Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i meccanismi attraverso i quali i batteri della meningite infettano i vasi sanguigni umani in vivo. Ciò si ottiene innestando prima la pelle umana su un topo immunodeficiente, introducendo così vasi sanguigni dermici umani. Nella seconda fase, i topi umanizzati vengono infettati dai batteri.

L'infezione viene quindi lasciata procedere per un periodo di tempo predeterminato. Nella fase finale, vengono prelevati campioni di sangue e tessuto per valutare l'esito dell'infezione. In definitiva, una combinazione di istologia, immunofluorescenza e analisi del sangue e dei tessuti viene utilizzata per studiare la progressione dell'infezione nei vasi umani.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come i modelli di coltura cellulare o i modelli animali, è che per la prima volta possiamo osservare la tipica patologia clinica che si verifica durante queste infezioni. Il prima possibile dopo la raccolta, pulire la superficie della pelle umana con etanolo al 70%, quindi stenderla su una superficie ben pulita, preferibilmente sotto una cappa di flusso. Quindi, utilizzare un dermatomero con uno spessore preimpostato per tagliare fette da 200 a 400 micrometri dalla parte superiore della pelle.

Controlla l'integrità delle fette, quindi tagliale ulteriormente in quadrati di due per due centimetri. Posizionare i quadrati nel PBS e poi pulire l'area rasata di un topo beige immunodeficiente combinato di sei-otto settimane preparato chirurgicamente con il 70% di etanolo. Dopo aver applicato l'anestetico locale al sito dell'innesto, utilizzare le forbici curve per rimuovere con cura lo strato superficiale di pelle di topo in un'area leggermente più piccola dei pezzi dell'innesto, facendo attenzione a non disturbare il sistema vascolare sottostante.

Muovendosi rapidamente per evitare di seccare l'innesto, posizionare una delle fette di pelle umana sul letto dell'innesto, assicurandosi che il lato epidermico sia rivolto verso l'alto. Allineare il bordo del fazzoletto e fissarlo con la colla per tessuti. Quindi adattare con cura il resto della pelle umana al letto dell'innesto, posizionando piccole quantità di colla tissutale attorno a ciascun bordo.

Taglia sempre la pelle umana a misura piuttosto che ingrandire il letto dell'innesto. Dopo aver verificato che ogni angolo è fissato, pulire l'area con una soluzione di iodio e applicare un cerotto con fermezza ma non strettamente con il lato del cuscino sopra l'innesto, facendo attenzione che la respirazione dell'animale non sia influenzata, quindi fissare il cerotto con del nastro adesivo e lasciare che l'animale si riprenda su una superficie calda. Una volta sveglio, riportare l'animale nella sua gabbia fino all'iniezione batterica, reinoculare una coltura su piastra durante la notte in coltura liquida.

La mattina dell'infezione, quando i batteri raggiungono la concentrazione desiderata, diluire le cellule a una volta 10 fino alla settima unità formante colonie per millilitro. Quindi, dopo l'anestesia, confermare la sedazione dei topi innestati per punta. Pizzica e posiziona gli animali su un cuscinetto termico.

Metti l'unguento per gli occhi sugli occhi dell'animale, e poi ip. Iniettare in soluzione fisiologica otto milligrammi di trasferimento umano. Quindi, per ogni animale, tagliare la punta della coda e spargere una piccola goccia di sangue dalla coda su una piastra di agar per confermare che il sangue è sterile prima dell'infezione.

Quindi iniettare 100 microlitri di coltura batterica per via endovenosa tramite iniezione retroorbitale. Dopo alcuni minuti, tagliare nuovamente l'estremità della coda e distribuire questo campione di sangue su piastre di agar fresche. Per stabilire le unità formanti le colonie di sangue immediatamente dopo l'infezione, sigillare la coda con colla per tessuti, quindi diluire l'inoculo batterico e distribuirlo su piastre di agar con gli antibiotici appropriati.

Per stabilire le unità formanti colonie di inoculo a sei ore dopo l'infezione, prelevare un'altra piccola quantità di sangue da ciascuna delle code di topo, quindi diluire e placcare le gocce di sangue come appena dimostrato per stabilire le unità formanti colonie a sei ore. Quindi incubare tutte le piastre a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% durante la notte per eseguire la formazione di colonie di organi. Conteggio delle unità di misura degli animali infetti.

