Name: Sintesi rapida e screening dei fattori di trascrizione attivati chimicamente con i giornalisti a base di GFP- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Scopri come creare e validare fattori di trascrizione artificiali inducibili nel lievito utilizzando trasformazione con acetato di litio e citometria a flusso per misurare l'espressione GFP.

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RSM riconosce finanziamento dal NSF Graduate Research Fellowship. MBN riconosce finanziamenti da Lewis-Sigler Fellowship e il dono dotati di Peter Lewis. DB riconosce finanziamenti del NIH (GM046406), l&#39;Istituto Nazionale di General Medical Sciences Center for Quantitative Biology (GM071508). Riconosciamo Christina DeCoste per l&#39;assistenza con gli esperimenti di citometria a flusso.

La Figura 2 fornisce uno schema di protocollo sezioni 1-3. 1. Creazione di ATF <ol><li> Crea primers per PCR amplificare DNA binding domain di interesse. Omologia con il recettore promotore EFF1 e ormone (come descritto nelle figure 3 e 4) è aggiunto mediante PCR per facilitare la corretta ricombinazione nel ceppo yMN15. </li><li> PCR amplifica DBD di interesse utilizzando un polimerasi ad alta fedeltà. </li><li> Trasformazione&gt; 1 mg di prodotto di PCR purificato in lievito utilizzando il metodo acetato di litio 13. </li><li> A seguito di trasformazione, celle di rotazione alla massima velocità per 15 secondi in microcentrifuga e rimuovere trasformazione mix. </li><li> Risospendere in ~ 200 ml di acqua sterile e piatto su YPD. </li><li> Il giorno successivo, piastra replica da YPD su piastre 5-FOA (piastre 5-FOA sono fatti come descritto nel manuale di lievito Cold Spring Harbor) 13. </li><li> Consentire la crescita per 2-4 days, e restreak almeno 5-10 colonie su YPD. Eseguire una colonia PCR utilizzando i primer in Tabella 1 e la sequenza di verificare inclusione. </li></ol> 2. Creazione di ATF plasmidi Reporter <ol><li> Determinare il sito di legame ATF (più probabile che provengono dalla letteratura). </li><li> Nell&#39;ordine desiderato regione vincolante oligo (o Ultramers, se necessario). Ordine come top e filoni di fondo con sbalzi corretti per Notl &amp; XbaI come indicato nella Tabella 2. </li><li> Diluire oligo concentrazioni equimolari (100 micron). </li><li> Fosforilare utilizzando T4 polinucleotide chinasi e poi ricottura in un termociclatore. Le condizioni di reazione sono in Tabella 3. </li><li> Digest ~ 1-2 mg di pMN8 con NotI-HF e XbaI per 1 ora a 37 ° C (condizioni di reazione nella Tabella 4). </li><li> Gel purificare la fascia dorsale. </li><li> Diluire il backbone purificata a 10 ng / ml. </li><li> Diluire il doppio filamento, fosforileated sito di legame a 5 volte la concentrazione molare di backbone per microlitri. </li><li> Utilizzando T4 DNA ligasi, legare i siti di legame nella catena principale digerito a temperatura ambiente per 30 minuti (Tabella 5). </li><li> Per la trasformazione, aggiungere metà della reazione di ligazione a 50 ml di norma, chimicamente competenti Escherichia coli come XL1-Blue o DH5-Alpha. </li><li> Cellule scossa di calore per 45 secondi in un bagno d&#39;acqua a 42 ° e poi mettere in ghiaccio per 2 min. </li><li> Aggiungere 900 pl di mezzo SOC di reazione di trasformazione. </li><li> Crescere a 37 ° C per 1 ora su un tamburo rullo. </li><li> Stendere 100-200 cellule microlitri per LB + AMP (100 pg / ml) piastra e incubare una notte. </li><li> Crescere E. coli in LB + AMP liquido e la raccolta del DNA plasmide. Sequenza verificare nuovo plasmide reporter colonie legatura utilizzando il primer 5&#39;-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 &#39;. </li><li> Trasforma nuovo plasmide reporter di in-ATF contenenti lievito strain dalla sezione 1 con litio trasformazione acetato. </li></ol> 3. Quantificare l&#39;effetto di ATF induzione sull&#39;espressione genica Uso GFP Reporter Preparazione dei campioni: <ol><li> Fai 25 mm magazzino β-estradiolo (10 ml di etanolo + 0,0681 g di β-estradiolo). Conservare in frigorifero. </li><li> Grow ATF + Reporter contenenti ceppo pernottamento in 5ml SC-URA. </li><li> Ottenere nove 250 ml scuotono palloni e aggiungere 25 ml di SC-URA a ciascuno. </li><li> Aggiungere 0 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 mM, o 10 mM β-estradiolo. Questo è più facilmente fatto