongelare frotubo zen contenente C. trachomatis, C. muridarum, o C. pneumoniae su ghiaccio e diluire in HBSS alla molteplicità desiderata di infezione (MOI), per esempio MOI = 1. </li><li> Eseguire infezioni statiche o centrifugazione-aided base al particolare ceppo Chlamydia che verrà utilizzato. <ol><li> Per le infezioni da C. trachomatis LGV sierotipo L2 o C. muridarum, lavare le cellule GFP-HeLa con HBSS e incubare con i batteri diluito per 2 ore a 25 ° C. Aspirare e lavare le cellule con HBSS, e incubare cellule in terreno di coltura a 37 ° C CO 2 incubatore. </li><li> Per le infezioni da C. trachomatis sierotipo D o C. pneumoniae, lavare le cellule GFP-HeLa con HBSS e aggiungere batteri diluiti alle cellule. Mettere piatto pozzetti o un piatto fondo di vetro (fissato con nastro in un coperchio piatto pozzetti) in un supporto di pozzetti piatto di un rotore attacco oscillante secchio in una centrifuga da banco. </li><li> Centrifugare le cellule a 900 xg a 25 ° C per 1 ora. </li&gt; <li> Rimuovere recipienti di coltura da centrifuga e posto in un incubatore a 37 ° C di CO 2 per 1 ora. </li><li> Aspirare le cellule in un armadio biosicurezza, lavare le cellule due volte con HBSS, e aggiungere mezzo di crescita fresco. Cellule posto in un incubatore CO 2 C 37 °. </li></ol></li></ol> 4. Visualizzazione cellulare dal vivo di Chlamydia Inclusioni <ol><li> Rimuovere Chlamydia infettate cellule GFP-HeLa di CO 2 incubatore e sostituirlo media con RPMI senza rosso fenolo + 5% FBS. </li><li> Montare le cellule su un microscopio a fluorescenza invertito (Nikon Eclipse Ti-E o simile) con un obiettivo 20X o superiore olio. </li><li> Utilizzando il software di imaging (Volocity 6 o simile), si concentrerà su e identificare Chlamydia infettato cellule GFP-HeLa: cellule verdi contenenti grandi buchi neri (inclusioni Chlamydia). </li><li> Segnare le posizioni xyz delle regioni contenenti Chlamydia cellule -infected di interesse utilizzando software di imaging (Volocity 6 o simile). Eseguire questo manualmente &#39;Aggiunta di punti &quot;, mentre nella modalità di visualizzazione XY Stage. In questo modo, le coordinate xyz vengono salvate per ogni punto contrassegnato. </li><li> Nella finestra di dialogo Installazione di acquisizione, configurare il software per l&#39;acquisizione verde (GFP, HeLa citoplasma) e rosso (mKate2, C. trachomatis) canali, e ad un tasso di nuovi fotogrammi al canale ogni 5 min. </li><li> Acquisire la sequenza di immagini tramite l&#39;acquisizione protocollo è entrato sopra cliccando sul pulsante &quot;Capture / Record&quot;. </li></ol> 5. La quantificazione dei parametri di crescita di inclusione in cellule vive <ol><li> A volte desiderato dopo l&#39;infezione (ad es., 24, 48 HPI) rimuovere Chlamydia infettato cellule GFP-HeLa da incubatore e montare su un microscopio a fluorescenza invertito. Nota: Un obiettivo 20X o 40X aria con un alto NA è più adatto per piastre da 24 pozzetti, e un obiettivo di olio 40X è raccomandato per le diapositive da camera. Crescere le cellule su entrambi substrato per questo culoay. </li><li> Focus su midplane di cellule, in cui inclusioni sono al loro diametro massimo e produrre bordi nitidi. </li><li> Acquisire le immagini per molti campi a ciascun pozzetto (almeno il 10 per bene); pozzi in genere rappresentano repliche o variabili sperimentali. </li><li> Enumerare il numero di inclusioni manualmente, a occhio (inclusioni sono compartimenti neri nelle cellule GFP-HeLa) o utilizzare algoritmi software di imaging per identificare e contare automaticamente inclusioni. <ol><li> Trova le cellule GFP-HeLa di intensità di fluorescenza (&#39;Trova oggetti&#39; di comando) e regolare l&#39;intensità soglia di fluorescenza