Name: Iniezione sistemica di cellule staminali neurali / progenitrici nei topi con EAE cronica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-15T18:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Impara il metodo di iniezione endovenosa di cellule staminali neurali nei topi con encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello di sclerosi multipla. Questo protocollo minimamente invasivo consente il trapianto sicuro e efficace nel sistema nervoso centrale.

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Gli autori ringraziano Jayden Smith per la revisione critica e la modifica prova del manoscritto. Questo lavoro ha ricevuto il sostegno della National Multiple Sclerosis Society (NMSS, borse di studio parziali RG-4001-A1), l&#39;Associazione Italiana Sclerosi Multipla (AISM, concedere 2010/R/31), il Ministero della Salute italiano (GR08-7), Wings for Life, la Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPr), il Consiglio europeo della ricerca (CER) nell&#39;ambito dell&#39;accordo ERC-2010-StG di Grant no 260.511-SEM_SEM e 7 ° Programma quadro della Comunità europea (CE) (FP7/2007-2013) ai sensi della convenzione di sovvenzione n * deg; 280.772 - Ione.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Terapie basate sulle cellule staminali somatiche stanno emergendo come una delle strategie più promettenti per il trattamento di malattie croniche infiammatorie del sistema nervoso centrale come MS2 11. Mentre i meccanismi che sostengono i loro effetti terapeutici devono ancora essere completamente chiarito, l&#39;impatto significativo della NPC trapianto in diversi modelli sperimentali di malattie neurodegenerative ha dato origine alla credenza un po &#39;provocatorio che le cellule staminali potrebbero pres...

