Un metodo di precipitazione modificata per isolare urinaria Esosomi
16 gennaio 2015
Questo manoscritto descrive un protocollo per isolare gli esosomi dall'urina umana utilizzando una tecnica di precipitazione modificata.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di progettare un metodo modificato di precipitazione degli esosomi che offra un'alternativa rapida, scalabile ed efficace per l'isolamento degli esosomi dalle urine. Ciò si ottiene rimuovendo prima le grandi cellule morte e i detriti cellulari dal campione di urina mediante centrifugazione e la fessura contenente gli esosomi urinari viene trasferita in una nuova provetta. Nella seconda fase, il pellet viene disciolto in una soluzione di isolamento contenente DTT per rimuovere la proteina di caduta del cavallo TAM.
Quindi, dopo un'ulteriore centrifugazione, il surnatante privo di TP viene incubato con il reagente TC exo rapido durante la notte per far precipitare gli esosomi il giorno successivo. I campioni trattati con reagente exo quick TC vengono centrifugati un'ultima volta per ottenere il pellet di esosoma. In definitiva, è possibile eseguire processi a valle come il Western blot e la QPCR in tempo reale sugli esosomi per identificare i biomarcatori di interesse.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'ultra centrificazione, la filtrazione e la precipitazione è che il metodo del braccio non richiede passaggi di certificazione ultra, è facile da eseguire in modo relativamente rapido, pur fornendo una resa di esosomi elevata e relativamente pura per la successiva analisi molecolare prima della raccolta delle urine. A 3,125 millilitri di cocktail di inibitori della proteasi appena preparato in un recipiente sterile vuoto, quindi raccogliere circa 10 millilitri di urina del primo vuoto nel recipiente. Trasferire il campione in provette coniche da 15 millilitri.
Si prega di notare che un campione di urina raccolto nelle 24 ore può essere utilizzato anche per l'isolamento degli esosomi conservandolo a quattro gradi Celsius. Centrifugare le provette per 10 minuti a 17.000 GS e 37 gradi Celsius per rimuovere o separare i detriti cellulari dagli esosomi urinari. Successivamente, facendo attenzione a non disturbare il pellet, trasferire il surnatante in un tubo nuovo e risospendere il pellet in 500 microlitri di soluzione isolante.
Incubare il pellet con DTT a una concentrazione finale di 200 milligrammi per millilitro a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Vortex del campione ogni due minuti. Quindi, quando il pellet è completamente disciolto, aggiungere 500 microlitri di soluzione isolante al campione e far girare immediatamente la sospensione risultante.
Raggruppare il surnatante con il surnatante precedentemente raccolto e risospendere il nuovo pellet in 50 microlitri di soluzione isolante. Per l'analisi della pagina SDS per isolare gli esosomi, incubare prima 11 millilitri del surnatante aggregato con 3,3 millilitri di reagente TC exo rapido a quattro gradi Celsius per almeno 12 ore. Dopo la centrifuga di incubazione, il campione viene trasferito, quindi trasferito il surnatante in una nuova provetta per l'analisi della pagina SDS e il pellet contenente gli esosomi urinari viene utilizzato per estrarre D-N-A-R-N-A o proteine, oppure conservato a meno 80 gradi Celsius.
Utilizzare uno spettrofotometro NanoDrop per determinare le concentrazioni di DNA e RNA di ogni estrazione misurando l'assorbanza a 260 e 280 nanometri con due microlitri di campione qui. Una riproduzione modificata di un'analisi della pagina SDS e il rilevamento di biomarcatori utilizzando l'analisi del sangue occidentale è mostrato nelle corsie con urina non trasformata e sono stati osservati i primi divieti urinari di proteine del pellet corrispondenti a 90-100 kilodalton, indicando la presenza e la rimozione della proteina di caduta del cavallo TAM rispettivamente nelle corsie finali del surnatante e del pellet dell'esosoma. La banda proteica di caduta del cavallo TAM non è stata osservata, indicando una rimozione della proteina di caduta del cavallo TAM nelle fasi precedenti e con conseguente aumento della resa del pellet di esosoma.
In questo esperimento, i biomarcatori Alex e TSG 1 0 1 sono stati rilevati anche quando sono state utilizzate basse quantità di campione, indicando un pellet di esosomi molto puro per l'analisi dei biomarcatori e un'assenza di proteine solubili abbondanti, inclusa la proteina di caduta del cavallo TAM dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della malattia renale cronica per utilizzare esosomi isolati nelle urine per la diagnosi precoce e la diagnosi della nefropatia diabetica.
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Panoramica
Questo manoscritto descrive un protocollo per l'isolamento di esosomi dall'urina umana mediante una tecnica di precipitazione modificata. Il metodo mira a fornire un'alternativa rapida, scalabile ed efficace per l'isolamento degli esosomi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Ricerca sugli esosomi
Sfondo
- Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari coinvolte nella comunicazione intercellulare.
- L'isolamento degli esosomi dall'urina può fornire informazioni su diversi processi biologici.
- I metodi attuali possono essere lunghi e meno efficienti.
