Iniezione sistemica di cellule staminali neurali / progenitrici nei topi con EAE cronica

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire cellule progenitrici staminali neurali al SNC tramite iniezione endovenosa in topi affetti da encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello di malattia che imita la sclerosi multipla. Ciò si ottiene derivando prima le cellule progenitrici staminali neurali, o NPC, dalla zona subventricolare del cervello da topi adulti. Il secondo passo consiste nell'etichettare geneticamente le NPC con la tecnologia dei vettori virali per l'identificazione e il tracciamento delle cellule in vivo.

Successivamente, le neurosfere proliferanti vengono dissociate in una singola sospensione cellulare, risospese alla densità desiderata e iniettate nella vena caudale dei topi EAE al culmine della malattia. Infine, vengono eseguite patologie post-mortem di organi e tessuti e immunoistochimica per identificare e caratterizzare la distribuzione e l'integrazione della sopravvivenza delle cellule staminali iniettate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo minimamente invasivo, sicuro ed efficace per trapiantare cellule staminali e progenitrici nel sistema nervoso inflamm.

Questo metodo aiuta a rispondere a tre domande chiave relative alla sicurezza e all'efficacia delle cellule staminali iniettate per via sistemica in modelli di malattie infiammatorie del sistema nervoso. La dimostrazione visiva di questo metodo è utile soprattutto per i giovani scienziati in quanto aiuta nella comprensione delle fasi sperimentali critiche dall'isolamento delle cellule staminali cerebrali alla preparazione per l'iniezione sistemica in un modello murino per la sclerosi multipla. Il primo passo è quello di raccogliere tutte le soluzioni necessarie per la dissezione. Utilizzando un'adeguata tecnica sterile.

Posiziona un cervello appena isolato su una matrice di affettamento del cervello. Utilizzare due lamette da barba per produrre sezioni coronali, a due millimetri dal polo anteriore del cervello, escluse le tracce ottiche e tre millimetri posteriormente al taglio precedente. Posiziona le fette di cervello su una capsula di Petri pulita e lavora al microscopio da dissezione per isolare il tessuto della zona subventricolare.

Dopo aver tritato il fazzoletto, aggiungerlo a 30 millilitri di soluzione digestiva precedentemente preparata e filtrata. Agitare delicatamente e incubare per 30 minuti agitando ogni 15 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di crescita completa.

Terreno o CGM mediante pipettaggio. Prima con una P 1000 e poi con una pipetta P 200. Una volta raggiunta una sospensione a singola cellula, portarla fino a cinque millilitri con CGM e trasferirla in un nuovo pallone.

Metti le cellule in un incubatore e lascia che le neurosfere si formino per cinque-sette giorni. Quando è pronta, raccogliere la sospensione in una provetta da 15 millilitri e centrifugarla. Rimuovere il surnatante e risospendere il palato in 200 microlitri di CGM.

Dissociare meccanicamente le neurosfere facendole passare attraverso un puntale di pipetta P 200 da 100 a 150 volte. Porta la sospensione fino a un millilitro con CGM. Quindi, diluire accuratamente la sospensione.

Mescolare il volume appropriato con un colorante vitale e riempire un emocitometro per determinare la conta cellulare. Risospendere le cellule nella concentrazione corretta e trasferirle in un nuovo pallone. Ripetere questi passaggi ogni quattro o cinque giorni per aiutare l'identificazione delle cellule trapiantate in vivo.

Le NPC vengono trasdotte con vettori virali che codificano per i geni reporter 72 ore dopo la trasduzione delle NPC. L'espressione dei geni reporter fluorescenti è verificabile mediante immunofluorescenza o citometria a flusso. Quando è pronto, raccogliere le neurosfere che esprimono GFP mediante centrifugazione e rimuovere il surnatante.

Successivamente, aggiungere 200 microlitri di soluzione di dissociazione aggregata cellulare e incubare per 10 minuti. Recuperare le cellule e risospenderle delicatamente per ottenere una sospensione a cellula singola. Facendo attenzione ad evitare bolle d'aria.

Dopo aver contato e diluito le cellule, mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino al momento dell'uso. Una volta che le neurosfere sono pronte, recupera i topi che sono stati precedentemente preparati per fungere da modello murino per il SNC. Il trattamento del danno dovrebbe avvenire al culmine dell'espressione della malattia.

Inizia mettendo i topi in una scatola riscaldante per circa 10 minuti per consentire alla vena della coda di dilatarsi. Quando sei pronto, trasferisci un mouse dalla scatola di riscaldamento a un sistema di ritenuta per mouse. Chiudere il sistema di ritenuta per limitare i movimenti e isolare la coda.

Sterilizzare l'area di iniezione sulla coda con una soluzione topica appropriata. Riempi una siringa da insulina da un millilitro con 150 microlitri di sospensione cellulare e assicurati di rimuovere tutte le bolle. Localizzare la vena sulla superficie dorsale della coda e posizionare l'ago parallelamente alla vena nella parte medio-inferiore della coda.

Qui la vena è più vicina alla superficie della pelle. Facilitando così la procedura. Inserire delicatamente l'ago nella vena assicurandosi della sua corretta posizione prelevando alcuni microlitri di sangue.

Quindi iniettare lentamente la soluzione nella vena caudale Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago e applicare pressione per alcuni secondi per rallentare l'emorragia. Metti il mouse in una gabbia nuova e monitoralo fino a quando non si riprende. Ripetere la stessa procedura per tutti i topi in punti temporali sperimentali predeterminati.

I campioni vengono raccolti da animali trattati e di controllo e analizzati per determinare l'infiltrazione e l'integrazione di NPC nel SNC e in altri tessuti durante la proliferazione come neurosfere Le NPC esprimono marcatori di attività mitotica come il fosfoisone H tre mostrato in verde e di cellule neurali indifferenziate come il nido mostrato in rosso quando viene placcato in condizioni di differenziazione appropriate, Le NPC esprimono marcatori tipici delle tre linee neurali come il marcatore dell'astroglia, GFAP, il marcatore neuronale, la proteina associata al micro tubulare due e i marcatori gliali oligo dyl O quattro e i nuclei della proteina basica della mielina sono controcolorati con MPC indifferenziate dpi che devono essere terapeuticamente efficaci dopo il trapianto devono esprimere molecole di adesione alla superficie cellulare che includono CD 44 e la subunità alfa quattro dell'antigene molto tardivo quattro. Questi esempi mostrano che le NPC trasdotte esprimono GFP, sia come neurosfere proliferanti che quando si differenziano in vitro dopo la sospensione del fattore di crescita. Le NPC singeniche iniettate per via sistemica nei topi EAE si trovano quasi esclusivamente nelle aree perivascolari di danno al SNC indicato dalle frecce sia nel cervello che nel midollo spinale fino a 45 giorni dopo il trapianto.

Un passaggio chiave di questa procedura è la dissociazione cellulare. Infatti, la preparazione della sospensione a singola cellula è fondamentale per evitare pinze o aggregati che possono portare all'occlusione del vaso dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in medicina rigenerativa che stavano esplorando protocolli minimamente invasivi per la consegna efficiente di cellule staminali non periodiche nel cervello di piccoli animali da laboratorio e, in prospettiva, di esseri umani affetti da malattie neurologiche infiammatorie.

Dopo aver visto questo video, si spera che tu abbia una chiara comprensione dei problemi relativi all'isolamento, alla preparazione e all'iniezione sistemica di posizioni specifiche del tessuto negli animali da laboratorio con malattie cerebrali.