facendo diluizioni seriali di 10 volte della β-estradiolo magazzino 25 mm. Per una concentrazione finale di 10 mM β-estradiolo, aggiungere 10 ml di β-estradiolo magazzino 25 mM a 25 ml di SC-URA. </li><li> Aggiungere 125 ml di culture durante la notte per fiaschi (1:200 diluizione). </li><li> Per i due rimanenti boccette, inoculare con un costitutiva GFP produzione strain ed un ceppo privo GFP. Questi sono necessari per la calibrazione del citometro a flusso. </li><li> Agitare a 200 rpm a 30 ° C per 12-18 ore. Nota: Il tempo ottimale di incubazione è determinata individuando quando induzione GFP non cambia più in seguito all&#39;aggiunta di β-estradiolo. </li><li> Prendete 500 ml di ogni cultura e spin giù in tubi di 1,7 ml microcentrifuga separate. </li><li> Aspirare SC-URA. </li><li> Risciacquare una volta in 1 ml di PBS +0,1% Tween-20 e aspirare. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS +0,1% di Tween-20 e risospendere. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS +0,1% Tween-20 per provette Falcon. </li><li> Aggiungere le cellule risospese a 5 ml provette (volume finale = 2 ml) (può essere conservato a 4 ° C per diversi giorni). </li><li> Optional: cellule Sonicare leggermente per rottura eventuali cellule clumped. Citometria a flusso: Descrizione: La fluorescenza delle cellule 10,000-100,000 è tipicamente analizzata per campione. I dati potranno essere trattati in FlowJo o utilizzare script personalizzati in MATLAB oR. Assicurarsi di calibrare tensione del canale GFP usando GFP controlli positivi e negativi. Una volta che i file FCS sono esportati, uno script come quello in figura 6 con le fca_readfcs funzionali ( <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader</a> ) può essere utilizzato per elaborare il dati. </li><li> Eseguire la citometria a flusso. <ol><li> Usa forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) per identificare le cellule di lievito. </li><li> Impostare la portata di ~ 3.000 cellule / sec. </li><li> Misurare GFP (canale FITC). </li><li> ,. FCS file di esportazione volta che i dati vengono raccolti </li></ol></li><li> Caricare MATLAB. </li><li> Spostare i file. FCS, fcs_readfcs.m, e uno script simile a quella in figura 6 nella stessa cartella. </li><li> Cambiare la directory di lavoro alla cartella contenente i dati e gli script. </li><li> Eseguire lo script di Figura 6 (nota: l&#39;leggenda è stato inserito manualmente per produrre ciò che è visibile nella figura 7). </li></ol> 4. Quantificare l&#39;effetto di ATF induzione sulla crescita delle cellule <ol><li> Da scorte congelate, realizzato su entrambi (1) un ceppo-ATF contenimento e (2) un ceppo-ATF manca (come yMN15) su piastre YPD separati. </li><li> Dopo 2 giorni di crescita, inoculare provette di coltura separate contenenti 5 ml di liquido YPD con ogni ceppo e crescere per una notte a 30 ° C. </li><li> Eseguire 10-diluizioni seriali di una soluzione madre mM β-estradiolo 0,25 fino a 10.000 volte (0.025 mM β-estradiolo) in etanolo al 100%. </li><li> Aggiungere 40 ml di colture overnight a 10 ml di liquido YPD (1-250 diluizione). </li><li> Per ogni ceppo, aggiungere 96 ml di cellule diluite a 18 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 4 ml di β-estradiolo alle cellule. Un punto essenziale è assicurarsi ogni pozzetto ha la stessa quantità di etanolo totale. (In alternativa, un mo<html> re magazzino concentrata di β-estradiolo può essere utilizzato e successivamente diluite al punto gli effetti dell&#39;etanolo sulla crescita non è misurabile). </li><li> Eseguire in triplice copia. Tre dei pozzetti per ogni ceppo deve essere etanolo-solo controlli. </li><li> Coprire la piastra a 96 pozzetti del gas membrana permeabile. </li><li> Monitorare la crescita (OD 600) in lettore di piastre. </li><li> Quantificare i tassi di crescita utilizzando un qualsiasi numero di metodi standard come trovare la massima pendenza. Nota: Abbiamo avuto un buon successo con l&#39;open source software grofit 14, che viene eseguito in ambiente di programmazione R Vale la pena ricordare che, mentre i tassi di crescita calcolati da saggi piastra a 96 pozzetti rispetto a scuotere-palloni (25 ml culture). non sono necessariamente le stesse (a causa di entrambe le differenze nella fisiologia e nella strumentazione), abbiamo osservato che i tassi di crescita