Inizia praticando un'incisione sulla linea mediana in ogni topo soppresso. Quindi, per ogni animale, tagliare la costola e praticare un'incisione nel cuore. Utilizzare una siringa sterile per prelevare quanto più sangue possibile dal cuore e dalla cavità toracica e dispensarlo in provette sterili individuali per ogni campione.

Successivamente, rimuovere gli organi di interesse e quindi trasferire gli innesti cutanei e le sezioni di pelle di topo su una piastra sterile per animale. Lasciare coagulare il sangue raccolto per 15 minuti, quindi centrifugarlo. Quindi rimuovere il plasma dal sangue e conservarlo a meno 80 gradi Celsius per un'analisi successiva.

Quindi, pesare le provette omogeneizzatrici contenenti 500 microlitri di PBS ciascuna. E poi usa un punzone per biopsia sterile per prelevare campioni di biopsia da quattro millimetri da ciascun tessuto sezionato. Posizionare le biopsie singolarmente nelle provette omogeneizzatrici con una perlina da due millimetri in ciascuna provetta contenente un campione di pelle.

Conservare i tessuti rimanenti in para formaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per la microscopia e pesare i tubi omogeneizzanti per stabilire il peso della biopsia. Quindi omogeneizzare i campioni a 6.000 giri/min per 30 secondi, ripetendo l'omogeneizzazione della pelle fino a quando l'omogeneizzato non è schifoso. Infine, distribuire i fanghi cellulari di ciascuna provetta su piastre di agar fresche e far crescere le colture durante la notte a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.

Per stabilire le colonie di organi, le unità che formano contano in questi risultati rappresentativi. Un ceppo positivo alla GFP di meningite N. È stato utilizzato il sierogruppo C.

L'emocromo ha mostrato che cinque minuti dopo l'iniezione endovenosa di una volta 10 alle sei unità formanti colonie di batteri, c'era una media di 1,5 volte 10 alla quinta unità formante colonie per millilitro circolante nel sangue. Dopo sei ore, i conteggi sono in media di 4,8 volte 10 per la quarta unità di formazione di colonie per millilitro entro 24 ore. I conteggi medi erano 2,4 volte 10 per la quarta unità formante colonia per millilitro.

Ma in questo gruppo di 10 topi, cinque non avevano batteri circolanti rilevabili, mentre gli altri cinque avevano conteggi relativamente alti. Queste barre su questi grafici mostrano i valori mediani per ciascun conteggio delle CFU di gruppo prelevati dalla pelle. I campioni mostrano che la maggior parte dei topi ha una conta considerevole nella pelle umana, con una media di 2,1 volte 10 per la quarta CFU per milligrammo di tessuto a sei ore e 4,4 volte 10 per la seconda CFU per milligrammo di tessuto a 24 ore.

I campioni di pelle di topo controlaterale non hanno mostrato conta batterica a 24 ore e solo un numero molto basso a sei ore, dimostrando la forte preferenza per la meningite terminale rispetto ai vasi umani nel tessuto innestato. In generale, la conta batterica era molto bassa o non rilevabile nell'altro organo campionato, anche se due animali hanno mostrato conta, che possono essere correlati con un alto numero di batteri circolanti. Questo modello può anche essere utilizzato per determinare il ruolo dei fattori di virulenza in vivo.

Ad esempio, in questo esperimento, ceppi batterici privi di pillola funzionale di tipo 4 sono stati utilizzati topi infettati con questi ceppi mutanti che non hanno mostrato adesione batterica negli innesti di pelle umana, confermando il ruolo cruciale che la pillola di tipo quattro I svolge nell'adesione in vivo. In queste immagini confocali di un trapianto cutaneo, due ore dopo l'infezione, si possono osservare vasi umani colorati con lectina UEA romina coniugata. Il bordo dermico epidermico della pelle è chiaramente identificabile e la GFP positiva e la meningite infettanti possono essere chiaramente osservate in tutti i vasi.

Questo trapianto di pelle umana colorato con h ed e mostra infiammazione e perdite vascolari, nonché la trombosi concentrata nei vasi vicini al bordo dermico epidermico. 24 ore dopo l'infezione In circa il 30% delle infezioni, le aderenze batteriche nella pelle hanno portato allo sviluppo di porpora rilevabile macroscopicamente. Quindi lo sviluppo di questa tecnica apre la strada ai ricercatori coinvolti nella ricerca e nelle interazioni tra patogeni dell'ospite per studiare i meccanismi della malattia nel contesto dei vasi umani.