Name: Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Scopri come studiare le infezioni batteriche nel microcircolo umano utilizzando un modello murino umanizzato con innesti di pelle. Questo metodo permette di osservare la patologia clinica delle infezioni da Neisseria meningitidis in vivo.

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Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio Dumenil, in particolare Silke Silva per la lettura critica del manoscritto. Il reparto di chirurgia Hôpital européen Georges-Pompidou (HEGP) Dr. David Maladry. Michael Hivelin e il Dr. Patrick Bruneval, Dipartimento di Patologia presso HEGP. L&#39;impianto degli animali a PARCC, guidato da Elizabeth Huc. Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti agenzie di sovvenzione Marie Curie IEF comunione no. 273.223 (KM), ATIP-Avenir sovvenzione da INSERM, attrezzature CODDIM concessione (Ile de France Region), FRM (Fondation pour la recherche médicale) concessione attrezzature, il Laboratorio IBEID di eccellenza consorzio, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) concessione &quot; Bugs-in-flow &quot;. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

1. Rischi e autorizzazioni <ol><li> Comitati etici locali devono approvare tutti i protocolli di animali. Questo protocollo è stato condotto in conformità con le linee guida stabilite dalle normative francesi ed europee per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (Decreti 87-848, 2001-464, 2001-486 e 2001-131 e Direttiva Europea 2010/63/UE) e approvato dal comitato etico locale Comité d&#39;Ethique en matière d&#39;Expérimentation Animale, Université Paris Descartes, Parigi, Francia. No: CEEA34.GD.002.11. </li><li> Per la pelle umana, scritta il consenso del paziente informato è stato ottenuto e sono state eseguite tutte le procedure secondo le linee guida nazionali francesi e approvato dal comitato etico locale, Comité d&#39;Evaluation Ethique de l&#39;INSERM IRB 00003888 00005881 FWA, Parigi, Francia Opinione: 11-048 . </li><li> N. meningitidis è un agente patogeno umano potenzialmente dannosi e tutte le necessarie precauzioni devono essere prese quando si maneggia l&#39;orgasmo. Queste precauzioni includono vaccinazione e di lavoro sotto il livello di biosicurezza 2 condizioni. </li></ol> 2. Skin Graft <ol><li> Raccogliere pelle umana più vicino al tempo di innesto possibile. La maggior parte di pelle in questo lavoro ad operazioni di chirurgia plastica che interessano la zona addominale. Altre fonti come il seno, gambe e anche il viso sono stati usati con successo. </li><li> Preparare il campione di pelle umana pulendo la superficie della pelle con il 70% EtOH, che giace in piano su una superficie di ben puliti, preferibilmente sotto una cappa a flusso. </li><li> Tagliare 200-400 micron fette dalla parte superiore della pelle utilizzando un dermatome con spessore prestabilito. </li><li> Controllare le fette di pelle per l&#39;integrità e tagliatele in 2 cm x 2 centimetri quadrati, quindi collocare in PBS (senza cationi bivalenti) se l&#39;innesto immediatamente oppure a 4 ° C in DMEM con siero del 10% per la conservazione a breve termine (3-12 h ). </li><li> Anestetizzare 6-8 settimane di età topi SCID.bg (circa 20 g) con ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) injeCTED ip </li><li> Una volta che i topi vengono anestetizzati, verificare la risposta al dolore eseguendo un pizzico punta, un metodo standard per stabilire il dolore riflesso. Applicare il gel per gli occhi contro l&#39;essiccamento della cornea e radere lato sinistro dell&#39;animale dietro la spalla, dove verrà posizionato l&#39;innesto. Tenere il caldo mouse su un tappetino di calore durante tutta la procedura. </li><li> Dopo preparando il mouse per la chirurgia, pulire la zona rasata con il 70% EtOH. </li><li> Applicare anestetico locale topicamente al sito dell&#39;innesto (Tronothane) e preparare il sito dell&#39;innesto rimuovendo accuratamente lo strato superficiale della pelle di topo con un paio di forbici curve. Fare attenzione a non disturbare il sistema vascolare sottostante. </li><li> Rimuovere la pelle in una zona un po &#39;più piccola dell&#39;area della fetta pelle umana. </li><li> Rimuovere fetta pelle dalla PBS (o DMEM) e posizionare sul banco innesto, assicurando il lato epidermico è rivolto verso l&#39;alto. Passi 2,8-2,10 deve essere eseguita il più rapidamente possibile, assicurando il letto innesto non si asciughi. </li><li> Allineare un angoloo il bordo e fissare con la colla del tessuto. Montare accuratamente il resto della fetta pelle al letto innesto, ponendo piccole quantità di colla tessuto intorno ai bordi. Tagliare sempre la pelle umana per dimensioni, piuttosto che fare il letto