Name: Analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma Profiling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Scopri come analizzare l'inizio della traduzione mRNA in cellule di mammifero sotto stress usando il polisoma profiling con gradienti di saccarosio. Questo metodo supera le tecniche di marcatura metabolica tradizionali.

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PA è un destinatario di una borsa di studio &quot;Pierre Durand&quot; presso la Facoltà di medicina di Laval University. Questo lavoro è stato supportato dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (MOP-CG095386) a RM La colonna di frazionamento polisoma è stato acquisito attraverso una Fondazione canadese per l&#39;innovazione concessione (MOP-GF091050) per RMR M in possesso di un nuovo premio di stipendio investigatore CIHR. Siamo grati a Drs. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di Marco e A. Cammas per consigli utili.

Il protocollo segue le linee guida approvato dal Ethical Review Board di Laval. 1. Preparazione di colture cellulari e Brain manipolazione <ol><li> Cellule di mammiferi e Drosophila <ol><li> Crescere HeLa cellule tumorali del collo dell&#39;utero e le cellule embrionali Schneider Drosophila come raccomandato dalla American Type Culture Collection. Lavora con cellule a un passaggio basso. </li><li> Cellule piastra in modo da raggiungere l&#39;80% di confluenza il giorno dell&#39;esperimento. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare ~ 12 x 10 6 cellule per ogni condizione sperimentale. Prima di effettuare estratti per l&#39;analisi polisoma, stimolare traduzione aggiungendo mezzo fresco completa per almeno 90 min. </li></ol></li><li> Isolamento Cervello: Isolare cervelli di topi di età compresa tra 9 e 16 giorni dopo il parto. Eutanasia coinvolge CO 2 inalazione dopo l&#39;anestesia e dislocazione cervicale. Dopo il sacrificio, isolare l&#39;intero cervello e sia posto it a -80 ° C o trasferire direttamente in PBS 1X per l&#39;uso immediato. </li></ol> 2. Preparazione del gradiente di densità Frazionamento del sistema <ol><li> Lavare il sistema di tubi con 0.1% SDS per 5 min. </li><li> Lavare il sistema di tubi con etanolo al 70% per 5 minuti, poi con RNaseZAP soluzione per 5 minuti prima di lavare con acqua DEPC. </li><li> Pompare aria per asciugare il sistema di tubi dell&#39;apparato. </li></ol> 3. Preparazione dei gradienti di saccarosio <ol><li> Rendere soluzioni di saccarosio del 15% e 55% in 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 1.25 mM MgCl 2, 150 mM NaCl, e 1 mM DTT. </li><li> Generare il 15-55% gradiente di saccarosio lineare utilizzando un Isco Modello 160 gradiente ex, come descritto dalle istruzioni del produttore. Tuttavia, è importante controllare bene la velocità della pompa peristaltica TRIS per evitare la creazione di bolle o turbolenze nei gradienti. Mantenere i gradienti a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Durante il tempo in cui il programma gradiente caffè è in esecuzione, raffreddare ultracentrifuga a 4 ° C. </li></ol> 4. Preparazione di Cell and Brain Estratti mouse <ol><li> Preparazione di estratti cellulari <ol><li> Luogo piastra (s) su cellule di ghiaccio e lavare 3 volte con PBS freddo 1X. </li><li> Celle di raccolta (~ 12 x 10 6) in 1 ml di tampone di lisi (20 mM Tris-HCl a pH 7,4, 1,25 mM MgCl 2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P40, 5 inibitore U / ml RNasi, integrato con completi mini-free EDTA inibitore della proteasi cocktail compresse), trasferirli in una provetta Eppendorf, e mescolare bene passando loro 15x attraverso una siringa 1cc insulina U100 28 G 1/2. Sia il lisato cellulare riposare su ghiaccio per 15 min. </li><li> Mettere alcune gocce di lisato cellulare su un vetrino per valutare lisi cellulare osservando in un microscopio a contrasto di fase usando un obiettivo 10X. Solo i nuclei devono essere visibili e senza membrane cellulari dovrebbero attestare visibili lisi cellulare. Come controllo, osservarele cellule non lisati. </li><li> Chiarire il lisato cellulare mediante centrifugazione a 11.000 xg per 20 min a 4 ° C e mantenere il lisato solubile contenente le poliribosomi. </li></ol></li><li> Preparazione del cervello Estratti mouse <ol><li> Omogeneizzare l&#39;intero cervello isolato (~ 500 mg) da 10 colpi in un omogeneizzatore Dounce ghiacciata con 2 ml di tampone di lisi e chiarire l&#39;omogeneizzato mediante centrifugazione a 11.