Forte evidenza è sorta da studi in vivo che attestano l&#39;efficacia terapeutica del trapianto di cellule somatiche neurali staminali / precursori (NPC) in modelli animali di disturbi al SNC 1-8. Tuttavia, una serie di questioni relative alla fornitura di cellule staminali nel ospitante richiede un attento esame prima che questi risultati sperimentali possono essere tradotti in applicazioni cliniche. Un ostacolo particolarmente significativo verso lo sviluppo di (ematopoietiche) terapie con cellule staminali rigeneranti per multifocali, malattie infiammatorie cerebrali croniche è l&#39;identificazione del percorso ideale di iniezione NPC. Una solida comprensione della fisiopatologia della malattia mirata (focale o multifocale; degenerativa infiammatoria o primaria primaria), ed un&#39;analisi prudente di questioni di fattibilità e di rischio associati alle tecniche di spedizione sono a individuare il protocollo ottimale per la consegna delle cellule staminali. Mentre la focale ( <em&gt; Ad es. nel parenchima sistema nervoso) trapianto di cellule staminali è un approccio logico per il trattamento di malattie del SNC caratterizzate da aree spazialmente confinate di danno (ad es Parkinson e la malattia di Huntington, cervello e midollo spinale lesioni traumatiche, e ictus), lo stesso approccio può rivelarsi che sia praticamente non realizzabile in condizioni come la sclerosi multipla, in cui un multifocale, cronica, e spazialmente diffusi danni CNS accumula nel tempo. In quest&#39;ultimo caso, il targeting iniezioni di cellule focali di singole lesioni è inoltre ostacolato dalla limitata capacità di NPC trapiantate per migrare su lunghe distanze all&#39;interno del parenchima nervoso centrale, inducendo quindi l&#39;individuazione di metodi più idonei alternativi di CNS targeting con trapianti NPC meno invasive . Grande promessa emerso dalle osservazioni che NPC colpiscono un tumore intracranico (ad es. Glioma) nei topi quando iniettato per via endovenosa al di fuori del CNS9. Seguendo questa seminaleevidenza in vivo di cellule staminali pathotrophism 10, numerosi dati sono stati accumulati relativi alla fattibilità e l&#39;efficacia terapeutica del trapianto sistemico di NPC in animali da laboratorio con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello di danno infiammatorio del SNC, sia via endovenosa (iv) o intracerebroventricolare (ICV). NPC iniezione 1,2,5,6,8 .. Abbiamo prima dimostrato che questo dipende dalla capacità di NPC trapiantate per indirizzare e inserire il SNC infiammato, e di impegnarsi in seguito intercellulare multipla programmi di comunicazione all&#39;interno di microambienti particolari in vivo 11. Al fine di indirizzare specificamente il CNS, NPC vengono consegnati direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF) circolazione mediante iniezione ICV, o nel flusso sanguigno tramite iniezione endovenosa. Una volta immettendo nel flusso sanguigno o CSF, NPC trapiantate interagiscono attivamente conil cervello di sangue (BBB) ​​o di sangue nel liquido cerebrospinale (BCSFB) le barriere e inserire il parenchima del SNC. Questa interazione tra l&#39;innesto NPC e il BBB (o BCSFB) è regolata da specifica serie di molecole di adesione cellulare di superficie NPC (CAM) e facilitato dalla espressione di elevati livelli di CAM contro-ligandi sulla attivati ​​endoteliali / cellule ependimali 12-14. Esempi di queste camme includono il recettore per ialuronato, CD44, e la molecola di adesione intercellulare (ICAM) -1 ligando molto tardi antigene (VLA) -4 5,15,16 (che, nei leucociti, sono responsabili dell&#39;interazione con ependimali attivato e cellule endoteliali), e di un linfocita misura Function-associated Antigen molto più basso (LFA) -1 e P-selectina ligando glicoproteina (PSGL) -1. NPC esprimono anche una vasta gamma di recettori per chemochine, tra cui CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 e CXCR4 (ma non esprimono CCR3 e CCR7), che sono funzionalmente attivi, sia in vitro che in vivo 5,16. Così, systemicaNPC lly iniettati utilizzano queste camme, insieme a G-proteina recettore accoppiato (GPCR), ad accumularsi a livello del SNC infiammato. Al contrario, PNG iniettato per via sistemica in topi sani non entrare SNC via vascolare o cerebrospinale aeree spazio fluido 2. CNS infiammazione, o endoteliale / attivazione delle cellule ependimali seguente citochine sistemica o lypopolisaccharide (LPS) iniezione come modello di encefalite indotta chimicamente, è pertanto necessario per l&#39;accumulo di NPC sistematicamente iniettate nel cervello e nel midollo spinale 2. Così, il targeting successo del SNC con terapie sistemiche NPC dipende dalla identificazione di una finestra specifica malattia di opportunità (woo) in cui il cervello e del midollo spinale ambiente favoriscono l&#39;accumulo e la migrazione transendoteliale di NPC. Tali condizioni generalmente sorgono nel contesto di infiammazione acuta e subacuta 17. Dopo aver inserito il sistema nervoso centrale, trapiantato NPC indifferenziatihanno dimostrato di migliorare le caratteristiche clinico-patologiche di topi e anche più grandi, primati non umani con EAE. Questo è stato descritto a dipendere da minimal sostituzione cella 2 e notevole secrezione di fattori immunitari paracrini regolamentari e neuroprotettivi all&#39;interno perivascolare CNS 2,5,6,18 vs non-SNC zone infiammate 19,20 (ad esempio linfonodi) in risposta alla segnalazione di cellule infiammatorie suscitato infiltrandosi cellule immunitarie 5. Qui descriviamo gli aspetti chiave metodologici della iniezione sistemica di NPC somatiche in un modello murino di EAE cronica. Più in particolare, si definiscono i protocolli che abbiamo stabilito a (i) Derive, espandere e prepararsi per trapianto NPC somatici dalla zona subventricolare (SVZ) di adulti C57BL / 6 topi; (Ii) indurre EAE cronica in questi topi e (iii) effettuare terapeuticamente efficace sistemica (iv o ICV) trapianto NPC itopi nto EAE.

<table><tbody><tr><td>Coltura cellulare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma</td><td>E2888</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>30H11965</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0700/50</td><td></td></tr><tr><td>Mouse NeuroCult medium basale</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05700</td><td></td></tr><tr><td>Integratori per la proliferazione NeuroCult</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05701</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita di base dei fibroblasti</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-1000</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>1514012</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (soluzione di rivestimento)</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult&reg; Kit di differenziazione (topo)</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>05704</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>eBioscience</td><td>00-4666-56</td><td></td></tr><tr><td>PBS di Dulbecco (DPBS) (10x) senza Ca e Mg</td><td>PAA Laboratories</td><td>H15-011</td><td></td></tr><tr><td>Myco trace</td><td>PAA Laboratories</td><td>Q052-020</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td> Immunofluorescenza</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>PAA Laboratories</td><td>B11-035</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil etere</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti Nestina</td><td>Abcam</td><td>ab11306</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti GFAP</td><td>DAKO</td><td>203344</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti Istone H3 (fosfo S10)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab14955</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti MAP-2</td><td>Abcam</td><td>ab32454</td><td></td></tr><tr><td>Ratto anti MBP</td><td>AbD SEROTEC</td><td>MCA409S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-O4, clone 81 | MAB345</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di montaggio</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>EAE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freund's Adjuvant Incomplete</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>DIFCO</td><td>H37Ra</td><td></td></tr><tr><td>MOG(35&ndash; 55)&nbsp;</td>Elenco della tossina della pertosse <td>Espikem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratori</td> biologici <td></td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iris forbice dritta</td><td>Strumenti per le scienze Fine 14060-09</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze smussate/piegate</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Affettatrice per cervelli</td><td>Strumenti Zivic</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgiche</td><td>Swann-Morton</td><td>324</td><td></td></tr><tr><td>P200, P1000 pipette Ketamina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Vetalar)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>01LC0030</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (Rompun)</td><td>Bayer</td><td>32371</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico</td><td>KOPF</td><td>Modello 900</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7762-04</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr></tbody></table>