relativi sono simili (anche se questo può non essere sempre il caso). </li></ol>tle &quot;&gt; 5. Crea inducibili Genomica alleli <ol><li> Ottenere pMN10, un plasmide noncentromeric con il promotore ATF-reattiva da pMN8 fusa KanMX (con orientamento opposto). </li><li> Limitazione digerire il vettore backbone ed estratto gel come nella sezione 2. </li><li> Tempra, fosforilare, e oligo Legare contenenti appropriate siti di legame come descritto nella Sezione 2. </li><li> Sequenza di verifica. Questo plasmide servirà ora come stampo il DNA per creare l&#39;allele inducibile. </li><li> Ottenere il ceppo di lievito che esprime il corrispondente ATF di interesse. </li><li> PCR amplifica la cassetta KanMX-Promoter (~ 2 kb) utilizzando primer dalla tabella 6. </li><li> Trasformare il prodotto di PCR nel ceppo-ATF esprimere con il metodo acetato di litio. </li><li> Piatto su YPD e la piastra replica su YPD + G418 il giorno seguente. </li><li> Conferma appropriato inserimento del promotore utilizzando il primer forward (5&#39;-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 &#39;) e un innesco inverso interna al secoloe gene il cui promotore è stato sostituito. L&#39;innesco inverso è in genere progettati per essere tra 200-300 bp a valle del primo ATG 15. Il prodotto finale di PCR è ~ 1,2 kb. </li></ol>

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</ol>

McIsaac, Noyes, e Botstein (con gli altri) hanno presentato parte di questo sistema come un Disclosure brevetti.

Gli interruttori a base di ormoni descritte hanno una miriade di applicazioni, dallo studio biologia cellulare nativo per valutare la capacità di un dominio di legame al DNA di interesse per indirizzare una sequenza di DNA in vivo. Il sistema ha molte caratteristiche desiderabili, tra cui una risposta graduata a induttore, azione veloce e stretta regolazione (cioè. Senza leakiness misurabile, vedi Figura 7). Tuttavia, c&#39;è ancora margine di miglioramento ed espansione. Un recente lavoro di biologia sintetica ha sottolineato sistemi sintetici di multiplazione e ampliando il repertorio di ben caratterizzati, parti di DNA programmabili 16. Indipendente, espressione condizionale di geni bersaglio distinti richiede sia più induttori e DNA domini di legame che mancano sovrapposizione specificità. La disponibilità di recettori ingegneria e naturali fornisce un ampio insieme di pezzi con cui sviluppare nuovi fattori di trascrizione artificiale. Ampliare ilrepertorio di interruttori mutuamente ortogonali è stato notevolmente aiutato dalla evoluzione diretta approcci 17,18. Gli attuali sforzi per riprogrammare la specificità-ligando dei nostri fattori di trascrizione artificiali saranno presentati in futuro. In precedenza, le conseguenze fenotipiche del gene delezione / iperespressione sono stati ampiamente studiati in lievito 19,20. Tuttavia, non è stato semplice per studiare l&#39;effetto di espressione su diversi fenotipi su una gamma di livelli di espressione. Una caratteristica principale del sistema qui presentato è la sua natura graduata (Figura 8). Mentre spesso si pensa, il rapporto tra l&#39;espressione genica e fenotipi di interesse può non necessariamente essere monotona. Fattori di trascrizione artificiali come Z 3 EV e Z 4 EV farà il compito di saggiare le risposte fenotipiche ai cambiamenti nell&#39;espressione genica semplice. Infine, i protocolli discutonoed in questo manoscritto sono per ingegneria e caratterizzare fattori trascrizionali artificiali che rispondono a β-estradiolo, tuttavia, un&#39;importante alternativa ai domini chimicamente reattivo è l&#39;uso di domini luce-responsive (come il PhyB/Pif3, LOV, e BLUF), attività di cui sono reversibili senza dover turbare il mezzo di crescita della coltura 21-23. Sistemi basati su luce facilitano il controllo spazio-temporale dell&#39;espressione genica, le interazioni proteina-proteina, trasporto di ioni, e l&#39;attività enzimatica, che hanno già dimostrato potente 21-26. In conclusione, abbiamo presentato metodi per la costruzione rapida di inducibili, fattori di trascrizione artificiali in lievito. Questo protocollo fornisce un modello per la loro costruzione in congiunzione con i reporter GFP affini, nonché metodi per analizzare i dati giornalista citometria a flusso e saggiando l&#39;effetto dell&#39;attivazione ATF sulla crescita.