più grande innesto. </li><li> Non tirare la pelle troppo stretto sopra il letto innesto come la pelle del mouse è molto flessibile. </li><li> Assicurarsi che l&#39;innesto è fissato con colla tessuto in ogni angolo. </li><li> Pulire l&#39;area con una soluzione di iodio. </li><li> Applicare un cerotto con l&#39;area cuscino sopra l&#39;innesto. Assicurarsi che il Band-Aid è ferma, ma non stretto e che la respirazione dell&#39;animale non è interessato. </li><li> Fissare il Band-Aid con nastro spogliatoio. </li><li> Lasciare che l&#39;animale di recuperare su una superficie calda. </li><li> Una volta sveglio, rispedire l&#39;animale verso la sua gabbia. Gli animali sono alloggiati 2-3 per gabbia. </li><li> Controllare i topi regolarmente durante il recupero per i segni di dolore o disagio. 10-14 giorni dopo il trapianto, rimuovere il cerotto, facendo attenzione a non disturbare l&#39;innesto. Nella nostra esperienza il dolore postoperatorio è minimal. Tuttavia gli animali devono essere monitorati ogni giorno, in particolare nei giorni seguenti operazioni. Criteri per il dolore o disagio sono i seguenti. <ul><li> Perdita di peso oltre il 10% </li><li> Aspetto fisico, la pelliccia, la posizione gobbo, occhi </li><li> L&#39;aumento dei tassi di respirazione o di cuore </li><li> Diminuzione dei movimenti o inusuali. </li><li> Aumento della temperatura corporea </li><li> Paracetamole In caso vengono rilevati segni di dolore viene somministrato per via orale (300 mg / kg, ogni 4 ore). Punti finali umanitari sono rigorosamente rispettati se il dolore persiste. </li></ul></li><li> Se l&#39;innesto sembra asciutto applicare l&#39;olio di bambino ogni 2-3 giorni per mantenere la pelle elastica. </li><li> L&#39;innesto è pronto per la sperimentazione 21 giorni dopo trapianto. </li></ol> 3. Infezione <ol><li> Il giorno prima dell&#39;infezione, preparare ceppo batterico strisciando su piastre di agar GCB con antibiotici appropriati. Crescere notte a 37 ° C in 5% di CO 2. </li><li> Preparazione Batteri <ol&gt; <li> Batteri Reinoculate in 5 ml di SFM supporti endotelio umano con il 10% di siero di un OD 600 0.05. </li><li> Incubare sotto agitazione per 2 ore in incubatore (37 ° C in 5% CO 2) con coperchio allentato, finché una densità batterica di circa 0,1 OD 600. </li><li> Centrifugare i batteri per 3 min 15.000 rpm. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere in PBS, centrifugare di nuovo. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio (2.2.4-2.2.5) due volte. </li><li> Risospendere pellet batterico in PBS. </li><li> Misurare OD 600. </li><li> Effettuare una cultura di una OD 600 0,1 (10 8 UFC / ml), o OD 600 1,0 (10 9 CFU / ml). Da questa concentrazione nota, diluire a 10 7 UFC / ml. Provate a preparare i batteri più vicino al tempo di iniezione possibile. </li></ol></li><li> Mice <ol><li> Pesare topi. </li><li> Anestetizzare topi con ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) iniettato ip </li><li> Una volta addormentato, cdiamine che la risposta al dolore è assente da un dito del piede-pinch, tenere i topi caldo con un pad termico e mettere unguento occhio su per evitare l&#39;essiccazione. </li><li> Dare ogni mouse 8 mg di transferrina umana, risospese in soluzione fisiologica o PBS, iniettato ip </li><li> Prendete una piccola goccia di sangue dalla coda e diffondere su una piastra di agar per controllare il sangue è sterile prima dell&#39;infezione. </li><li> Iniettare 100 ml 10 7 UFC / ml coltura batterica (10 6 CFU totali) per via endovenosa attraverso la vena retro-orbitale o la coda. Le misurazioni di CFU prese 5 minuti dopo l&#39;iniezione sono coerenti indipendentemente dalla sede di iniezione. </li><li> Dopo pochi minuti, tagliare la coda e diffondere campione di sangue su piastre di agar con antibiotici appropriati con una diluizione di 10 volte per stabilire CFU sangue subito dopo l&#39;infezione. </li><li> Sigillare la coda con la colla del tessuto. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, diluire l&#39;inoculo batterico e la diffusione su piastre di agar con antibiotici appropriati per stabilire CFU. </li><li> Lasciare il mouseper recuperare su un tappetino di calore fino a quando sono e in movimento </li><li> Al 6 ore dopo l&#39;infezione disegnare una piccola quantità di sangue dalla coda, diluire e la piastra di stabilire CFU alle 6 ore. </li><li> Incubare tutte le piastre di agar a 37 ° C in 5% di CO 2 durante la notte. </li></ol></li></ol> 4. Sacrificio <ol><li> Al tempo scelto di infezione, anestetizzare topi con ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) iniettato ip </li><li> Una volta addormentato, mantenere caldo il mouse con un pad termico. </li><li> Quando il riflesso del dolore è andato (toe-pinch), snip