Sintesi rapida e screening dei fattori di trascrizione attivati ​​chimicamente con i giornalisti a base di GFP-

L'obiettivo generale di questa procedura è creare, testare e validare fattori di trascrizione artificiali codificati geneticamente e inducibili, o ATF, con specificità desiderata. Questo viene ottenuto innanzitutto creando l'ATF mediante una semplice trasformazione del lievito in cui l'inclusione di un prodotto PCR relativo a un dominio di legame al DNA determina una fusione in frame con un recettore umano per gli estrogeni e VP16. Il secondo passaggio della procedura consiste nel creare un plasmide reporter GFP per l'ATF sostituendo i siti di legame nel plasmide PMN otto con sequenze bersaglio del fattore di trascrizione.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel saggio della capacità degli ATF di attivare il reporter GFP e nella valutazione del loro effetto sulla fisiologia del lievito misurando il tasso di crescita. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'utilizzo di un fattore di trascrizione validato per esprimere in modo condizionale un bersaglio genomico nativo. In definitiva, qualsiasi gene bersaglio di interesse può essere reso condizionatamente attivo.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'induzione mediata da galattosio dell'espressione genica, è che l'induzione selettiva può essere ottenuta in diverse condizioni nutrizionali e fisiologiche senza effetti pleiotropici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia del lievito attraverso l'introduzione rapida e reversibile di prodotti genici desiderati, permettendo lo studio sia dell'acquisizione che della perdita di funzione. Per iniziare, amplificare mediante PCR il dominio di legame al DNA o DVD di interesse utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà.

Trasformare più di un microgrammo del prodotto PCR purificato in lievito utilizzando il metodo dell'acetato di litio. Dopo la trasformazione, centrifugare le cellule alla velocità massima per 15 secondi in una microcentrifuga, rimuovere la miscela di trasformazione e risospendere le cellule in circa 200 microlitri di acqua sterile prima di seminare su estratto di lievito. Il giorno successivo, effettuare una piastra di replica da YPD (estratto di lievito, peptone e destrosio) su cinque piastre contenenti acido cinque-fluoro-orotico.

Dopo una crescita di due-quattro giorni, ripiantare almeno cinque-dieci colonie su YPD. Successivamente, eseguire una PCR su colonia utilizzando i primer indicati nel protocollo del testo e sequenziare per verificare l'inclusione. Diluire gli oligonucleotidi della regione di legame desiderata a concentrazioni equimolari.

Fosforilare la regione di legame utilizzando la polinucleotide chinasi T4, quindi utilizzare un neotermociclere secondo le condizioni di reazione indicate nel protocollo. Successivamente, digerire circa uno-due microgrammi di PMN8 con NotI HF e XbaI per un'ora a 37 gradi Celsius in gel.

Separare la banda del plasmide e diluire il plasmide purificato a 10 nanogrammi per microlitro. Quindi, diluire il sito di legame fosfato a doppio filamento a una concentrazione molare pari a cinque volte quella del plasmide per microlitro. Utilizzando la DNA ligasi T4, legare i siti di legame al plasmide digerito a temperatura ambiente per 30 minuti.

Eseguire la trasformazione aggiungendo metà della reazione di ligazione a 50 microlitri di cellule di EIA coli chimicamente competenti, seguendo la procedura indicata nel protocollo testuale. Dopo il recupero delle cellule, aggiungere da 100 a 200 microlitri di cellule per piastra luria berti o lb più ampicillina, e incubare per tutta la notte. Il giorno successivo coltivare l’e. coli in brodo lb più ampicillina e isolare il DNA plasmidico come descritto nel protocollo testuale.

Quindi, eseguire il sequenziamento per verificare il nuovo plasmide reporter proveniente dalle colonie di ligazione. Infine, trasformare il nuovo plasmide reporter nel ceppo E contenente il fattore di trascrizione (A TF) mediante trasformazione con acetato di litio. Per iniziare, coltivare un ceppo contenente il fattore di trascrizione più il reporter in modo da ottenere una coltura notturna in cinque millilitri di mezzo sintetico completo privo di uracile.

Procurarsi 9 fiale da 250 millilitri e aggiungere 25 millilitri di SC privo di URA a ciascuna. Preparare quindi sette delle fiale con diverse diluizioni di beta-estradiolo, come indicato nel protocollo testuale, mediante diluizioni seriali decrescenti di una soluzione madre di beta-estradiolo 25 millimolare; aggiungere 125 microlitri delle colture notturne a queste sette fiale. Per le due fiale rimanenti, inoculare una con un ceppo produttore costitutivo di GFP e una con un ceppo privo di GFP. Queste sono necessarie per la calibrazione del citofluorimetro.

