Un metodo di precipitazione modificata per isolare urinaria Esosomi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di progettare un metodo modificato di precipitazione degli esosomi che offra un'alternativa rapida, scalabile ed efficace per l'isolamento degli esosomi dalle urine. Ciò si ottiene rimuovendo prima le grandi cellule morte e i detriti cellulari dal campione di urina mediante centrifugazione e la fessura contenente gli esosomi urinari viene trasferita in una nuova provetta. Nella seconda fase, il pellet viene disciolto in una soluzione di isolamento contenente DTT per rimuovere la proteina di caduta del cavallo TAM.

Quindi, dopo un'ulteriore centrifugazione, il surnatante privo di TP viene incubato con il reagente TC exo rapido durante la notte per far precipitare gli esosomi il giorno successivo. I campioni trattati con reagente exo quick TC vengono centrifugati un'ultima volta per ottenere il pellet di esosoma. In definitiva, è possibile eseguire processi a valle come il Western blot e la QPCR in tempo reale sugli esosomi per identificare i biomarcatori di interesse.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'ultra centrificazione, la filtrazione e la precipitazione è che il metodo del braccio non richiede passaggi di certificazione ultra, è facile da eseguire in modo relativamente rapido, pur fornendo una resa di esosomi elevata e relativamente pura per la successiva analisi molecolare prima della raccolta delle urine. A 3,125 millilitri di cocktail di inibitori della proteasi appena preparato in un recipiente sterile vuoto, quindi raccogliere circa 10 millilitri di urina del primo vuoto nel recipiente. Trasferire il campione in provette coniche da 15 millilitri.

Si prega di notare che un campione di urina raccolto nelle 24 ore può essere utilizzato anche per l'isolamento degli esosomi conservandolo a quattro gradi Celsius. Centrifugare le provette per 10 minuti a 17.000 GS e 37 gradi Celsius per rimuovere o separare i detriti cellulari dagli esosomi urinari. Successivamente, facendo attenzione a non disturbare il pellet, trasferire il surnatante in un tubo nuovo e risospendere il pellet in 500 microlitri di soluzione isolante.

Incubare il pellet con DTT a una concentrazione finale di 200 milligrammi per millilitro a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Vortex del campione ogni due minuti. Quindi, quando il pellet è completamente disciolto, aggiungere 500 microlitri di soluzione isolante al campione e far girare immediatamente la sospensione risultante.

Raggruppare il surnatante con il surnatante precedentemente raccolto e risospendere il nuovo pellet in 50 microlitri di soluzione isolante. Per l'analisi della pagina SDS per isolare gli esosomi, incubare prima 11 millilitri del surnatante aggregato con 3,3 millilitri di reagente TC exo rapido a quattro gradi Celsius per almeno 12 ore. Dopo la centrifuga di incubazione, il campione viene trasferito, quindi trasferito il surnatante in una nuova provetta per l'analisi della pagina SDS e il pellet contenente gli esosomi urinari viene utilizzato per estrarre D-N-A-R-N-A o proteine, oppure conservato a meno 80 gradi Celsius.

Utilizzare uno spettrofotometro NanoDrop per determinare le concentrazioni di DNA e RNA di ogni estrazione misurando l'assorbanza a 260 e 280 nanometri con due microlitri di campione qui. Una riproduzione modificata di un'analisi della pagina SDS e il rilevamento di biomarcatori utilizzando l'analisi del sangue occidentale è mostrato nelle corsie con urina non trasformata e sono stati osservati i primi divieti urinari di proteine del pellet corrispondenti a 90-100 kilodalton, indicando la presenza e la rimozione della proteina di caduta del cavallo TAM rispettivamente nelle corsie finali del surnatante e del pellet dell'esosoma. La banda proteica di caduta del cavallo TAM non è stata osservata, indicando una rimozione della proteina di caduta del cavallo TAM nelle fasi precedenti e con conseguente aumento della resa del pellet di esosoma.

In questo esperimento, i biomarcatori Alex e TSG 1 0 1 sono stati rilevati anche quando sono state utilizzate basse quantità di campione, indicando un pellet di esosomi molto puro per l'analisi dei biomarcatori e un'assenza di proteine solubili abbondanti, inclusa la proteina di caduta del cavallo TAM dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della malattia renale cronica per utilizzare esosomi isolati nelle urine per la diagnosi precoce e la diagnosi della nefropatia diabetica.