fine della coda e disegnare il sangue. </li><li> Stendere sangue su piastre di agar con antibiotici appropriati; 1:10 5 microlitri diretta e 10 microlitri per stabilire CFU. </li><li> Sacrifica il mouse per dislocazione cervicale. </li><li> Dopo aver sacrificato il mouse secondo tutte le linee guida istituzionali e principi etici applicabili, confermare la morte per mancanza di battito cardiaco. Effettuare una incisione mediana, tagliare gabbia toracica, e fare un&#39;incisione nel sentiret. </li><li> Raccogliere quanto più sangue possibile dal cuore / cavità toracica e posto in una provetta sterile. </li><li> Rimuovere organi (ad esempio il fegato, la milza, cervello) in una piastra sterile. </li><li> Rimuovere l&#39;innesto di pelle e una sezione di pelle di topo nella piastra sterile. </li><li> Smaltire il corpo del mouse. </li><li> Dopo che il sangue raccolto è stato permesso di coagulare per 15 minuti, centrifugare è 15 min a 3.000 giri. </li><li> Rimuovere il plasma dal sangue e conservare a -80 ° C per analisi successive, ad esempio per il rilevamento di citochine con metodi ELISA o FACS base. </li></ol> 5. Conti Organ CFU <ol><li> Pesare omogeneizzazione provette contenenti 500 ml di PBS prima di ogni prelievo di campioni bioptici. </li><li> Prendere 4 millimetri campioni bioptici di ogni tessuto utilizzando un biopsia sterile. </li><li> Luogo biopsie in provette omogeneizzazione pre-pesate contenenti 500 microlitri di PBS. Omogeneizzare campioni di pelle con 2 mm perle, perline di utilizzare più piccole per altri organi. </li><li> Posizionare il restante tproblemi in 4% paraformaldeide (PFA) e conservare a 4 ° C per microscopia (vedi sotto). </li><li> Pesare omogeneizzazione provette contenenti le biopsie per stabilire il peso biopsia (per rivederlo calcolo dei CFU / tessuto mg). </li><li> Omogeneizzare campioni. <ol><li> Omogeneizzare fegato, milza e cervello, a 6.000 rpm per 30 sec. </li><li> Omogeneizzare campioni di pelle a 6.000 rpm per 30 secondi e ripetere se necessario. </li></ol></li><li> Stendere diluizioni da ciascuna provetta omogeneizzazione su piastre di agar e far crescere la notte a 37 ° C in 5% di CO 2 per stabilire organo conta CFU. </li></ol> 6. Istologia / Immunoistochimica <ol><li> Fissazione <ol><li> Fissare i tessuti in 4% PFA notte a 4 ° C. Il passo di fissaggio può essere più lungo, se l&#39;archiviazione per periodi più lunghi collocare i tessuti a 0,25% PFA. </li><li> Risciacquare i tessuti in PBS e poi posto in una soluzione di saccarosio al 20% e ritorno a 4 ° C durante la notte o fino a quando i tessuti sono affondate nella soluzione. </li><li> Lavare i tessuti in PBS, tagliati a misura e posto in soluzione Ottobre (sia in uno stampo tessuto o aderito a una scheda di base). </li><li> Congelare rapidamente i tessuti su un piatto Petri galleggianti in azoto liquido. </li><li> Dopo il congelamento, mettere i tessuti su ghiaccio secco prima del trasferimento a -80 ° C per una conservazione. </li></ol></li><li> Affettare <ol><li> Rimuovere tessuti da -80 ° C e lasciare equilibrare a -20 ° C in un criostato. </li><li> Tessuti fetta con uno spessore di circa 10-15 micron e mettono su vetrini al microscopio rivestiti. </li><li> Conservare scivola a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Colorazione <ol><li> Lasciare i vetrini a temperatura ambiente. </li><li> Disegnare intorno la fetta sul vetrino con una penna idrofobo. Attendere 5-10 min. </li><li> Reidratare / fetta di lavaggio in PBS per 5 minuti, ripetere due volte. </li><li> Permeabilize fetta in 0,1% Triton in PBS per 10 min. </li><li> Lavare in PBS 2-3x per 5 min. </li><li> Blocco in PBS0.1% Triton 1% BSA per tra 10-60 min a seconda dell&#39;anticorpo o macchia da utilizzare. </li><li> Rimuovere il tampone bloccante ed aggiungere anticorpo primario diluito come richiesto buffer di blocco. Incubare per tempo determinato. (Spesso 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C). </li><li> Lavare in PBS 2-3x per 5 min. </li><li> Applicare anticorpo secondario diluito in modo appropriato nel buffer di bock; DAPI è tipicamente incluso in questa fase. Incubare per il tempo determinato, spesso 1-2 ore a temperatura ambiente, al buio. </li><li> Lavare in PBS 2-3x per 5 min. </li><li> Montare in dissolvenza tutela mezzi di montaggio con un vetro di copertura e sigillare con smalto. </li><li> Immagine vetrini colorati immediatamente o conservare a 4 ° C. </li><li> Eseguire l&#39;imaging con un microscopio confocale a fluorescenza o impostato con filtri / laser appropriate per fluorofori utilizzati. </li></ol></li><li> Istologia <ol><li> Consentire diapositive da utilizzare per istologia raggiunga la temperatura ambiente. </li><li> Diapositive Stain utilizzando