Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i meccanismi attraverso cui il batterio che causa la meningite infetta i vasi sanguigni umani in vivo. Questo viene ottenuto innanzitutto innestando la pelle umana su un topo immunodeficiente, introducendo così vasi sanguigni dermici umani. Nel secondo passaggio, i topi umanizzati vengono infettati con il batterio.

L'infezione viene quindi lasciata procedere per un periodo di tempo predeterminato. Nell'ultima fase, vengono prelevati campioni di sangue e di tessuto per valutare l'esito dell'infezione. In definitiva, una combinazione di istologia, immunofluorescenza e analisi del sangue e dei tessuti viene utilizzata per studiare l'andamento dell'infezione nei vasi umani.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come i modelli di coltura cellulare o i modelli animali, è che per la prima volta possiamo osservare la tipica patologia clinica che si verifica durante queste infezioni. Non appena possibile dopo il prelievo, pulire la superficie della pelle umana con etanolo al 70% e quindi appoggiarla piatta su una superficie ben pulita, preferibilmente sotto una cappa a flusso laminare. Successivamente, utilizzare un dermatomo con uno spessore preimpostato per tagliare fette di 200-400 micrometri dalla superficie della pelle.

Verificare l'integrità delle fette, quindi tagliarle ulteriormente in quadrati di due per due centimetri. Posizionare i quadrati in PBS e successivamente pulire l'area rasata di un topo beige immunodeficiente severo combinato, anestetizzato e preparato chirurgicamente, di età compresa tra sei e otto settimane, con etanolo al 70%. Dopo aver applicato l'anestetico locale sul sito del trapianto, utilizzare forbici curve per rimuovere con attenzione lo strato superficiale della pelle del topo in un'area leggermente più piccola rispetto ai frammenti di trapianto, avendo cura di non disturbare la vascolarizzazione sottostante.

Procedendo rapidamente per evitare che l'innesto si secchi, posizionare una delle fette di pelle umana sul letto dell'innesto, assicurandosi che il lato epidermico sia rivolto verso l'alto. Allineare il margine del tessuto e fissarlo con colla per tessuti. Quindi adattare con cura il resto della pelle umana al letto dell'innesto, applicando piccole quantità di colla per tessuti lungo ciascun bordo.

Tagliare sempre la pelle umana alle dimensioni adatte piuttosto che allargare il letto del trapianto. Dopo aver verificato che ogni angolo sia fissato, pulire l'area con una soluzione di iodio e applicare un cerotto in modo saldo ma non troppo stretto, con la parte imbottita sopra il trapianto, avendo cura che la respirazione dell'animale non venga compromessa; quindi fissare il cerotto con del nastro adesivo e lasciare che l'animale si riprenda su una superficie calda. Una volta sveglio, restituire l'animale alla sua gabbia fino all'iniezione batterica per re-inoculare una coltura da piastra notturna in coltura liquida.

La mattina dell'infezione, quando i batteri raggiungono la concentrazione desiderata, diluire le cellule a un valore di 1 × 10⁷ unità formanti colonie per millilitro. Successivamente, dopo l'anestesia, verificare la sedazione dei topi trapiantati mediante pinzatura del dito del piede e posizionare gli animali su un tappetino riscaldante.

Mettere un unguento oculare sugli occhi dell'animale, quindi iniettare per via ip ogni mouse con otto milligrammi di transferina umana in soluzione salina. Successivamente, per ogni animale, tagliare la punta della coda e spalmare una piccola goccia di sangue proveniente dalla coda su una piastra di agar per confermare che il sangue sia sterile prima dell'infezione.

Quindi iniettare 100 microlitri della coltura batterica per via endovenosa mediante iniezione retro-orbitale. Dopo alcuni minuti, tagliare nuovamente l'estremità della coda e stendere questo campione di sangue su piastre di agar fresche. Per determinare immediatamente dopo l'infezione le unità formanti colonie nel sangue, sigillare la coda con colla tissutale e quindi diluire l'inoculo batterico e stenderlo su piastre di agar contenenti gli antibiotici appropriati.

Per determinare le unità formanti colonie dell'inoculo a sei ore dall'infezione, prelevare una piccola quantità aggiuntiva di sangue dalle code di ciascun topo, quindi diluire e seminare le gocce di sangue come appena illustrato per determinare le unità formanti colonie a sei ore. Incubare quindi tutte le piastre a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5% per tutta la notte per eseguire la conta delle unità formanti colonie negli organi degli animali infetti.