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Caricare il supernatante risultante su un cuscino di 50% di saccarosio e procedere con sedimentazione per 2 ore a 200.000 xg usando un rotore ultracentrifuga TH-641 a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet traslucido contenente le poliribosomi in 1 ml di tampone di lisi e mescolare bene pipettando su e giù. Lasciare riposare sospensione sul ghiaccio per 30 minuti prima di caricare su gradienti. </li></ol></li></ol> 5. Caricamento dei Estratti sui gradienti di saccarosio e ultracentrifugazione <ol><li> Misurare la concentrazionedi RNA presenti nell&#39;estratto citoplasmatico utilizzando uno spettrofotometro. Caricare con attenzione e lentamente ~ 20 OD 260 unità dell&#39;estratto sul gradiente di saccarosio 15% al 55%. Assicurarsi che ci sia 2-3 mm di spazio disponibile sulla superficie del tubo per evitare traboccante le provette durante la centrifugazione. </li><li> Centrifugare i gradienti utilizzando un ultra-centrifuga per 2 h 30 min a 230.000 xg usando un rotore ultracentrifuga TH-641 a 4 ° C. Quando termina la centrifugazione, rimuovere i tubi e disporli sul ghiaccio con attenzione per non disturbare i gradienti. </li></ol> 6. Frazionamento di estratti citoplasmatici di polisomi Profiling <ol><li> Posizionare gradienti di saccarosio in Automated Densità Frazionamento sistema e procedere con frazionamento automatizzata e raccolta di frazioni (0,5 ml ciascuna), come descritto dal produttore. </li><li> Raccogliere ogni frazione (~ 500 microlitri) in singoli tubi Eppendorf con monitoraggio continuo di assorbanza a 254 nm. In parallel dell&#39;operazione di frazionamento gradiente, il profilo polyribosomal sarà la modifica sulla carta grafico. In alternativa, utilizzare una unità di acquisizione dati collegato al registratore grafico per avere un&#39;acquisizione elettronico del profilo polisoma. </li><li> Al termine di ogni corsa, trasferire eppendorfs raccolti su ghiaccio secco. A questo punto, sia negozio frazioni raccolte a -80 ° C o precipitare direttamente complessi proteina-RNA come segue. </li></ol> 7. Estrazione di proteine ​​e analisi <ol><li> Per ogni frazione raccolta del gradiente di saccarosio, aggiungere 2 volumi di etanolo 100% freddo e lasciate complessi RNA-proteina precipitano a -20 ° C per una notte. </li><li> Centrifugare ogni precipitato RNA-proteina a 11.000 xg per 20 min a 4 ° C e poi lavare con etanolo al 70%. Lavaggio e risospendere il precipitato in tampone campione SDS-PAGE prima di procedere con Western blot utilizzando anticorpi specifici (vedi Figura 2). </li></ol> 8. RNA Estrazione e AANALISI <ol><li> Precipitare complessi RNA-proteina, come nella sezione 7.1. Risospendere ogni precipitato RNA-proteina in tampone di lisi contenente 0,1% SDS. Digerire la componente proteica del precipitato con 2 mg / ml proteinasi K per 30 minuti in un bagno d&#39;acqua a 55 °. </li><li> Estrarre componenti RNA precipitato per aggiunta di 1 volume di &quot;fenolo: cloroformio&quot;, 2 volumi di cloroformio e 0,1 volume di 2 M NaOAc pH 4 e centrifugazione a 10.000 xg a 4 ° C per 20 min. RNA precipitato dalla fase acquosa risultante di ciascun campione per una notte a -20 ° C con l&#39;aggiunta di 1 volume di isopropanolo e 0,2 mg / mL di glicogeno. Spin il precipitato per 1 ora a 10.000 xga 4 ° C. Lavare il pellet di RNA con il 70% di etanolo freddo. </li><li> Risospendere il pellet di RNA in un piccolo volume di acqua RNasi libero. Valutare la quantità e qualità di RNA con uno spettrofotometro. </li></ol>