- Una tecnica di precipitazione modificata potrebbe migliorare il recupero degli esosomi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido per l'isolamento di esosomi dall'urina.
- Migliorare la scalabilità e l'efficacia dell'estrazione degli esosomi.
- Facilitare applicazioni a valle come l'identificazione di biomarcatori.
Metodi Utilizzati
- Centrifugazione per rimuovere le cellule grandi e i detriti dai campioni di urina.
- Scioglimento del pellet in soluzione di isolamento contenente DTT.
- Incubazione del soprannatante con il reagente ExoQuick TC durante la notte.
- Centrifugazione finale per ottenere il pellet di esosomi.
Risultati principali
- Il metodo modificato isola con successo gli esosomi dall'urina.
- Gli esosomi possono essere utilizzati per analisi successive come il Western blot e la qPCR.
- La rimozione efficiente di contaminanti migliora la purezza degli esosomi isolati.
- Il protocollo è scalabile per campioni di dimensioni maggiori.
Conclusioni
- La tecnica di precipitazione modificata è un metodo valido per l'isolamento degli esosomi.
- Questo approccio può semplificare la ricerca sugli esosomi in vari studi biologici.
- Studi futuri potrebbero esplorare ulteriori applicazioni degli esosomi isolati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento degli esosomi urinari consente la scoperta non invasiva di biomarcatori per le malattie renali, favorendo la diagnosi precoce e la riduzione del rischio meccanicistico nello sviluppo di terapie renali. Il metodo di precipitazione modificato rappresenta un'alternativa scalabile e ad alto rendimento all'ultracentrifugazione, migliorando la riproducibilità e la produttività nei flussi di lavoro di validazione degli obiettivi. Questo approccio aumenta l'affidabilità predittiva nell'identificazione dei biomarcatori riducendo la contaminazione e aumentando la purezza degli esosomi per il profilo molecolare successivo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando esosomi che riflettono il carico specifico per tipo cellulare da segmenti del nefrone.
- Valore operativo: Fornisce un metodo rapido e scalabile per l'isolamento di esosomi senza ultracentrifugazione, riducendo la variabilità tecnica.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nel rilevamento di biomarcatori producendo pellet di esosomi ad alta purezza arricchiti in miRNA e mRNA per l'analisi del profilo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara campioni validati di esosomi per saggi successivi, come il Western blot e la qPCR, al fine di rilevare biomarcatori associati a malattie.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento degli esosomi mediante un flusso di lavoro basato sulla precipitazione, compatibile con l'elaborazione di campioni ad alta produttività.
- Prontezza per il saggio: Genera rese costanti di esosomi adatte all'estrazione di RNA e all'analisi proteica, favorendo lo screening riproducibile di biomarcatori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Favorisce il passaggio dalla scoperta di biomarcatori nell'urina alla validazione preclinica fornendo un carico di esosomi rilevante per la malattia.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Permette di rilevare modifiche nel contenuto degli esosomi in condizioni di disfunzione renale, chiarificando i percorsi fisiopatologici.
- Conferma predittiva: Facilita decisioni di avanzamento corrette per il rischio collegando i biomarcatori degli esosomi a segni precoci di nefropatia diabetica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test delle ipotesi all'identificazione del composto attivo, consentendo l'isolamento non invasivo di biomarcatori che guidano la selezione delle molecole bersaglio e la continuità preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi isolando esosomi che riflettono il carico specifico delle cellule di origine dal tratto urinario.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi e riproducibili sugli esosomi, adatti allo sviluppo di saggi per biomarcatori e allo screening di composti.
- Analisi: Permette la misurazione dei livelli di RNA e proteine associati agli esosomi mediante qPCR e Western blot per l'analisi comparativa tra condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Collega i biomarcatori degli esosomi urinari a modelli preclinici di malattie renali attraverso il rilevamento di carichi pertinenti alla patologia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di isolamento scalabile e standardizzata, applicabile a diversi tipi di campioni di urina e programmi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica grazie all'isolamento puro degli esosomi per il profilo dei biomarcatori.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità eliminando i passaggi di ultracentrifugazione e semplificando il flusso di lavoro.
- Valore strategico: Favorisce decisioni più accurate su prosegui/non prosegui aumentando la fiducia nel rilevamento precoce dei biomarcatori delle malattie renali.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata ai rischi dei candidati terapeutici renali sulla base di dati robusti relativi ai biomarcatori degli esosomi.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche nella biologia degli esosomi e nelle tecniche molecolari come l'estrazione di RNA e la qPCR.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per la centrifugazione, al reagente ExoQuick TC e a strumenti spettrofotometrici per la quantificazione di RNA/DNA.
- Richiede standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire tempi di incubazione, temperature e manipolazione dei reagenti costanti.
- Richiede valutazioni di adattamento quando si applica il metodo a diversi protocolli di raccolta delle urine o condizioni di conservazione.
- I limiti pratici includono la necessità di un'incubazione notturna e una manipolazione accurata per evitare la perdita di esosomi durante i trasferimenti.