Iniziare praticando un'incisione mediana in ciascun topo sottoposto a eutanasia. Successivamente, per ogni animale, tagliare attraverso le costole ed effettuare un'incisione nel cuore. Utilizzare una siringa sterile per prelevare la maggior quantità possibile di sangue dal cuore e dalla cavità toracica, e trasferirlo in tubi sterili individuali per ciascun campione.

Successivamente, rimuovere gli organi di interesse e quindi trasferire i trapianti di pelle e le sezioni corrispondenti di pelle di topo su una piastra sterile per animale. Lasciare coagulare il sangue raccolto per 15 minuti, quindi centrifugarlo. Rimuovere quindi il plasma dal sangue e conservarlo a meno 80 gradi Celsius per analisi successive.

Successivamente, pesare le provette di omogeneizzazione contenenti ciascuna 500 microlitri di PBS. Quindi utilizzare una punta da biopsia sterile per prelevare campioni bioptici di quattro millimetri da ciascun tessuto dissezionato. Posizionare le biopsie singolarmente nelle provette di omogeneizzazione, aggiungendo una perla di due millimetri in ogni provetta contenente un campione di pelle.

Conservare i tessuti rimanenti in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per la microscopia, e pesare le provette da omogeneizzazione per determinare il peso della biopsia. Successivamente, omogeneizzare i campioni a 6.000 giri al minuto per 30 secondi, ripetendo l'omogeneizzazione della pelle fino a quando l'omogeneato non diventa solido. Infine, distribuire le sospensioni cellulari da ogni provetta su piastre di agar fresche e coltivare le colture durante la notte a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5%.

Per determinare il numero di unità formanti colonie negli organi in questi risultati rappresentativi, è stato utilizzato un ceppo positivo per GFP di N. meningitidis, sierogruppo C.

I conteggi ematici hanno mostrato che cinque minuti dopo l'iniezione endovenosa di un milione di unità formanti colonie di batteri, era presente in circolo una media di 1,5 × 10⁵ unità formanti colonie per millilitro di sangue. Dopo sei ore, i conteggi medi erano di 4,8 × 10⁴ unità formanti colonie per millilitro; entro 24 ore, i conteggi medi erano di 2,4 × 10⁴ unità formanti colonie per millilitro.

Tuttavia, in questo gruppo di 10 topi, cinque non presentavano batteri circolanti rilevabili, mentre gli altri cinque avevano conteggi relativamente elevati. Queste barre nei grafici mostrano i valori mediani dei conteggi di UFC per ciascun gruppo, ottenuti dalla pelle. I campioni mostrano che la maggioranza dei topi presenta conteggi considerevoli nella pelle umana, con una media di 2,1 volte 10 alla quarta UFC per milligrammo di tessuto a sei ore e di 4,4 volte 10 alla seconda UFC per milligrammo di tessuto a 24 ore.

I campioni di pelle del topo controlaterali non hanno mostrato conteggi batterici a 24 ore e solo un numero molto basso a sei ore, dimostrando una marcata preferenza per la meningite endogena nei vasi umani del tessuto innestato. In generale, i conteggi batterici erano molto bassi o non rilevabili negli altri organi campionati, anche se due animali hanno mostrato conteggi, che potrebbero essere correlati a elevati numeri circolanti di batteri. Questo modello può inoltre essere utilizzato per determinare il ruolo dei fattori di virulenza in vivo.

Ad esempio, in questo esperimento, sono stati utilizzati ceppi batterici privi di pilo di tipo quattro funzionale; i topi infettati con questi ceppi mutanti non hanno mostrato adesione batterica nei trapianti di pelle umana, confermando il ruolo cruciale svolto dal pilo di tipo quattro nell'adesione in vivo. In queste immagini al microscopio confocale di un trapianto cutaneo, ottenute due ore dopo l'infezione, è possibile osservare i vasi umani marcati con lectina UEA coniugata a romina. Il confine dermo-epidermico della pelle è chiaramente identificabile e i batteri infettanti positivi per GFP e la meningite possono essere chiaramente osservati lungo i vasi.

Questo innesto di pelle umana colorato con ematossilina ed eosina dimostra infiammazione e fuoriuscite vascolari, nonché trombosi concentrate nei vasi prossimi al confine dermo-epidermico. Ventiquattro ore dopo l'infezione, in circa il 30% dei casi, le adesioni batteriche nella pelle hanno portato allo sviluppo di porpora rilevabile macroscopicamente. Pertanto, lo sviluppo di questa tecnica apre la strada ai ricercatori impegnati nello studio delle interazioni tra ospite e patogeno per analizzare i meccanismi della malattia nel contesto dei vasi umani.