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<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;analisi del profilo polisoma su gradienti di saccarosio consente la misurazione di inizio della traduzione analizzando la densità di polisomi isolati da cellule o tessuti 9,11-14. Questa tecnica è la migliore (se non l&#39;unico) metodo per misurare inizio della traduzione in vivo. E &#39;utilizzato per monitorare lo stato traduzionale di crescita delle cellule durante il ciclo cellulare 15, e per valutare gli effetti di vari tipi di stress comprese le infezioni virali, ipossia ...

Le cellule eucariotiche incontrano costantemente una serie di condizioni nocive di stress fisiologici e ambientali che richiedono una rapida risposta cellulare adattiva. Risposta allo stress cellulare comporta un preciso equilibrio tra anti-sopravvivenza e pro-sopravvivenza fattori che agiscono. Perturbare questo equilibrio può avere conseguenze irreversibili che portano allo sviluppo di patologie umane come il cancro e le malattie neurodegenerative. Durante la prima fase della risposta allo stress, cellule attivano percorsi pro-sopravvivenza che coinvolgono il controllo coordinato di cambiamenti nell&#39;espressione genica a livello della traduzione dell&#39;mRNA. Traduzione mRNA negli eucarioti è un processo cellulare complesso che coinvolge le interazioni coordinate tra i fattori di inizio della traduzione (EIF), proteine ​​leganti RNA specifico (RBDS) e molecole di RNA 1. Traduzione mRNA è diviso in tre distinte fasi: inizio, allungamento e terminazione. Anche se tutte e tre le fasi sono soggette a regoMeccanismi lamentazione, meccanismi di controllo traslazionale colpiscono soprattutto la fase di inizio della traduzione, che costituisce quindi il fattore limitante della sintesi proteica 2. Inizio della traduzione è un processo altamente ordinato che inizia con la formazione della eIF2a.GTP.Met-tRNA I Met complesso ternario e il suo successivo legame alla subunità 40S ribosoma, che porta alla formazione del complesso di pre-apertura. Il passo successivo è l&#39;assunzione del complesso preinitiation di mRNA, che comporta l&#39;attività dei fattori di inizio della traduzione come eIF4F e eIF3. Il complesso preinitiation 48S così formato sottoposto a specifici cambiamenti conformazionali che consentono tale macchinari per avviare la scansione della regione 5&#39;-non tradotta dell&#39;mRNA fino a quando non riconosce il codone di inizio agosto La maggior parte dei fattori di inizio della traduzione vengono poi rilasciati e 60S subunità sono reclutati per formare un complesso 80S ribosoma competente per la traduzione, unt che proteina punto inizia sintesi (Figura 1). Più di un 80S monosome può essere traducendo lo stesso mRNA in un momento produrre cosiddetti polisomi (o poliribosomi). La densità di polisomi su un mRNA riflette l&#39;inizio, allungamento e tariffe di terminazione e quindi è una misura della traducibilità di un particolare trascrizione. Tuttavia, polisoma profilo viene utilizzato principalmente per valutare i cambiamenti nella traduzione dell&#39;mRNA nella fase di iniziazione. Qui abbiamo usato un inibitore del proteasoma, come inibitore di inizio della traduzione. Il trattamento delle cellule tumorali con questo farmaco induce una risposta allo stress caratterizzato dall&#39;attivazione della chinasi sollecitazione denominato HRI che fosforila il fattore di inizio della traduzione eIF2a 3. La fosforilazione di eIF2a è uno dei maggiori eventi che portano alla inibizione di inizio della traduzione in cellule di mammifero 4.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>HeLa cellule di cancro cervicale</td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider Drosophila cellule embrionali</td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Terreno di coltura e Supplementi</td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SO146-500ml</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologie DMEM</td><td>Life</td><td>11995-073</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scienziato Scienziato</td><td>SH30396-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Soluzioni di saccarosio</td></tr><tr><td>D-saccarosio</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP220-212</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Fisher Scientist</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tampone di lisi</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 9779</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td><td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Tekniscience</td><td>4095-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi (Inibitore della ribonucleasi ricombinante RnaseOUT)</td><td>Tecnologie di vita</td><td>10777-019</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Antiproteasi (complete, mini, senza EDTA)</td><td>Roche</td><td>11.836.170.001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Life technologies</td><td>AM2542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fenolo: cloroformio</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP1754I-400</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientist</td><td>C298-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologie Glycogen</td><td>Life</td><td>10814-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Acros organics</td><td>327270010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Anticorpi</td></tr><tr><td>anti-FMRP anticorpo</td><td>Fournier et al., Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma profiling