comeprotocollo di colorazione tandard ematossilina / eosina. <ol><li> Porre i vetrini in cremagliera diapositiva. </li><li> Trasferire rack con scivoli tra le soluzioni nel seguente ordine: </li><li> 2 sec in acqua corrente. </li><li> 3 min in soluzione ematossilina filtrata. </li><li> 10 sec in acqua corrente. </li><li> 10 sec in acqua distillata. </li><li> 10 sec in etanolo al 100%. </li><li> 2 sec in eosina filtrato. </li><li> 10 sec in acqua corrente. </li><li> 10 sec in etanolo al 100% </li><li> 2 min in xilene x 3 (bagno I, II, III). </li><li> Trasferire immediatamente e aggiungere qualche goccia di colla fissazione su ogni slide, luogo copertura antiscivolo sulla parte superiore, rimuovere le bolle d&#39;aria, lasciare asciugare per qualche ora. </li><li> Immagine scivola sotto un microscopio a luce bianca standard. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

I modelli animali sono di fondamentale importanza per la ricerca patogenesi batterica. È impossibile simulare appieno l&#39;ambiente in vivo in coltura cellulare e sta diventando evidente che l&#39;interazione ospite-patogeno è influenzata da molti fattori dinamici. La specificità umana di patogeni clinicamente importanti, come N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes e Salmonella typhi ha limitato l&#39;uso di modelli in vivo per queste infezioni. Tuttavia, come si comincia a capire quali passi infettive sono coinvolti nella specificità, si stanno sviluppando modelli umanizzati. Il protocollo qui descritto è una dimostrazione di questo con l&#39;introduzione di microvasi umani in topi, consentendo ampio in vivo infezione con N. meningitidis, con conseguente danno vascolare e, occasionalmente, lo sviluppo di eruzioni cutanee purpuriche. Utilizzando questo modello,siamo stati in grado di definire che le proprietà adesive della PTF sono coinvolti nella colonizzazione vascolare in vivo utilizzando mutanti batterici e che il danno vascolare è ridotto in assenza di adesione 18. In precedenza, circolanti prodotti batterici sono stati implicati in questo danno ma i nostri risultati suggeriscono un ruolo decisivo per l&#39;adesione locale e colonizzazione vascolare. Questo apre nuove possibilità per lo sviluppo di obiettivi di trattamento romanzo. Se l&#39;adesione dei batteri patogeni potrebbe essere bloccato farmacologicamente si potrebbe prevenire lo sviluppo di lesioni cutanee e portare a risultati migliori per i sopravvissuti meningococco in termini di necrosi dei tessuti, sbrigliamento e amputazioni. Il lavoro ha anche dimostrato la complessità dell&#39;infezione e il coinvolgimento della risposta immunitaria e cascata coagulativa. Abbiamo identificato segnalazione citochina umana nel siero di topi infettati nonostante la relativamente piccola quantità di endotelio umana contemporanea 18.Ciò ha indicato una significativa risposta citochina, insieme con l&#39;infiltrazione di topo popolazioni di cellule immunitarie nella zona. I modelli animali possono ovviamente mai replicare completamente la malattia umana e di tutti i risultati ottenuto da loro deve essere considerato con questo in mente. Per esempio, in questo modello il sangue e cellule circolanti sono di origine murina e non possiamo sconto che può essere diverso per le cellule umane. Un vantaggio di questo però, come dimostrato nella nostra recente pubblicazione 18, è la capacità di differenziare segnalazione proveniente dalla endotelio umano da quello delle cellule di topo circolanti. Lo sfondo immunocompromessi dei topi utilizzati in questo modello potrebbe anche consentire il trasferimento genico di popolazioni di cellule immunitarie umane, aggiungendo un ulteriore &#39;umanizzazione&#39; aspetto. Lo sfondo dei topi immunocompromessi può tuttavia mascherare un ruolo per le cellule NK, T o B, che sono tutti carenti o difettose in questo modello. La relativamente Short lasso di tempo (24 ore) utilizzato in questo modello riguarda principalmente la risposta innata, ma per le infezioni a lungo termine e lo sviluppo di immunità altre opzioni può avere bisogno di essere esplorato. La pelle è un sito di infezione importante per N. meningitidis ma aventi una quantità relativamente piccola di navi umane significa anche che estrapolando i dati ad una infezione sistemica coinvolge numerosi organi è difficile. Mentre questo modello consente lo studio di sviluppo lesione cutanea, importanti fasi di infezione meningococcica come epiteliale e ematoencefalica attraversamento non sono inclusi. L&#39;ulteriore sviluppo di questi modelli umanizzati è necessaria per affrontare questi altri aspetti di infezione. Tuttavia questo modello offre un grande potenziale per numerosi patogeni specifici umani, in particolare quelli rivolti ai vasi sanguigni.