Sviluppare interruttori genetici nel lievito è di grande interesse per la ricerca sia accademica che industriale. Nel caso ideale, interruttori genetici possono essere utilizzati per attivare un gene particolare (o insieme di geni) solo quando desiderato dallo sperimentatore. Sequenza codificante di un gene posto a valle di un promotore sintetico non è espresso in assenza di una molecola che induce: su induttore Inoltre il gene deve essere espresso rapidamente. E &#39;stato solo recentemente dimostrato che tale interruttore può essere progettato in lievito, quando, in assenza di induttore, il ceppo mostra un fenotipo delezione, ma in presenza di induttore, espressione viene attivato in proporzione al livello di induttore in tutte le cellule 1,2. Storicamente, sistemi di espressione condizionali in lievito hanno fatto affidamento su di sequenze di DNA di nutrienti-sensibile, tra cui il MET, PHO, e promotori GAL (le cui attività sono sensibili ai livelli extracellulari di metionina, fosfato egalattosio, rispettivamente). Mentre espressione condizionale può essere realizzato, si tratta a costo di significativi effetti pleiotropici. Recettori ormonali come i recettori degli estrogeni umani hanno dimostrato di essere efficaci interruttori in eucarioti 3,4. In assenza di ormone, una proteina fusa ad un recettore ormonale può essere sequestrato nel citoplasma dove interagisce con il complesso chaperone Hsp90. In seguito al legame del ligando appropriato, il recettore subisce un cambiamento conformazionale, facendolo essere rilasciato dal complesso chaperone Hsp90 e rivelare un segnale di localizzazione nucleare. Per osservare le dinamiche di localizzazione di una particolare proteina-recettore contenente ormone, abbiamo creato una fusione C-terminale di Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, un fattore di trascrizione sintetico contenente il dominio di legame al DNA Gal4p, il dominio di legame del ligando del recettore di estrogeno umano , e VP16) con GFP 2. Localizzazione nucleare è stata osservata entro 8 minuti in seguito all&#39;aggiunta disaturando quantità di induttore, ß-estradiolo, alla quale tipo selvatico lievito è completamente inerte. A questo punto, la maggior parte delle cellule hanno chiaramente visibili siti attivi per la trascrizione di geni bersaglio GEV (dosati mediante ibridazione in situ fluorescente) e mRNA completamente maturi 2,5. GEV geni bersaglio aumento nell&#39;espressione&gt; 2 volte entro 2,5 min 2,6 (misurata utilizzando microarrays), dimostrando che essa impiega &lt;2,5 min per l&#39;attivatore chimerico di traslocare al nucleo, legare il DNA, e attivare la trascrizione. Mentre molti altri on-switch sono stati applicati in lievito che utilizzano varie piccole molecole o farmaci (inclusi i classici interruttori a base di doxiciclina da Escherichia coli 7,8 e un interruttore a base di indaco-9 da Arabidopsis thaliana), nessuno ha raggiunto la velocità, specificità, o tensione di regolamentazione esibito da interruttori a base di ormoni. Vale la pena ricordare tcappello rapido off-switch sono stati anche sviluppati nel lievito, e in genere funziona fondendo un gene per una proteasi o ubiquitina ligasi di targeting sequenza 2,10,11,12. La possibilità di rimuovere rapidamente una proteina bersaglio dalla cella facilita lo studio di geni essenziali e geni che sono inclini a soppressione genetica quando soppresso 10. I metodi descritti in questo protocollo sono per la costruzione e la caratterizzazione sintetica-switch nel lievito. In primo luogo, mostriamo come generare rapidamente proteine ​​di fusione genomically integrati costituiti da un dominio di legame al DNA di interesse, il ligando dominio del recettore degli estrogeni umani vincolante, e VP16 (DBD-EV). Seguendo il nostro protocollo, la proteina di fusione è espressa da un promotore ACT1. Abbiamo poi mostreremo come creare un reporter plasmide affine per l&#39;ATF e testare la sua funzionalità mediante citometria a flusso. Sebbene prevediamo questi plasmidi reporter in uso con nuove ATF (Figura 1), si possono be utilizzati come reporter per un attivatore trascrizionale nativo pure. Infine, vengono forniti dettagli per testare l&#39;effetto dell&#39;attivazione ATF sulla crescita delle cellule in piastre da 96 pozzetti e per l&#39;ingegneria inducibili alleli genomiche.

