Sintesi rapida e screening dei fattori di trascrizione attivati ​​chimicamente con i giornalisti a base di GFP-

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare, testare e convalidare fattori di trascrizione artificiali inducibili o ATF geneticamente codificati con la specificità desiderata. Ciò si ottiene creando prima l'A TF tramite una semplice trasformazione del lievito in cui l'inclusione del prodotto PCR del dominio di legame del DNA A si traduce in una fusione in-frame con un recettore degli estrogeni umani e VP 16. La seconda fase della procedura consiste nel creare un plasmide reporter GFP per l'A TF sostituendo i siti di legame nel plasmide PMN otto con sequenze di targeting TF.

La terza fase della procedura consiste nel testare la capacità degli ATF di attivare il reporter GFP e nel valutare anche il suo effetto sulla fisiologia del lievito misurando il tasso di crescita. La fase finale della procedura consiste nell'utilizzare un TF convalidato per esprimere condizionatamente un bersaglio genomico nativo. In definitiva, qualsiasi gene bersaglio di interesse può essere reso condizionatamente attivo.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'induzione dell'espressione genica mediata dal galattosio, è che l'induzione selettiva può essere ottenuta in diverse condizioni nutrizionali e fisiologiche senza effetti pleotropici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia del lievito attraverso l'introduzione rapida e reversibile dei prodotti genici desiderati, consentendo lo studio sia del guadagno che della perdita di funzione. Per iniziare, la PCR amplifica il dominio di legame del DNA o DVD di interesse utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà.

Trasformare più di un microgrammo del prodotto PCR purificato in lievito utilizzando il metodo dell'acetato di litio. Dopo la trasformazione, centrifugare le cellule alla massima velocità per 15 secondi in una microcentrifuga, rimuovere la miscela di trasformazione e risospendere le cellule in circa 200 microlitri di acqua sterile prima di applicare l'estratto di lievito. Pepto destrosio o YPD medium il giorno successivo replica la piastra da YPD su cinque piastre di acido fluoroerotico.

Dopo una crescita da due a quattro giorni, rere almeno da cinque a 10 colonie su YPD. Quindi eseguire una PCR della colonia utilizzando i primer nel protocollo e nella sequenza di testo per verificare l'inclusione. Diluire gli oligo della regione di legame desiderati a concentrazioni equimolari.

Fosforilare la regione di legame utilizzando la chinasi polinucleotidica T quattro, e quindi un neo termociclatore secondo le condizioni di reazione nel protocollo di testo. Successivamente, digerire circa uno o due microgrammi di PMN otto senza un HF e xb. Uno per un'ora a 37 gradi Celsius gel.

Purificare la fascia dorsale e diluire la spina dorsale purificata a 10 nanogrammi per microlitro. Quindi diluire il sito di legame fosforilato a doppio filamento a cinque volte la concentrazione molare della spina dorsale per microlitro. Utilizzando la T 4 DNA ligasi, legare i siti di legame nella spina dorsale digerita a temperatura ambiente per 30 minuti.

Eseguire la trasformazione aggiungendo metà della reazione di legatura a 50 microlitri di cellule standard di EIA coli chimicamente competenti e seguendo la procedura elencata nel protocollo di testo. Dopo aver recuperato le cellule, aggiungere da 100 a 200 microlitri di cellule per luria berti o lb più piastra di ampicillina, e incubare per una notte. Il giorno successivo crescono e coli e lb più ampicillina liquida e raccolgono il DNA plasmidico come descritto nel protocollo di testo.

Quindi verifica la sequenza del nuovo plasmide reporter dalle colonie di legatura. Infine, trasformare il nuovo plasmide reporter nel ceppo E contenente A TF utilizzando la trasformazione dell'acetato di litio. Per iniziare a coltivare un TF plus reporter contenente ceppo durante la notte in cinque millilitri di terreno sintetico completo privo di uracile.

Ottenere 9 250 millilitri, agitare il pallone e aggiungere 25 millilitri di SC meno URA a ciascuno. Quindi preparare sette dei flaconi con una diversa diluizione del beta estradiolo come elencato nel protocollo di testo dalla diluizione seriale di dieci volte di un stock di beta estradiolo da 25 millimolari a 125 microlitri delle colture notturne a questi sette flaconi per i due flaconi rimanenti inoculare con un ceppo costitutivo che produce GFP e un ceppo privo di GFP. Questi sono necessari per calibrare il citometro a flusso.