in base a intensità relative delle cellule. </li><li> Filtrare gli oggetti selezionati con le linee guida di dimensioni di mantenere solo quelli maggiori di 5 micron 2. Si tratta di &#39;popolazione 1&#39;. </li><li> Applica &#39;riempire i fori in Objects comando utilizzando&#39; popolazione 1 &#39;come ingresso. Questo passaggio genera &#39;popolazione 2&#39;. </li><li> Sottrarre &#39;popolazione 1&#39; da &#39;pOPOLAZIONE 2 &#39;a cedere positivamente segnato inclusioni Chlamydia, designati come&#39; popolazione 3 &#39;. </li><li> Applicare il filtro dimensione di &#39;popolazione 3&#39; (comando &#39;Filter Popolazione&#39;), ad esempio, mantenere gli oggetti superiore a 25 micron 2 per inclusioni in cellule infettate per 24 ore o più a lungo. Per i tempi di infezione precoce, come ad esempio prima di 18 ore, filtrare dimensioni impostate per tenere gli oggetti maggiori di 4 micron 2, come queste inclusioni sono molto più piccoli. Risultati Dimensione filtro in una popolazione di oggetti designati come &quot;inclusioni&quot;. </li><li> Calcolare i dati quantitativi dalle immagini, ad esempio, il numero di inclusione, la dimensione di inclusione, e la circonferenza inclusione, utilizzando software di imaging. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui si descrive la strategia sperimentale per la generazione di cellule ospiti fluorescenti per la visualizzazione in tempo reale e l&#39;analisi delle inclusioni Chlamydia. Questo approccio visualizzazione vacuolo conferisce il potente capacità di illuminare, monitorare e quantitativamente misurare le proprietà dinamiche delle inclusioni clamidia tra popolazioni di cellule o in singole cellule nel corso del tempo. Inclusioni Chlamydia nelle cellule proteina marcata fluorescenti sono sorprendentemente ...

Le malattie infettive causate da specie del batterio Chlamydia intracellulare suscitare un peso importante sulla salute globale, tra cui malattia sessualmente trasmessa, malattia infiammatoria pelvica, la cecità, la polmonite e, eventualmente, l&#39;aterosclerosi 1-4. La capacità di Chlamydia di interagire con la cellula ospite, all&#39;interno di un vacuolo (chiamato l&#39;inclusione), è un fattore determinante per il loro successo infezione delle cellule e l&#39;host. L&#39;inclusione è un compartimento patogeno romanzo che permette la crescita da Chlamydia e viene modificato dinamicamente durante l&#39;intero ciclo di sviluppo di 2-3 giorni di Chlamydia 5. La natura obbligato intracellulare di chlamydiae presenta numerose sfide per la comunità di ricerca, in particolare per lo studio della biologia direttamente unico dell&#39;inclusione. Un importante ostacolo è stata l&#39;impossibilità di visualizzare in modo efficiente o Chlamydia intracellulare o la loro inclusione con approccio fluorescentees nelle cellule viventi. Una recente scoperta ha finalmente rivelato i mezzi per generare GFP che esprimono C. trachomatis 6; tuttavia, questo risultato non ha ancora portato a un&#39;etichettatura specifica dell&#39;inclusione. Alcune tecniche sono state descritte per l&#39;etichettatura di batteri e inclusioni 7,8, ma soffrono di carenze quali la non specificità, transitorietà e la suscettibilità alle photobleaching. Una scoperta fondamentale per il nostro gruppo ha stabilito una nuova strategia per illuminare l&#39;inclusione mediante GFP che esprimono cellule ospiti 9. Questa strategia sfrutta razionalmente l&#39;impermeabilità intrinseca della membrana inclusione di molecole maggiore di 520 Da 10. Quando le cellule sono progettati per esprimere stabilmente una particolare proteina fluorescente citosolica (ad esempio, GFP o mCherry), inclusioni Chlamydia sono visibili con notevole chiarezza la