iniezione sistemica di cellule staminali neurali / progenitrici nei topi con eae cronica

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Cellule staminali / precursori neurali (NPC) sono una fonte di cellule staminali promettente per gli approcci di trapianto finalizzate alla riparazione del cervello o il ripristino in neurologia rigenerativa. Questa direttiva è nata dalla vasta evidenza che la riparazione del cervello è ottenuta dopo trapianto NPC focale o sistemica in diversi modelli preclinici di malattie neurologiche. Questi dati sperimentali hanno identificato il percorso di consegna cellula come uno dei principali ostacoli di terapie con cellule staminali rigeneranti per le malattie cerebrali che richiede una valutazione urgente. Intraparenchimale trapianto di cellule staminali rappresenta un approccio logico per quelle patologie caratterizzate da isolate e accessibili lesioni cerebrali, quali lesioni del midollo spinale e la malattia di Parkinson. Purtroppo, questo principio è poco applicabile a condizioni caratterizzate da una natura multifocale, infiammatoria e diffusi (sia nel tempo e nello spazio), tra cui la sclerosi multipla (SM). Come tale, il cervello targeting systconsegna NPC emic è diventato un protocollo bassa invasività e terapeuticamente efficace per fornire cellule al cervello e il midollo spinale di roditori e primati non umani affetti da danni infiammatoria cronica sperimentale del sistema nervoso centrale (CNS). Questo metodo alternativo di consegna delle cellule si basa sul pathotropism NPC, in particolare la loro capacità innata di (i) percepire l&#39;ambiente tramite molecole di adesione cellulare funzionali e citochine e chemochine recettori infiammatori; (Ii) attraversare le perdite barriere anatomiche dopo per via endovenosa (IV). O intracerebroventricolare (ICV) di iniezione; (Iii) accumulare a livello del sito multiplo perivascolare (s), del cervello e del midollo spinale danno infiammatorio; e (iv) esercitare notevole trofico tissutale e effetti regolatori immunitari su diverse cellule bersaglio ospitante in vivo. Qui si descrivono i metodi che abbiamo sviluppato per il iv. e &lt;em&gt; consegna ICV di NPC singeniche in topi con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), come modello di demielinizzazione infiammatoria cronica del sistema nervoso centrale, e prevedono la consegna delle cellule staminali sistemico come una tecnica preziosa per targeting selettiva del cervello infiammato in neurologia rigenerativa.

NPC derivazione e caratterizzazione Dissezioni SVZ vengono eseguite su piscine (n = 5-7 topi / pool) di 6-8 settimane di età C57BL / 6 topi mediante dissociazione meccanica ed enzimatica (Figura 1A). Dopo alcuni giorni di coltura in CGM, neurosfere free-floating iniziano a formarsi (Figure 1A e 1B). Sfere primarie sono raccolti e meccanicamente diversi passaggi ogni 4-5 DIV. Su passaging, numero di cellule vive e morte di accertate e numero di cellule cumulativi ...

Il trapianto di cellule staminali / progenitrici neurali (NPC) detiene grandi promesse in neurologia rigenerativa. La consegna sistematica di NPC è trasformato in efficace protocollo, bassa invasività, e terapeuticamente molto efficace per fornire cellule staminali nel cervello e nel midollo spinale di roditori e primati non umani affetti da danni infiammatoria cronica sperimentale del sistema nervoso centrale.