<table><tbody><tr><td>Nome del reagente</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Commenti&nbsp;</td></tr><tr><td>Espandi il sistema PCR ad alta fedeltà</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Competente E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>Estradiolo</td><td>Tocris Biosciences</td><td>2824</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-23</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>clonNAT</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-102L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>D15-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD Biosciences</td><td>210929</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolo</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di litio diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6883</td><td></td></tr><tr><td>Sperma di salmone DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Plasmidi pMN8 e pMN10; ceppo di lievito yMN15</td><td>Noyes o Botstein labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Brodo</td><td>ATTREZZATURA</td><td></td> Sigma-Aldrich L3397<td></td></tr>: <tr><td></td> Ciclometro a flusso LSRII&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>Vari modelli</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB o FlowJo</td><td>MATLAB o FlowJo</td><td></td><td>Software per l'analisi . File FCS da esperimenti di citometria a flusso</td></tr><tr><td>R</td><td>Open Source</td><td></td><td>Per l'analisi dei dati sul tasso di crescita dal lettore di piastre.</td></tr><tr><td>Falcon Tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Eppendorf&nbsp; Provette</td><td>GeneMate</td><td>C3262-1</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Shake Flasks</td><td>Corning</td><td>4446-250</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti, piastre a fondo piatto</td><td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader)</td><td>BioTek</td><td>H1MG</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy Membrane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>varie aziende</td><td>Vari modelli</td><td></td></tr><tr><td>SC-Ura polvere</td><td>MP Biomedicals 114410622</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>Zymo Research</td><td>F9001-1</td><td></td></tr></tbody></table>

sintesi rapida e screening dei fattori di trascrizione attivati ​​chimicamente con i giornalisti a base di gfp-

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Biologia sintetica mira a progettare e costruire razionalmente circuiti sintetici con proprietà quantitativi desiderati, nonché fornire strumenti che consentono di analizzare la struttura dei circuiti di controllo native. In entrambi i casi, la possibilità di programmare l&#39;espressione genica in maniera rapida e sintonizzabile, senza effetti off bersaglio, può essere utile. Abbiamo costruito ceppi di lievito contenenti il promotore ACT1 monte di una cassetta URA3 seguito dal dominio di legame del ligando del recettore di estrogeno umano e VP16. Trasformando questo ceppo con un prodotto di PCR lineare contenente un dominio di legame al DNA e selezionando contro la presenza di URA3, un fattore di trascrizione artificiale costitutivamente espresso (ATF) può essere generato mediante ricombinazione omologa. ATF ingegnerizzati in questo modo può attivare un gene bersaglio unico in presenza di induttore, eliminando in tal modo sia l&#39;attivazione off-target e condizioni di crescita non fisiologici trovati con Conditi comunemente usatosistemi di espressione genica onal. Viene inoltre fornito un metodo semplice per la costruzione rapida di plasmidi reporter GFP che rispondono specificamente a un fattore di trascrizione nativo o artificiale di interesse.

<html> Figura 5 mostra l&#39;induzione di GFP da Z 3 EV, Z 4 EV, o GEV nel tempo. Nota l&#39;aumento della produzione GFP in risposta alle ATF contenenti domini di legame al DNA nonyeast. Recentemente abbiamo ipotizzato che questo risulta da questi fattori raggiungono singolo gene specificità nel genoma di lievito 1. Induzione GEV sola porta all&#39;attivazione / repressione di centinaia di geni, mentre solo 3 EV Z e Z 4 EV attivare l&#39;espressione di un gene bersaglio posto a valle di un promotore sintetico contenente opportuni siti di legame (5&#39;-GCGTGGGCG-3 &#39;e 5&#39;- GCGGCGGAGGAG-3 &#39;, rispettivamente) 1. Figura 7 illustra la stretta regolazione del sistema (risultati induttore in alcun rilevabile GFP) e che tutte le cellule vengono indotti in risposta ad induttore La capacità di Z 3 EV per indurre GFP attraverso una gamma di concentrazioni di β-estradiolo è mostrata in Figura 8. <html> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" /> Figura 1. Fattori trascrizionali artificiali interagiscono con Hsp90 in assenza di β-estradiolo. Quando β-estradiolo si lega al ATF, Hsp90 dissocia, permettendo la ATF per entrare nel nucleo e attivare l&#39;espressione dal plasmide reporter. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" /> Figura 2. Schema di protocollo per i ceppi di ingegneria che contengono fattori di trascrizione artificiali e costruzione / collaudo reporter GFP affini. load/51153/51153fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. La sequenza ACT1pr-URA3-EV nel ceppo yMN15 al locus LEU2. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" /> Figura 4. Progettazione di primer PCR per amplificare un dominio di legame al DNA di interesse con ulteriori omologia di sequenza per generare una nuova proteina di fusione quando trasformato con successo in yMN15. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" /> Figura 5. Induzione GFP da tre diverse coppie ATF-promotore in risposta a 1 mM β-estradiolo. &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" /> Figura 6. Uno script MATLAB per il flusso di elaborazione citometria di dati. Questo script è stato adattato da <a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" /> Figura 7. Induzione di GFP da Z 3 EV in risposta a 0 μ M β-estradiolo e 1 mM β-estradiolo seguente 18 ore di induzione. Fluorescenza era anche meaassicurata da cellule prive GFP per illustrare la stretta regolazione del sistema EV Z 3. Questa figura è stata generata utilizzando il codice nella Figura 6. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" /> Figura 8. Il rapporto tra la concentrazione di induttore e uscita espressione è classificato con un coefficiente di Hill ~ 1. (A) Distribuzione di espressione GFP in funzione della concentrazione di β-estradiolo. (B) La fluorescenza media delle distribuzioni da (A). I dati erano idonei per la funzione G (D) = G min + (G max-min G) D n / (n + K D n) dove D è la dose β-estradiolo, G e G min max sono minime e GFP valori massimi, resture rispettivamente, n è il coefficiente di Hill, e K è la dose β-estradiolo che produce ½ (G max + G min). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176"><tbody><tr><td> Oligonucleotide Sequence </td><td> Nome </td></tr><tr><td> 5&#39;-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 &#39; </td><td> DBD Verifica Forward </td></tr><tr><td> 5&#39;-tccagagac ttcagggtgct-3 &#39; </td><td> DBD partner di Reverse </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Primer per confermare corretta fusione DBD di interesse al Estrogen Receptor. Il primer forward è omologa promotore EFF1 e l&#39;innesco inverso è omologo al recettore estrogeno. Per DBDS tipici (~ 300 bp), il prodotto di PCR è &lt;1,5 kb. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Oligonucleotide Sequence </td><td> Nome </td></tr><tr><td> 5&#39;-ggccgc ... site abbuffate DBD ... t-3 &#39; </td><td> Top oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctaga ... DNA sito di legame inverso ... gc-3 &#39; </td><td> In basso oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-gcc gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG t-3 &#39; </td><td> Top oligo + 6x zif268 siti di legame </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 &#39; </td><td> In basso oligo + 6x zif268 siti di legame </td></tr></tbody></table> Tabella 2. S truttura di primer per la creazione di dsDNA contenenti siti di legame di interesse. Per creare la Z 3 EV-reattiva promotore, + 6x Zif268 rilegatura sono stati usati gli oligonucleotidi Top oligo + 6x zif268 siti di legame e inferiore oligo.Sequenze per creare le corrette sbalzi di DNA sono in minuscolo. Il sito di legame Zif268 consenso, GCGTGGGCG, viene sottolineato nella oligo superiore. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Importo </td></tr><tr><td> T4 polinucleotide Kinase Buffer </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> T4 polinucleotide chinasi (@ 10.000 unità / ml) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Top oligo (100 micron) </td><td> 1,5 microlitri </td></tr><tr><td> In basso oligo (100 micron) </td><td> 1,5 microlitri </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> 41 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Fosforilare e primer ricottura in un termociclatore con 50 microlitri di reazione descritto sopra. Esistono due passi termociclatore. Passo 1: 37 ° C 30 min (fosforilare), e il passaggio 2: 95 ° C 30 sec (dimettersi 1 ° C ogni 30 sec fino a 4 ° C; Anneal). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Importo </td></tr><tr><td> XbaI </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> NotI-HF </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> DNA plasmidico </td><td> 5 microlitri (1-2 mcg) </td></tr><tr><td> 10x taglio intelligente Buffer </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> 38 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Limitazione digest di plasmide pMN8 con XbaI e NotI. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr height="22" style="height:16.5pt"><td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88"> Reagente </td><td class="xl66" style="width:66pt" width="88"> Importo </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> T4 ligasi Buffer </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> T4 ligasi </td><td> 0.2 microlitri </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> Backbone @ 10 ng / ml </td><td> 1 ml </td></tr><tr height="106" style="height:79.5pt"><td> Legatura Sequenze @ 5x molare concentrazione / ml </td><td> 1 ml </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> Acqua </td><td> 15.8 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 5. Legare i siti di legame nel plasmide DNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Primer </td><td> Descrizione </td></tr><tr><td> ~ 40 bp a monte della ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Forward primer per amplificare KanMX-Promoter </td></tr><tr><td> 5&#39;-reverse complemento (ATG + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Reverse primer per amplificare KanMX-Promoter </td></tr><tr><td> 5&#39;-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Primer avanti per rendere promotore GCN4 swap. </td></tr><tr><td> 5&#39;-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Primer reverse per fare promotore GCN4 swap. </td></tr></tbody></table> Tabella 6. PCR amplifica KanMX-Promoter per fare allele titratible.

Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per la rapida costruzione di fattori di trascrizione artificiali (ATF) con i reporter GFP cognate e la quantificazione della capacità ATF di stimolare l&#39;espressione della GFP mediante citometria a flusso.

Sintesi rapida e screening dei fattori di trascrizione attivati ​​chimicamente con i giornalisti a base di GFP-

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare, testare e validare fattori di trascrizione artificiali codificati geneticamente e inducibili, o ATF, con specificità desiderata. Questo viene ottenuto innanzitutto creando l'ATF mediante una semplice trasformazione del lievito in cui l'inclusione di un prodotto PCR relativo a un dominio di legame al DNA determina una fusione in frame con un recettore umano per gli estrogeni e VP16. Il secondo passaggio della procedura consiste nel creare un plasmide reporter GFP per l'ATF sostituendo i siti di legame nel plasmide PMN otto con sequenze bersaglio del fattore di trascrizione.Il terzo passaggio della procedura consiste nel saggio della capacità degli ATF di attivare il reporter GFP e nella valutazione del loro effetto sulla fisiologia del lievito misurando il tasso di crescita. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'utilizzo di un fattore di trascrizione validato per esprimere in modo condizionale un bersaglio genomico nativo. In definitiva, qualsiasi gene bersaglio di interesse può essere reso condizionatamente attivo.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'induzione mediata da galattosio dell'espressione genica, è che l'induzione selettiva può essere ottenuta in diverse condizioni nutrizionali e fisiologiche senza effetti pleiotropici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia del lievito attraverso l'introduzione rapida e reversibile di prodotti genici desiderati, permettendo lo studio sia dell'acquisizione che della perdita di funzione. Per iniziare, amplificare mediante PCR il dominio di legame al DNA o DVD di interesse utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà.Trasformare più di un microgrammo del prodotto PCR purificato in lievito utilizzando il metodo dell'acetato di litio. Dopo la trasformazione, centrifugare le cellule alla velocità massima per 15 secondi in una microcentrifuga, rimuovere la miscela di trasformazione e risospendere le cellule in circa 200 microlitri di acqua sterile prima di seminare su estratto di lievito. Il giorno successivo, effettuare una piastra di replica da YPD (estratto di lievito, peptone e destrosio) su cinque piastre contenenti acido cinque-fluoro-orotico.Dopo una crescita di due-quattro giorni, ripiantare almeno cinque-dieci colonie su YPD. Successivamente, eseguire una PCR su colonia utilizzando i primer indicati nel protocollo del testo e sequenziare per verificare l'inclusione. Diluire gli oligonucleotidi della regione di legame desiderata a concentrazioni equimolari.Fosforilare la regione di legame utilizzando la polinucleotide chinasi T4, quindi utilizzare un neotermociclere secondo le condizioni di reazione indicate nel protocollo. Successivamente, digerire circa uno-due microgrammi di PMN8 con NotI HF e XbaI per un'ora a 37 gradi Celsius in gel.Separare la banda del plasmide e diluire il plasmide purificato a 10 nanogrammi per microlitro. Quindi, diluire il sito di legame fosfato a doppio filamento a una concentrazione molare pari a cinque volte quella del plasmide per microlitro. Utilizzando la DNA ligasi T4, legare i siti di legame al plasmide digerito a temperatura ambiente per 30 minuti.Eseguire la trasformazione aggiungendo metà della reazione di ligazione a 50 microlitri di cellule di EIA coli chimicamente competenti, seguendo la procedura indicata nel protocollo testuale. Dopo il recupero delle cellule, aggiungere da 100 a 200 microlitri di cellule per piastra luria berti o lb più ampicillina, e incubare per tutta la notte. Il giorno successivo coltivare l’e. coli in brodo lb più ampicillina e isolare il DNA plasmidico come descritto nel protocollo testuale.Quindi, eseguire il sequenziamento per verificare il nuovo plasmide reporter proveniente dalle colonie di ligazione. Infine, trasformare il nuovo plasmide reporter nel ceppo E contenente il fattore di trascrizione (A TF) mediante trasformazione con acetato di litio. Per iniziare, coltivare un ceppo contenente il fattore di trascrizione più il reporter in modo da ottenere una coltura notturna in cinque millilitri di mezzo sintetico completo privo di uracile.Procurarsi 9 fiale da 250 millilitri e aggiungere 25 millilitri di SC privo di URA a ciascuna. Preparare quindi sette delle fiale con diverse diluizioni di beta-estradiolo, come indicato nel protocollo testuale, mediante diluizioni seriali decrescenti di una soluzione madre di beta-estradiolo 25 millimolare; aggiungere 125 microlitri