Sepsi meningococcica è un sangue nasce spesso fatale infezione causata dal batterio patogeno Neisseria meningitidis. Pazienti con sepsi meningococcica, spesso presente con un rash petecchiale o color porpora sulla loro pelle che è stato precedentemente associato a distruzione vascolare causata da batteri circolanti e prodotti batterici 1. Biopsie cutanee di pazienti clinici mostrano batteri associati con microvasi, spesso riempiendo i vasi 2. Oltre alla perdita di batteri, ampio trombosi, coagulazione, congestione e vascolare è visto nelle regioni purpuriche 3-5. Questo danno vascolare può portare alla necrosi estesa della cute e dei tessuti circostanti, con conseguente sbrigliamento e addirittura l&#39;amputazione nei sopravvissuti meningococco. Capire come infezione provoca questo danno vascolare è importante per ottimizzare le strategie di prevenzione e trattamento. La maggior parte delle ricerche sulla sepsi meningococcica è stato effettuato in vitro sulinee cellulari umane dovute alla specificità umana di N. meningitidis. Molti aspetti di infezione sono stati studiati in vitro, tra cui l&#39;adesione batterica, la risposta della cellula ospite, così come la risposta delle citochine 6-9. Pili di tipo IV (PTF) è stato implicato come il principale organello adesione per N. meningitidis su entrambe le cellule epiteliali ed endoteliali 10. Inoltre è stato dimostrato che l&#39;adesione di N. meningitidis per ospitare cellule è shear stress dipende ed è quindi pensato per essere collegato ai tassi di flusso sanguigno nel microcircolo 11. Questo suggerisce che le sollecitazioni dinamiche i batteri devono affrontare in vivo sono fondamentali per patogenesi. È tuttavia molto difficile modellare il microambiente di piccoli vasi in vitro. Il recettore di adesione per Neisseria Tfp è ancora sconosciuto e quindi strategie knock-in per conseguire adesione batterica in un modello animale non può essere concepita in questo momento. CD46 è stato suggerito di essere il recettore TFP e animali transgenici sono state prodotte per fungere da modelli murini. Tuttavia, l&#39;infezione in questi animali non porta ad infezione estesa o di rash cutanei sviluppo 12,13. Altri modelli animali che sono stati descritti per l&#39;aspetto batteriemia dell&#39;infezione Neisseria tengono conto della preferenza batterica di transferrina umana come fonte di ferro 14,15. Sia che completa transferrina umana o esprimendolo da un transgene traduce in una maggiore carica batterica nel flusso sanguigno per un periodo di tempo prolungato, ma questo modello non presenta alcun adesione batterica o sviluppo eruzione 16,17. In questo protocollo, si descrive un modello di topo umanizzato in cui la pelle umana, compreso il microcircolo cutaneo, viene trapiantato su topi immunocompromessi 18,19. Ciò si traduce in vasi umani funzionali, perfusi con la circolazione del mouse. In combinazione con la supplementazione transferrina umana, questo modello rappresenta almeno due degli aspetti specifici umani di N. meningitidis, cioè l&#39;endotelio umano e transferrina umana, in un ambiente in vivo. N. meningitidis introdotto per via endovenosa in questo modello aderisca espressamente allo endotelio umano, producendo una patologia che è simile a quanto riportato in pazienti clinici, compresi i danni vascolari e sviluppo eruzione purpurica 18.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 500</td><td>Virbac France</td><td></td><td>lotto n. VAL4243</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Bayer Healthcare</td><td>AMM N&deg; FR/8146715 2/1980</td><td>lotto n. KPO809S</td></tr><tr><td>Optigel &nbsp; &nbsp;</td><td>Europhta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lacrigel&nbsp;</td><td>Medicament Autoris&eacute;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tronothane</td><td>Lisa Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC agar base</td><td>Conda</td><td>1106</td><td></td></tr><tr><td>Endotelio umano SFM media</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>11111</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>P A A</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Trasferrina umana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>UEA lectina - rodamina</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1062</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Dermatomero a mano sobria</td><td>Humeca BV, Olanda</td><td>4.SB01</td><td></td></tr><tr><td>Alloggiamento per animali</td><td>Innovive</td><td>M-BTM-C8</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia (4 mm)</td><td>Dominic Dutscher</td><td>30737</td><td></td></tr><tr><td>Matrice di lisi a preparazione rapida M tubi</td><td>MP Bio</td><td>116923050</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer Green Beads</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer</td><td>Roche</td><td>3358976001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD supporti di montaggio</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Colla tissutale</td></tr> <tr><td></td><td>OCTSakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche targeting il microcircolo

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causa una grave sepsi spesso fatale quando si entra nel flusso sanguigno umano. Infezione porta ad ingenti danni dei vasi sanguigni con conseguente perdita vascolare, lo sviluppo di eruzioni purpuriche ed eventuale necrosi tissutale. Studiare la patogenesi di questa infezione è stato precedentemente limitata dalla specificità umana dei batteri, il che rende difficile modelli in vivo. In questo protocollo, si descrive un modello umanizzato di questa infezione in cui la pelle umana, contenente microvasi cutanei, si innesta su topi immunocompromessi. Questi vasi anastomizzano con la circolazione del mouse pur mantenendo le loro caratteristiche umane. Una volta introdotto in questo modello, N. meningitidis aderiscono esclusivamente alle navi umane, causando gravi danni vascolari, infiammazione e in alcuni casi, lo sviluppo di rash color porpora. Questo protocollo descrive i passi innesto, infezione e valutazione di questo modello nel context di N. infezione meningitidis. La tecnica può essere applicata a numerosi agenti patogeni specifici umane che infettano il flusso sanguigno.