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Controllo preciso della traduzione dell&#39;mRNA è fondamentale per l&#39;omeostasi cellula eucariotica, in particolare in risposta allo stress fisiologico e patologico. Alterazioni di questo programma può portare alla crescita di cellule danneggiate, una caratteristica di sviluppo del cancro, o morte cellulare prematura come visto nelle malattie neurodegenerative. Molto di ciò che è noto riguardante la base molecolare per controllo traduzionale è stato ottenuto dall&#39;analisi polisoma utilizzando un sistema di frazionamento gradiente di densità. Questa tecnica si basa sulla ultracentrifugazione di estratti citoplasmatici su un gradiente lineare di saccarosio. Una volta che lo spin è completato, il sistema consente di frazionamento e la quantificazione delle zone centrifugati corrispondenti a diverse popolazioni traduzione ribosomi, risultando così in un profilo polisoma. Cambiamenti nel profilo polisoma sono indicativi di modifiche o difetti di inizio della traduzione che si verificano in risposta a vari tipi di stress. Questa tecnica permette anche di valutare the ruolo di specifiche proteine ​​sulla traduzione iniziazione, e per misurare l&#39;attività traduzionale di specifici mRNA. Qui si descrive il protocollo di eseguire profili polisoma per valutare inizio della traduzione di cellule e tessuti eucariotiche in condizioni di crescita sia normali o di stress.

Come suddetto, polisoma profilo consente l&#39;analisi delle variazioni di inizio della traduzione in condizioni di stress. Figura 1 è una vista semplificata di inizio della traduzione che, come descritto in precedenza è un processo multifasico che coinvolge un insieme ordinato di complessi di inizio della traduzione. In condizioni normali di crescita, complessi di inizio della traduzione sono convertiti in poliribosomi cui il rilevamento da profilo polisoma attestare per un&#39;iniziazione traduzione a...

Qui, descriviamo un metodo per analizzare le modifiche l&#39;apertura di traduzione dell&#39;mRNA di cellule eucariotiche in risposta alle condizioni di stress. Questo metodo si basa sulla separazione velocità su gradienti di saccarosio di traduzione ribosomi da ribosomi non traslanti.

Analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare gli effetti delle condizioni di stress sulla traduzione e sull'inizio della traduzione in cellule e tessuti mammiferi mediante profilazione dei polisomi. Questo viene ottenuto innanzitutto trattando cellule tumorali mammifere con un farmaco antitumorale e quindi preparando estratti cellulari. Il secondo passaggio consiste nella preparazione di gradienti di saccarosio.Successivamente, gli estratti cellulari vengono caricati sui gradienti di saccarosio e sottoposti a ultracentrifugazione per separare le frazioni ribosomiali. Infine, viene eseguita un'analisi mediante western blot utilizzando anticorpi specifici per valutare l'associazione delle proteine testate ai polisomi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto a un metodo esistente come la marcatura metabolica è che consente di valutare l'effetto di condizioni di stress sullo stadio di inizio della traduzione.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della terapia dello stress, ad esempio se e in che modo i farmaci antitumorali influenzano l'inizio della traduzione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro

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Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione di tradurre ribosomi delle cellule eucariotiche. Una volta estratto, i ribosomi sono separati in monosomes e poliribosomi per frazionamento gradiente di saccarosio per consentire diverse popolazioni ribosomiale da analizzare. Come tale, questo metodo è il gold standard per l'esame della regolamentazione della traduzione.