delle colture notturne a queste sette fiale. Per le due fiale rimanenti, inoculare una con un ceppo produttore costitutivo di GFP e una con un ceppo privo di GFP. Queste sono necessarie per la calibrazione del citofluorimetro.Agitare il matraccio a 200 giri/min e 30 gradi Celsius per 12-18 ore. Successivamente, prelevare 500 microlitri di ciascuna coltura e centrifugare in provette einor separate da 1,7 millilitri. Dopo l'aspirazione del soprannatante, lavare una volta le cellule pellettizzate con buffer per citometria a flusso, quindi risospendere le cellule in un millilitro dello stesso buffer.Successivamente, aggiungere un millilitro di buffer per citometria a flusso in nove falcon da due. Aggiungere le cellule risospese nei tubi falcon contenenti il buffer, fino a un volume finale pari a due millilitri. Infine, eseguire la citometria a flusso.Utilizzare la diffusione anteriore e la diffusione laterale per identificare le cellule di lievito. Impostare la portata a circa 3000 cellule al secondo. Misurare la GFP attraverso il canale 50 e procedere come descritto nel protocollo testuale: partendo da ceppi congelati, seminare su YPD sia una ceppo contenente A TF sia un ceppo privo di A TF. Dopo due giorni di crescita, inoculare tubi di coltura separati contenenti cinque millilitri di terreno liquido YPD e coltivare ogni ceppo per tutta la notte a 30 gradi Celsius.Eseguire diluizioni seriali di un fattore dieci di una soluzione madre di beta-estradiolo 0,25 millimolare fino a un fattore 10.000 in etanolo al 100%. Aggiungere 40 microlitri di ciascuna coltura notturna a 10 millilitri di terreno liquido YPD. Per ciascun ceppo, aggiungere 96 microlitri delle cellule diluite in 18 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.Quindi aggiungere quattro microlitri di beta-estradiolo alle cellule. Un punto essenziale è assicurarsi che ogni pozzetto contenga la stessa quantità totale di etanolo. Eseguire un'analisi in triplicato utilizzando tre pozzetti per ceppo, contenenti esclusivamente etanolo.I controlli coprono la piastra a 96 pozzetti con una membrana permeabile ai gas. Monitorare la crescita a una densità ottica di 600 nanometri mediante un lettore di piastre. Quantificare i tassi di crescita utilizzando diversi metodi, ad esempio individuando la pendenza massima.Dopo aver preparato il plasmide come indicato nel protocollo testuale PCR, amplificare il cassetto del promotore can MX. Trasformare il prodotto PCR in una ceppa esprimente A TF utilizzando il metodo di acetato di litio, piastrare le cellule trasformate su YPD e effettuare un replica plating su YPD più antibiotico G418 il giorno successivo. Infine, confermare l'inserimento corretto del promotore utilizzando un primer forward e un primer reverse interno al gene il cui promotore è stato sostituito.Il prodotto finale della PCR è di circa 1,2 KB. Qui viene mostrata l'induzione di GFP mediante tre diversi promotori di fattori di trascrizione: Z4 EVZ, 3EV o GEV, nel tempo in risposta a un micromolare di beta-estradiolo. Si noti l'aumento della produzione di GFP in risposta ai fattori di trascrizione contenenti domini di legame al DNA non derivati dal lievito. Ciò potrebbe dipendere dalla capacità di questi fattori di raggiungere una specificità per un singolo gene nel genoma del lievito.L'induzione da sola da parte di GEV porta all'attivazione o alla repressione di centinaia di geni, mentre Z three EV e Z four EV attivano soltanto l'espressione di un gene bersaglio posizionato a valle di un promotore sintetico contenente siti di legame appropriati. Qui viene mostrata l'induzione di GFP da parte di Z three EV in risposta a zero nanomolar di beta-estradiolo e a un micromolare di beta-estradiolo dopo 18 ore di induzione. La fluorescenza è stata misurata anche in cellule prive di GFP per illustrare il rigoroso controllo del sistema Z three EV. La capacità di Z three EV di indurre GFP in una serie di concentrazioni di beta-estradiolo è mostrata qui.L'intensità media della fluorescenza delle distribuzioni rivela che la relazione tra concentrazione dell'induttore e livello di espressione è graduale, con un coefficiente di Hill di circa uno, indicativo di un legame indipendente di Z tre EV. Seguendo questo procedimento, altri metodi come i microarray per l'espressione genica potrebbero essere eseguiti al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio come la modulazione dell'espressione di un singolo gene influisca sui profili genomici di espressione genica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come progettare, testare e validare l'efficacia di fattori di trascrizione artificiali. Questi fattori di trascrizione artificiali controllano in modo condizionale l'espressione di geni posizionati a valle di specifiche sequenze target di DNA.

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