Conta CFU Il N. ceppo meningitidis utilizzati in questi risultati rappresentativi è N. meningitidis 8013 clone 12, un sierogruppo C isolato clinico, esprimendo una classe I SB pilin, Opa -, Opc -, PilC1 + / PilC2 + 20. Il ceppo era stato ingegnerizzato per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP) da un inserimento cromosomica 18. Batteriche unità formanti colonie conteggi sono stabiliti contando il numero di colonie su piastre di agar e calcolando sia CFU / ml di sangue o CFU / mg di tessuto dai volumi noti placcato. Emocromo mostrato che 5 minuti dopo l&#39;iniezione iv di 10 6 CFU batteri c&#39;è stata una media di 1,5 x 10 5 CFU / ml circolante nel sangue (Figura 1A). Dopo 6 ore la conta in media 4,8 x 10 4 CFU / ml. Entro 24 ore i conteggi medi erano 2,4 x 10 4 UFC / ml, ma in questo gruppo di 10 topi, 5 avevanon rilevabile batteri circolanti, mentre gli altri 5 avevano conteggi relativamente elevati (Figura 1A). Una conta prelevati dai campioni di pelle mostrano la maggior parte dei topi con gravi conteggi nella pelle umana, in media, 2,1 x 10 4 UFC / mg di tessuto a 6 ore e 4,4 x 10 2 UFC / mg di tessuto a 24 ore (Figura 1B) . I campioni controlaterale del mouse cutanee non ha mostrato la conta batterica a 24 ore e solo un numero molto basso a 6 ore, a dimostrazione della forte preferenza per N. meningitidis alle navi umane della pelle innestata (Figura 1B). In generale conte batteriche erano molto basso per non rilevabile negli altri organi del campione, anche se due animali hanno mostrato conteggi che possono essere attribuiti alla contaminazione dal sangue, in quanto correlati con alta circolanti numeri batteriche (Figura 1C). Il modello può anche essere utilizzato per determinare il ruolo dei fattori di virulenza in vivo, ad esempio del tipo IV pili. Ceppi batterici con mutazioni definite nel gene PILD 21, causando un ceppo privo Tfp, così come il gene pilC1 8, privo della proposta Tfp &#39;adesina&#39; sono stati introdotti nel modello. Queste mutazioni hanno provocato nessuna adesione batterica nel trapianto di pelle umana, confermando il ruolo cruciale Tfp sta giocando in adesione in vivo (Figura 1D). Immunoistochimica / Istologia In questi esperimenti abbiamo usato N. ceppi meningitidis che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) per consentire il rilevamento della fluorescenza senza la necessità di colorazione secondaria. Navi umane sono state colorate con un pennarello per endotelio umano, sia CD31 (PECAM-1) o la lectina Ulex europaeus agglutinina (UEA) 18,22. La UEA stato coniugato a rodamina permettendo-fase di colorazione (figure 2A-C). Nuclei delle cellule possono essere coloranoed con DAPI per aiutare a identificare le strutture del tessuto (Figure 2A-B). Istologia è stata effettuata utilizzando una colorazione ematossilina / eosina standard. Il confine epidermico / dermico della pelle era chiaramente identificabile. L&#39;infiammazione, trombosi vascolare e perdite sono concentrate alle navi vicino a questo confine 24 ore dopo l&#39;infezione (Figura 2D). Trombosi era visibile in diversi vasi dermici piccoli, spesso accompagnati da congestione e infiammazione. Fuoriuscita di globuli rossi fuori nei tessuti potrebbe essere visto, indicando un ampio livello di danni ai vasi. L&#39;istopatologia di pelle innestato nei topi non infetto appariva normale senza infiammazione distinguibili 18. In circa il 30% delle infezioni adesione batterica nella pelle porta allo sviluppo di porpora macroscopicamente rilevabili (figure 2E e 2F). <img alt="Figura 1" fo:content-width=<html> &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Una conta. (A) batterica CFU conteggi per ml di sangue a 5 min, 6 ore e 24 ore dopo l&#39;infezione. (B) batterica CFU conta da campioni di pelle di confronto pelle umana (HS) e la pelle mouse (MS) sia a 6 ore e 24 ore dopo l&#39;infezione. (C) batterica CFU conta da altri organi prelevati 24 ore dopo l&#39;infezione. (D) Confronto batterici una conta da campioni di pelle umana e di topo prese a infezione 24 ore post da topi infettati con il tipo selvatico N. macchia meningitidis 2C43 (WT), un ceppo con una mutazione nel gene PILD (PILD) o un ceppo con una mutazione nel gene pilC1 (pilC1). Tutti i grafici vengono visualizzati come dati grezzi con mediana. La figura viene modificato da Melican et al 18.&quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> Figura 2. Microscopia. (A) Proiezione di una pila confocale mostra un microvasi umana macchiata con UEA lectina (rosso), vicino al cutanea (d) epidermica (e) di confine. Il vaso è stato infettato con N. meningitidis (verde) 2 ore dopo l&#39;infezione. (B) Una fetta di ottica e una proiezione fetta (C) mostrando N. microcolonie meningitidis (verde) l&#39;infezione di una nave umana (UEA - rosso) all&#39;interno di una infezione della pelle innesto di due ore dopo. (D) Ematossilina / Eosina colorazione di innesto di pelle umana infettate per 24 ore con N. meningitidis. Il epidermica (e), dermica (d) confine è chiaramente trombosi e la congestione di microvess visibile ed estesaEls (frecce) è visto nel derma. Infiammazione e qualche perdita vascolare (freccia) possono essere identificati. (E) trapianto di pelle umana prima dell&#39;infezione. (F) Lo stesso innesto di pelle come ore dopo l&#39;infezione (E) 24 con N. meningitidis mostrando regioni purpuriche (frecce). Figure 2B, 2D, 2E, 2F e vengono modificati da Melican et al. 18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

Neisseria meningitidis è un agente patogeno specifico umano che infetta i vasi sanguigni. In questo protocollo microvasi umani vengono introdotti in un topo da innesto di pelle umana su topi immunocompromessi. I batteri aderiscono ampiamente ai vasi umani, con conseguente danno vascolare e lo sviluppo del rash purpurica tipicamente osservato in casi umani.

Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i meccanismi attraverso cui il batterio che causa la meningite infetta i vasi sanguigni umani in vivo. Questo viene ottenuto innanzitutto innestando la pelle umana su un topo immunodeficiente, introducendo così vasi sanguigni dermici umani. Nel secondo passaggio, i topi umanizzati vengono infettati con il batterio.L'infezione viene quindi lasciata procedere per un periodo di tempo predeterminato. Nell'ultima fase, vengono prelevati campioni di sangue e di tessuto per valutare l'esito dell'infezione. In definitiva, una combinazione di istologia, immunofluorescenza e analisi del sangue e dei tessuti viene utilizzata per studiare l'andamento dell'infezione nei vasi umani.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come i modelli di coltura cellulare o i modelli animali, è che per la prima volta possiamo osservare la tipica patologia clinica che si verifica durante queste infezioni. Non appena possibile dopo il prelievo, pulire la superficie della pelle umana con etanolo al 70% e quindi appoggiarla piatta su una superficie ben pulita, preferibilmente sotto una cappa a flusso laminare. Successivamente, utilizzare un dermatomo con uno spessore preimpostato per tagliare fette di 200-400 micrometri dalla superficie della pelle.Verificare l'integrità delle fette, quindi tagliarle ulteriormente in quadrati di due per due centimetri. Posizionare i quadrati in PBS e successivamente pulire l'area rasata di un topo beige immunodeficiente severo combinato, anestetizzato e preparato chirurgicamente, di età compresa tra sei e otto settimane, con etanolo al 70%. Dopo aver applicato l'anestetico locale sul sito del trapianto, utilizzare forbici curve per rimuovere con attenzione lo strato superficiale della pelle del topo in un'area leggermente più piccola rispetto ai frammenti di trapianto, avendo cura di non disturbare la vascolarizzazione sottostante.Procedendo rapidamente per evitare che l'innesto si secchi, posizionare una delle fette di pelle umana sul letto dell'innesto, assicurandosi che il lato epidermico sia rivolto verso l'alto. Allineare il margine del tessuto e fissarlo con colla per tessuti. Quindi adattare con cura il resto della pelle umana al letto dell'innesto, applicando piccole quantità di colla per tessuti lungo ciascun bordo.Tagliare sempre la pelle umana alle dimensioni adatte piuttosto che allargare il letto del trapianto. Dopo aver verificato che ogni angolo sia fissato, pulire l'area con una soluzione di iodio e applicare un cerotto in modo saldo ma non troppo stretto, con la parte imbottita sopra il trapianto, avendo cura che la respirazione dell'animale non venga compromessa; quindi fissare il cerotto con del nastro adesivo e lasciare che l'animale si riprenda su una superficie calda. Una volta sveglio, restituire l'animale alla sua gabbia fino all'iniezione batterica per re-inoculare una coltura da piastra notturna in coltura liquida.La mattina dell'infezione, quando i batteri raggiungono la concentrazione desiderata, diluire le cellule a un valore di 1 × 10⁷ unità formanti colonie per millilitro. Successivamente, dopo l'anestesia, verificare la sedazione dei topi trapiantati mediante pinzatura del dito del piede e posizionare gli animali su un tappetino riscaldante.Mettere un unguento oculare sugli occhi dell'animale, quindi iniettare per via ip ogni mouse con otto milligrammi di transferina umana in soluzione salina. Successivamente, per ogni animale, tagliare la punta della coda e spalmare una piccola goccia di sangue proveniente dalla coda su una piastra di agar per confermare che il sangue sia sterile prima dell'infezione.Quindi iniettare 100 microlitri della coltura batterica per via endovenosa mediante iniezione retro-orbitale. Dopo alcuni minuti, tagliare nuovamente l'estremit&agrave; della coda e stendere questo campione di sangue su piastre di agar fresche. Per determinare immediatamente dopo l'infezione le unit&agrave; formanti colonie nel sangue, sigillare la coda con colla tissutale e quindi diluire l'inoculo batterico e stenderlo su piastre di agar contenenti gli antibiotici appropriati.Per determinare le unità formanti colonie dell'inoculo a sei ore dall'infezione, prelevare una piccola quantità aggiuntiva di sangue dalle code di ciascun topo, quindi diluire e seminare le gocce di sangue come appena illustrato per determinare le unità formanti colonie a sei ore. Incubare quindi tutte le piastre a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5% per tutta la notte per eseguire la conta delle unità formanti colonie negli organi degli animali infetti.Iniziare praticando un'incisione