loro completa esclusione di fluorescenza. Questa strategia di imaging inversa permette la visualizzazione immediata di inclusioni per tutti Chlspecie amydia e può essere facilmente adattato per la maggior parte delle cellule ospiti d&#39;interesse. A dimostrazione della sua utilità, questo metodo è stato utilizzato in precedenza per rivelare e definire le vie di uscita per Chlamydia spp cellulari 9. Qui, abbiamo ulteriormente dimostra come si esegue questo metodo, e può essere sfruttata per ricavare dati quantitativi chiave su dinamiche di crescita inclusione. Inoltre, si può effettivamente sostituire costosi metodi di enumerazione base di anticorpi e può essere utilizzato in tandem con altre etichette fluorescenti, come mKate2 esprimono Chlamydia 11. Questa potente combinazione di strumenti consente l&#39;esplorazione delle proprietà fisiche della membrana inclusione chlamydial all&#39;interno delle cellule ospiti vivente.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &; m filtri</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>10131</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 senza rosso fenolo</td><td>Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina G</td><td>Sigma</td><td>13752</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per camera, Lab-Tek II</td><td>Nunc</td><td>154526, 154534</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e quantificazione<em&gt; chlamydia</em&gt; vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Il batterio intracellulare obbligato Chlamydia provoca un grande onere per la salute pubblica globale. C. trachomatis è la principale causa batterica di infezioni sessualmente trasmissibili e anche la principale causa di cecità prevenibile nel mondo. Un fattore determinante per il successo dell'infezione delle cellule ospiti da parte della clamidia è la capacità del batterio di manipolare la segnalazione delle cellule ospiti dall'interno di un nuovo compartimento vacuolare chiamato inclusione. Dall'interno dell'inclusione, i clamidia acquisiscono i nutrienti necessari per la loro crescita evolutiva di 2-3 giorni e secernono inoltre un pannello di proteine effettrici sulla faccia citosolica della membrana del vacuolo e nel citosol ospite. Le lacune nella nostra comprensione della biologia della clamidia, tuttavia, presentano sfide significative per la visualizzazione e l'analisi di questo compartimento intracellulare. Recentemente, è stata descritta una strategia di imaging inverso per visualizzare l'inclusione utilizzando cellule ospiti che esprimono GFP. Questo approccio sfrutta razionalmente l'impermeabilità intrinseca della membrana di inclusione a molecole di grandi dimensioni come la GFP. In questo lavoro, descriviamo come vengono generate cellule ospiti che esprimono GFP o mCherry per la successiva visualizzazione delle inclusioni di clamidia. Inoltre, questo metodo ha dimostrato di sostituire efficacemente i costosi metodi di enumerazione basati su anticorpi, può essere utilizzato in tandem con altre marcature fluorescenti, come la clamidia che esprime GFP, e può essere sfruttato per ricavare dati quantitativi chiave sulla crescita della membrana di inclusione da una serie di specie e ceppi di Chlamydia.

Le cellule di mammiferi che esprimono proteine ​​fluorescenti citosoliche (ad esempio, GFP) possono essere progettati per consentire l&#39;illuminazione di inclusioni Chlamydia nelle colture cellulari, vivi infetti. Al momento l&#39;infezione da Chlamydia, inclusioni sono facilmente visibili come macchie nere nelle cellule ospiti (Figura 1). La chiarezza di inclusioni-fluorescenza carente può essere sfruttata per l&#39;identificazione automatizzata di inclusioni in numerosi ca...