Agitare il matraccio a 200 giri/min e 30 gradi Celsius per 12-18 ore. Successivamente, prelevare 500 microlitri di ciascuna coltura e centrifugare in provette einor separate da 1,7 millilitri. Dopo l'aspirazione del soprannatante, lavare una volta le cellule pellettizzate con buffer per citometria a flusso, quindi risospendere le cellule in un millilitro dello stesso buffer.

Successivamente, aggiungere un millilitro di buffer per citometria a flusso in nove falcon da due. Aggiungere le cellule risospese nei tubi falcon contenenti il buffer, fino a un volume finale pari a due millilitri. Infine, eseguire la citometria a flusso.

Utilizzare la diffusione anteriore e la diffusione laterale per identificare le cellule di lievito. Impostare la portata a circa 3000 cellule al secondo. Misurare la GFP attraverso il canale 50 e procedere come descritto nel protocollo testuale: partendo da ceppi congelati, seminare su YPD sia una ceppo contenente A TF sia un ceppo privo di A TF. Dopo due giorni di crescita, inoculare tubi di coltura separati contenenti cinque millilitri di terreno liquido YPD e coltivare ogni ceppo per tutta la notte a 30 gradi Celsius.

Eseguire diluizioni seriali di un fattore dieci di una soluzione madre di beta-estradiolo 0,25 millimolare fino a un fattore 10.000 in etanolo al 100%. Aggiungere 40 microlitri di ciascuna coltura notturna a 10 millilitri di terreno liquido YPD. Per ciascun ceppo, aggiungere 96 microlitri delle cellule diluite in 18 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.

Quindi aggiungere quattro microlitri di beta-estradiolo alle cellule. Un punto essenziale è assicurarsi che ogni pozzetto contenga la stessa quantità totale di etanolo. Eseguire un'analisi in triplicato utilizzando tre pozzetti per ceppo, contenenti esclusivamente etanolo.

I controlli coprono la piastra a 96 pozzetti con una membrana permeabile ai gas. Monitorare la crescita a una densità ottica di 600 nanometri mediante un lettore di piastre. Quantificare i tassi di crescita utilizzando diversi metodi, ad esempio individuando la pendenza massima.

Dopo aver preparato il plasmide come indicato nel protocollo testuale PCR, amplificare il cassetto del promotore can MX. Trasformare il prodotto PCR in una ceppa esprimente A TF utilizzando il metodo di acetato di litio, piastrare le cellule trasformate su YPD e effettuare un replica plating su YPD più antibiotico G418 il giorno successivo. Infine, confermare l'inserimento corretto del promotore utilizzando un primer forward e un primer reverse interno al gene il cui promotore è stato sostituito.

Il prodotto finale della PCR è di circa 1,2 KB. Qui viene mostrata l'induzione di GFP mediante tre diversi promotori di fattori di trascrizione: Z4 EVZ, 3EV o GEV, nel tempo in risposta a un micromolare di beta-estradiolo. Si noti l'aumento della produzione di GFP in risposta ai fattori di trascrizione contenenti domini di legame al DNA non derivati dal lievito. Ciò potrebbe dipendere dalla capacità di questi fattori di raggiungere una specificità per un singolo gene nel genoma del lievito.

L'induzione da sola da parte di GEV porta all'attivazione o alla repressione di centinaia di geni, mentre Z three EV e Z four EV attivano soltanto l'espressione di un gene bersaglio posizionato a valle di un promotore sintetico contenente siti di legame appropriati. Qui viene mostrata l'induzione di GFP da parte di Z three EV in risposta a zero nanomolar di beta-estradiolo e a un micromolare di beta-estradiolo dopo 18 ore di induzione. La fluorescenza è stata misurata anche in cellule prive di GFP per illustrare il rigoroso controllo del sistema Z three EV. La capacità di Z three EV di indurre GFP in una serie di concentrazioni di beta-estradiolo è mostrata qui.

L'intensità media della fluorescenza delle distribuzioni rivela che la relazione tra concentrazione dell'induttore e livello di espressione è graduale, con un coefficiente di Hill di circa uno, indicativo di un legame indipendente di Z tre EV. Seguendo questo procedimento, altri metodi come i microarray per l'espressione genica potrebbero essere eseguiti al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio come la modulazione dell'espressione di un singolo gene influisca sui profili genomici di espressione genica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come progettare, testare e validare l'efficacia di fattori di trascrizione artificiali. Questi fattori di trascrizione artificiali controllano in modo condizionale l'espressione di geni posizionati a valle di specifiche sequenze target di DNA.