Iniezione sistemica di cellule staminali neurali / progenitrici nei topi con EAE cronica

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di somministrare cellule progenitrici staminali neurali al sistema nervoso centrale mediante iniezione endovenosa in topi affetti da encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello di malattia che imita la sclerosi multipla. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando le cellule progenitrici staminali neurali, o NPCs, dalla zona subventricolare del cervello di topi adulti. Il secondo passaggio consiste nel marcare geneticamente le NPCs mediante tecnologia di vettori virali per l'identificazione e il tracciamento cellulare in vivo.In seguito, le neurosfere in proliferazione vengono dissociate in una sospensione monocellulare, risospese alla densità desiderata e iniettate nella vena della coda di topi con EAE al culmine della malattia. Infine, vengono eseguite analisi istopatologiche post mortem su organi e tessuti e immunohistochimica per identificare e caratterizzare la distribuzione della sopravvivenza e l'integrazione delle cellule staminali iniettate. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un metodo minimamente invasivo, sicuro ed efficace per trapiantare cellule staminali e progenitrici nel sistema nervoso

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Alcuni ceppi di topi sono in grado di resistere induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) con proteina basica della mielina. Qui descritto è un protocollo di immunizzazione semplice che inverte la mancanza di risposta e induce malattia paralitica in diversi tipiche macchie resistenti EAE del mouse.

Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

Questo video mostra il metodo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) iniettando peptidi derivati dalla mielina con un adiuvante per attivare le cellule T autoreattive, che migrano verso il cervello. La tossina della pertosse viene somministrata per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo a queste cellule T e ad altre cellule immunitarie di entrare nel cervello. Queste cellule immunitarie causano demielinizzazione, portando a una compromissione...

Generazione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

In questo video, un modello murino di sclerosi multipla viene stabilito utilizzando l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Al topo viene iniettata un'emulsione contenente un peptide neuronale e un adiuvante, innescando una risposta immunitaria che attiva le cellule T autoreattive. Questo è seguito da un'iniezione di tossina della pertosse (PTX) per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo alle cellule T autoreattive di infiltrarsi nel cervello. Questa...

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

Descriviamo un metodo per impiantare e mantenere finestre di vetro sopra il midollo spinale esposto di topi adulti per studiare l'encefalomielite autoimmune sperimentale. Queste finestre forniscono un accesso ottico cronico al midollo spinale per il monitoraggio della dinamica cellulare a livello subcellulare in animali vivi utilizzando la microscopia a due fotoni.

Impianto di finestre in vetro del midollo spinale in topi adulti con encefalomielite autoimmune sperimentale

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla. C57BL / 6 topi sono immunizzati con mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), con un conseguente paralisi flaccida ascendente causata da cellule immunitarie autoreattive nel sistema nervoso centrale. Saranno discussi protocolli per l'induzione della malattia e monitoraggio.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in C57BL / 6 Mice

Questo manoscritto descrive i metodi per l'induzione e il punteggio del modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE), insieme alla valutazione della distribuzione delle cellule immunitarie e dei livelli di citochine mRNA nei linfonodi, nella milza, nel sangue e nel midollo spinale utilizzando la citometria a flusso e la PCR quantitativa, rispettivamente, in varie fasi della malattia.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Mostriamo una tecnica per bioluminescenza vivo in vivo e vicino infrarosso per immagini di neurite ottica ed encefalite nel modello di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) per la sclerosi multipla in topi SJL / J.

Bioluminescenza e vicino infrarosso Imaging di neurite ottica e cervello infiammazione nel modello EAE della sclerosi multipla nei topi

Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Ad oggi, i protocolli per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale dallo stesso topo sono una richiesta insoddisfatta. Il protocollo mostra una procedura applicabile nei topi con encefalomielite autoimmune naïve e sperimentale per studiare reti cellulari complesse durante la neuroinfiammazione e contemporaneamente ridurre il numero di topi richiesti.

Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) funge da modello animale di sclerosi multipla. Questo articolo descrive un approccio per valutare l'infiammazione del midollo spinale, la demielinizzazione e la lesione assonale nell'EAE. Inoltre, viene presentato un metodo per quantificare i livelli di luce solubile dei neurofilamenti nel siero dei topi, facilitando la valutazione del danno assonale nei topi vivi.

Punteggio dell'infiammazione del sistema nervoso centrale, della demielinizzazione e della lesione assonale nell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Impara il metodo di iniezione endovenosa di cellule staminali neurali nei topi con encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello di sclerosi multipla. Questo protocollo minimamente invasivo consente il trapianto sicuro e efficace nel sistema nervoso centrale.

Iniezione sistemica di cellule staminali neurali / progenitrici nei topi con EAE cronica

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