Agitare il pallone a 200 giri/min e 30 gradi Celsius per 12-18 ore. Quindi rimuovere 500 microlitri di ciascuna coltura e centrifugare in provette einor separate da 1,7 millilitri. Dopo aver aspirato il surnatante, sciacquare una volta le cellule pellettate con un tampone per citometria a flusso, quindi risospendere le cellule in un millilitro dello stesso tampone.

Quindi, aggiungere un millilitro di tampone per citometria a flusso a nove falcon two. Aggiungere le cellule risospese al tampone contenente le provette di falco per un volume finale pari a due millilitri. Infine, eseguire la citometria a flusso.

Utilizzare la dispersione in avanti e la dispersione laterale per identificare le cellule di lievito. Impostare la portata a circa 3000 celle al secondo. Misurare la GFP attraverso il canale 50 e procedere come nel protocollo di testo, dalle scorte congelate si estrae sia un ceppo contenente A TF che un ceppo privo di A TF su YPD Dopo due giorni di crescita, inoculare provette di coltura separate contenenti cinque millilitri di liquido YPD e far crescere ogni ceppo durante la notte a 30 gradi Celsius.

Eseguire diluizioni seriali di dieci volte di una soluzione madre di beta estradiolo 0,25 millimolare fino a 10.000, piegare in etanolo al 100%. Aggiungere 40 microlitri di ogni coltura notturna a 10 millilitri di liquido YPD. Per ogni ceppo, aggiungere 96 microlitri di cellule diluite a 18 pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.

Quindi aggiungere quattro microlitri di beta estradiolo alle cellule. Un punto essenziale è assicurarsi che ogni pozzetto abbia la stessa quantità di etanolo totale. Eseguire un triplicato con tre dei pozzetti per ogni ceppo che sono solo etanolo.

I controlli coprono la piastra a 96 pozzetti in una membrana permeabile ai gas. Monitora la crescita a una densità ottica di 600 nanometri in un lettore di piastre. Quantifica i tassi di crescita utilizzando un numero qualsiasi di metodi, come trovare la pendenza massima.

Dopo aver preparato il plasmide come indicato nel protocollo di testo PCR, amplificare la cassetta del promotore MX della lattina. Trasformare il prodotto della PCR in un ceppo che esprime A TF utilizzando la piastra per il metodo dell'acetato di litio, trasformare le cellule su YPD e la piastra di replica su YPD più l'antibiotico G four 18 il giorno successivo. Infine, confermare l'inserimento appropriato del promotore utilizzando il primer diretto e un primer inverso interno al gene il cui promotore è stato sostituito.

Il prodotto finale della PCR è di circa 1,2 KB: qui è mostrata l'induzione della GFP da parte di tre diverse coppie di promotori TF: Z, quattro EVZ, tre EV, o GEV nel tempo in risposta a un micromolare beta estradiolo. Si noti l'aumento della produzione di GFP in risposta agli ATF contenenti domini non leganti il DNA del lievito. Ciò può derivare dal fatto che questi fattori raggiungono la specificità di un singolo gene nel genoma del lievito.

La sola induzione di GEV porta all'attivazione o alla repressione di centinaia di geni, mentre Z tre EV e Z quattro EV attivano solo l'espressione di un gene bersaglio posto a valle di un promotore sintetico contenente appropriati siti di legame. Qui, viene mostrata l'induzione della GFP da parte di Z tre EV in risposta a zero nanomolari beta estradiolo e un micromolare beta estradiolo dopo 18 ore di induzione La fluorescenza è stata misurata anche da cellule prive di GFP per illustrare la stretta regolazione del sistema Z tre EV. Qui è mostrata la capacità di Z 3 EV di indurre GFP in un intervallo di concentrazioni di beta estradiolo.

La fluorescenza media delle distribuzioni rivela che la relazione tra la concentrazione dell'induttore e l'output di espressione è classificata con un coefficiente di hill di circa uno che indica il legame indipendente di Z tre EV Seguendo questa procedura, altri metodi come i microarray di espressione genica potrebbero essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come il modo in cui la modifica dell'espressione di un singolo gene influisce sui modelli di espressione genica del vino del genoma. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ingegnerizzare, testare e convalidare l'efficacia dei fattori di trascrizione artificiali. Questi fattori di trascrizione artificiali controllano condizionatamente l'espressione di geni posti a valle di appropriate sequenze bersaglio del DNA.