Viene descritto un metodo basato su proteine fluorescenti su cellule vive per illuminare i vacuoli cellulari (inclusioni) contenenti clamidia. Questa strategia consente una determinazione rapida e automatizzata dell'infettività della clamidia nei campioni e può essere utilizzata per studiare quantitativamente le dinamiche di crescita delle inclusioni.

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare la dinamica di crescita delle inclusioni da clamidia in cellule vive. Questo viene ottenuto innanzitutto generando cellule ospiti fluorescenti che esprimono stabilmente una proteina fluorescente come la GFP nel loro citoplasma. Successivamente, le cellule ospiti vengono infettate con clamidia e lasciate incubare.Quindi, le cellule infette vengono visualizzate mediante microscopia a fluorescenza in tempo reale. Infine, le caratteristiche delle inclusioni di Chlamydia vengono quantificate attraverso un software di analisi microscopica; in ultima analisi, la microscopia a fluorescenza in tempo reale viene utilizzata per visualizzare le inclusioni clamidiali all'interno della cellula ospite e per misurare parametri biologici delle inclusioni al fine di ottenere risultati quantitativi. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il conteggio basato su anticorpi, sono che questa strategia di imaging inverso può essere applicata su cellule vive e può essere utilizzata in combinazione con altre etichette fluorescenti per quantificare la dinamica delle inclusioni di tutte le specie di Chlamydia.Inoltre, a differenza dei metodi convenzionali che etichettano i batteri all'interno delle cellule, questo approccio illumina la membrana dell'inclusione in cellule vive e può quindi rivelare importanti proprietà dinamiche di questo compartimento contenente il patogeno. Dopo aver generato cellule HeLa fluorescenti, secondo il protocollo descritto, piastrare le cellule HeLa-GFP su un contenitore da coltura desiderato, come piastre con fondo in vetro per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione, piastre a 24 pozzetti per la determinazione delle IFU e piastre multipozzetto per lo screening; scongelare un tubo congelato contenente Crich Cotus, oppure qualsiasi altro ceppo di Chlamydia desiderato, in ghiaccio e diluire in HBSS al multiplo di infezione desiderato. Per eseguire un'infezione statica con Crich Cotus, LGV serovar L2 (L2/434/Bu), aspirare il mezzo dai pozzetti e utilizzare HBSS per lavare le cellule HeLa-GFP.Aggiungere batteri diluiti nei pozzetti e incubare a 25 gradi Celsius per due ore, aspirare le cellule e lavare con HBSS. Successivamente, dopo aver aggiunto il mezzo di crescita, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore a biossido di carbonio per eseguire un'infezione assistita da centrifugazione con crich verso il sierotipo D o qualsiasi altro ceppo di Chlamydia. Utilizzare HBSS per lavare le cellule HeLa GFP e aggiungere batteri diluiti alle cellule.Quindi posizionare la piastra di cellule infette nel portaprolle a cestello oscillante di una centrifuga da banco. Centrifugare le cellule a 900 ×g e 25 °C per un'ora. Successivamente, posizionare i contenitori di coltura in un incubatore con anidride carbonica a 37 °C per un'ora all'interno di una cappa biologica, aspirare il liquido, lavare le cellule due volte con HBSS e aggiungere il mezzo di crescita.Incubare la piastra di cellule infette a 37 gradi Celsius. Per visualizzare le inclusioni di chlamydia, rimuovere le cellule HeLa GFP infette da chlamydia dall'incubatore a biossido di carbonio e utilizzare RPMI senza fenolo rosso e con 5% di FBS per sostituire il mezzo. Posizionare la piastra o la piastra multipozzetta su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di obiettivo ad immersione in olio da 20x o superiore. Mediante software di acquisizione immagini, identificare le cellule HeLa GFP infette da chlamydia che appaiono come cellule verdi contenenti grandi fori neri.Nella finestra di dialogo della configurazione dell'acquisizione, impostare il software in modo da acquisire il canale verde