Eucarioti Analisi Profilo Polyribosome

Ribosomi svolgono un ruolo centrale nella sintesi proteica. Polyribosome (polisoma) frazionamento da saccarosio centrifugazione in gradiente di densità permette la determinazione diretta delle efficienze traduzione di mRNA individuali su una scala genome-wide. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per l'analisi biochimica dei ribosomi e fattori polisoma associati come accompagnatori e molecole di segnalazione.

Polisoma Frazionamento e analisi dei mammiferi Translatomes su scala Genome-wide

La capacità delle cellule di adattarsi allo stress è fondamentale per la loro sopravvivenza. La regolazione della traduzione dell'mRNA è una di queste strategie di adattamento, che prevede una rapida regolazione del proteoma. Qui, forniamo un protocollo standardizzato di profilazione dei polisomi per identificare mRNA specifici che vengono tradotti selettivamente in condizioni di stress.

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

Questo protocollo descrive un metodo semplice per estrarre e frazionare i trascritti dai tessuti vegetali sulla base del numero di ribosomi legati. Permette una stima globale dell'attività traduttiva e la determinazione dello stato traduzionale di specifici mRNA.

Un metodo facile per piante polysome Profiling

Regolazione traduzionale svolge un ruolo importante nel controllo dell'abbondanza di proteine. Qui, descriviamo un metodo di alto-rendimento per analisi quantitativa di traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Toeprinting mira a misurare la capacità in vitro di trascritti di RNA per formare complessi di inizio di traduzione con i ribosomi in una varietà di condizioni. Questo protocollo descrive un metodo per toeprinting RNA dei mammiferi e può essere usato per studiare traduzione cap-dipendente sia IRES-driven.

Toeprinting analisi di traduzione Iniziazione formazione complessa su mRNAs mammiferi

L'obiettivo generale di tecnica di profilatura polisoma è analisi di attività traduzionale di singoli mRNA o del trascrittoma mRNA durante la sintesi proteica. Il metodo è importante per gli studi di regolamento di sintesi della proteina, l'attivazione di traduzione e repressione in salute e più malattie umane.

Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

Lo sviluppo del cervello dei mammiferi richiede un adeguato controllo dell'espressione genica a livello di traduzione. Qui descriviamo un sistema di profilazione polisome con una piattaforma di gradiente di saccarosio e frazionamento facile da assemblare per valutare lo stato traslazionale degli mRNA nel cervello in via di sviluppo.

Analisi della traduzione nel cervello del mouse in via di sviluppo utilizzando la profilazione polisome

Presentiamo una tecnica per stabilizzare rapidamente complessi traslazionali (biosintesi proteica) con reticolazione di formaldeide in cellule di lievito vivo e di mammifero. L'approccio consente di sezionare intermedi transitori e interazioni dinamiche RNA:proteina. I complessi reticolati possono essere utilizzati in molteplici applicazioni a valle come nei metodi di profilazione basati sul sequenziamento profondo, nella microscopia e nella spettrometria di massa.

Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Questo protocollo descrive come generare un profilo polisomico senza utilizzare generatori di gradienti automatizzati o sistemi di frazionamento del gradiente.

Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

Il protocollo qui presentato prevede la profilazione polisomiale per isolare il translatoma, gli mRNA associati ai ribosomi, in RNA non polisomiali e polisomiali da Arabidopsis attraverso la centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio. Questo metodo dimostra l'efficienza di traslazione di Arabidopsis stressato dal calore.

Test di efficienza traslazionale utilizzando profili polisomici sotto stress termico

Scopri come analizzare l'inizio della traduzione mRNA in cellule di mammifero sotto stress usando il polisoma profiling con gradienti di saccarosio. Questo metodo supera le tecniche di marcatura metabolica tradizionali.

Analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma Profiling

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