mediana in ciascun topo sottoposto a eutanasia. Successivamente, per ogni animale, tagliare attraverso le costole ed effettuare un'incisione nel cuore. Utilizzare una siringa sterile per prelevare la maggior quantità possibile di sangue dal cuore e dalla cavità toracica, e trasferirlo in tubi sterili individuali per ciascun campione.Successivamente, rimuovere gli organi di interesse e quindi trasferire i trapianti di pelle e le sezioni corrispondenti di pelle di topo su una piastra sterile per animale. Lasciare coagulare il sangue raccolto per 15 minuti, quindi centrifugarlo. Rimuovere quindi il plasma dal sangue e conservarlo a meno 80 gradi Celsius per analisi successive.Successivamente, pesare le provette di omogeneizzazione contenenti ciascuna 500 microlitri di PBS. Quindi utilizzare una punta da biopsia sterile per prelevare campioni bioptici di quattro millimetri da ciascun tessuto dissezionato. Posizionare le biopsie singolarmente nelle provette di omogeneizzazione, aggiungendo una perla di due millimetri in ogni provetta contenente un campione di pelle.Conservare i tessuti rimanenti in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per la microscopia, e pesare le provette da omogeneizzazione per determinare il peso della biopsia. Successivamente, omogeneizzare i campioni a 6.000 giri al minuto per 30 secondi, ripetendo l'omogeneizzazione della pelle fino a quando l'omogeneato non diventa solido. Infine, distribuire le sospensioni cellulari da ogni provetta su piastre di agar fresche e coltivare le colture durante la notte a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5%.Per determinare il numero di unità formanti colonie negli organi in questi risultati rappresentativi, è stato utilizzato un ceppo positivo per GFP di N. meningitidis, sierogruppo C.I conteggi ematici hanno mostrato che cinque minuti dopo l'iniezione endovenosa di un milione di unità formanti colonie di batteri, era presente in circolo una media di 1,5 × 10⁵ unità formanti colonie per millilitro di sangue. Dopo sei ore, i conteggi medi erano di 4,8 × 10⁴ unità formanti colonie per millilitro; entro 24 ore, i conteggi medi erano di 2,4 × 10⁴ unità formanti colonie per millilitro.Tuttavia, in questo gruppo di 10 topi, cinque non presentavano batteri circolanti rilevabili, mentre gli altri cinque avevano conteggi relativamente elevati. Queste barre nei grafici mostrano i valori mediani dei conteggi di UFC per ciascun gruppo, ottenuti dalla pelle. I campioni mostrano che la maggioranza dei topi presenta conteggi considerevoli nella pelle umana, con una media di 2,1 volte 10 alla quarta UFC per milligrammo di tessuto a sei ore e di 4,4 volte 10 alla seconda UFC per milligrammo di tessuto a 24 ore.I campioni di pelle del topo controlaterali non hanno mostrato conteggi batterici a 24 ore e solo un numero molto basso a sei ore, dimostrando una marcata preferenza per la meningite endogena nei vasi umani del tessuto innestato. In generale, i conteggi batterici erano molto bassi o non rilevabili negli altri organi campionati, anche se due animali hanno mostrato conteggi, che potrebbero essere correlati a elevati numeri circolanti di batteri. Questo modello può inoltre essere utilizzato per determinare il ruolo dei fattori di virulenza in vivo.Ad esempio, in questo esperimento, sono stati utilizzati ceppi batterici privi di pilo di tipo quattro funzionale; i topi infettati con questi ceppi mutanti non hanno mostrato adesione batterica nei trapianti di pelle umana, confermando il ruolo cruciale svolto dal pilo di tipo quattro nell'adesione in vivo. In queste immagini al microscopio confocale di un trapianto cutaneo, ottenute due ore dopo l'infezione, è possibile osservare i vasi umani marcati con lectina UEA coniugata a romina. Il confine dermo-epidermico della pelle è chiaramente identificabile e i batteri infettanti positivi per GFP e la meningite possono essere chiaramente osservati lungo i vasi.Questo innesto di pelle umana colorato con ematossilina ed eosina dimostra infiammazione e fuoriuscite vascolari, nonché trombosi concentrate nei vasi prossimi al confine dermo-epidermico. Ventiquattro ore dopo l'infezione, in circa il 30% dei casi, le adesioni batteriche nella pelle hanno portato allo sviluppo di porpora rilevabile macroscopicamente. Pertanto, lo sviluppo di questa tecnica apre la strada ai ricercatori impegnati nello studio delle interazioni tra ospite e patogeno per analizzare i meccanismi della malattia nel contesto dei vasi umani.

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In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

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