e qualsiasi altro canale aggiunto nel campione. Utilizzare il pulsante di acquisizione/registrazione per ottenere l'immagine nei momenti desiderati post-infezione. Rimuovere le cellule HeLa GFP infette da Chlamydia dall'incubatore e posizionare la piastra su un microscopio a fluorescenza invertito.Concentrarsi sulla regione centrale delle cellule, dove le inclusioni raggiungono il diametro e la resa massimi. Acquisire immagini con bordi nitidi in almeno 10 campi per pozzetto. I pozzetti rappresentano tipicamente replicati o variabili sperimentali.Per trovare le cellule GFP hela nella scheda delle misurazioni, utilizzare il comando "trova oggetti" e selezionare il canale verde. Regolare l'intensità della soglia in base alle intensità relative delle cellule. Contare manualmente il numero di inclusioni o compartimenti neri e le cellule GFP hela ad occhio oppure utilizzare algoritmi del software di imaging per identificare e contare automaticamente le inclusioni.Filtrare gli oggetti selezionati mantenendo solo quelli maggiori di cinque micrometri quadrati. Definire questa popolazione come popolazione uno. Utilizzando questa popolazione, applicare il comando per riempire i fori negli oggetti, utilizzando come input il risultato di questo passaggio per generare la popolazione due.Sottrarre la popolazione uno dalla popolazione due per ottenere inclusioni di clamidia positivamente marcate, designate come popolazione tre. Utilizzare il comando filtro popolazione per applicare un filtro dimensionale alla popolazione tre. Ad esempio, per mantenere oggetti di dimensioni superiori a 25 micrometri quadrati per le inclusioni in cellule infettate per 24 ore o più, nei tempi precoci di infezione impostare il filtro dimensionale in modo da mantenere oggetti di dimensioni superiori a quattro micrometri quadrati.Essendo queste inclusioni molto più piccole, il filtro per dimensione consente di ottenere una popolazione di oggetti identificati come inclusioni. Utilizzare il software di imaging per calcolare dati quantitativi a partire dalle immagini, come il numero di inclusioni, la dimensione delle inclusioni e la circonferenza delle inclusioni. Dopo l'infezione con Chlamydia, le inclusioni sono facilmente visibili come punti neri e le cellule ospiti o la proteina fluorescente espressa da Chlamydia all'interno delle cellule ospiti possono essere chiaramente riconosciute, caratteristica che può essere sfruttata per l'identificazione automatizzata in numerosi campi visivi e/o trattamenti.Come dimostrato in questo grafico, un'applicazione importante è la determinazione delle unità formanti inclusioni di clamidia in cellule infette vive, eliminando così la necessità di procedure di immunofluorescenza, che sono sia lunghe sia costose. Un'altra caratteristica fondamentale di questo approccio di imaging è che può essere facilmente applicato a qualsiasi specie o ceppo di clamidia. In questo esempio, è stata eseguita un'analisi temporale di cellule HeLa GFP infettate con una delle quattro specie o ceppi di clamidia, per ciascuna di queste specie e ceppi.Le inclusioni sono state marcate e analizzate per calcolare la loro area media, lunghezza del perimetro e numero per cellula nei tempi indicati. Questi attributi forniscono informazioni importanti sulla biologia delle inclusioni clamidiali, inclusa la loro interazione con la cellula ospite. Qui viene mostrato un video di cellule m cherry HeLa infettate con GFPC, Tracom L due, composto da immagini a intervalli di ripresa temporale di cinque minuti per 125 minuti, a partire da 48 ore dopo l'infezione.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare questa tecnica di imaging inverso per visualizzare non solo le inclusioni da *Chlamydia*, ma anche per quantificare la dinamica delle inclusioni, come area, perimetro dell'inclusione e numero di inclusioni per cellula. Questa tecnica è conveniente rispetto ad altre tecniche di visualizzazione più tradizionali e funziona con tutte le specie e i ceppi di *Chlamydia*.

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