Analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma Profiling

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare gli effetti delle condizioni di stress sulla traduzione, l'inizio delle cellule e dei tessuti dei mammiferi mediante la profilazione dei polisomi. Ciò si ottiene trattando prima le cellule tumorali dei mammiferi con un farmaco antitumorale e poi preparando estratti cellulari. Il secondo passo è fare il saccarosio, i gradienti.

Successivamente, gli estratti cellulari vengono caricati sul saccarosio, sui gradienti e ultra centrifugati per separare le frazioni ribosomiali. Infine, viene eseguita l'analisi western blot utilizzando anticorpi specifici per valutare l'associazione delle proteine testate con il polisoma. Il vantaggio principale di questa tecnica, rispetto a un metodo esistente come la marcatura metabolica, è che ci permette di valutare l'effetto delle condizioni di stress sulla fase di inizio della traduzione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia dello stress, come ad esempio se e come i farmaci antitumorali influenzano l'inizio della traduzione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro perché aiuta a rivelare nuovi percorsi regolatori di inizio della traduzione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione dell'inizio della traduzione nelle colture cellulari, può essere applicato anche ad altri sistemi come i tessuti isolati, inclusi il cervello e i tumori.

Per preparare prima il sistema automatizzato di frazionamento del gradiente di densità, lavare il sistema di tubi dell'apparecchio con 0,1% SDS per cinque minuti. Quindi lavare il sistema di tubi con etanolo al 70% per cinque minuti, seguito dalla soluzione RNA Zap per cinque minuti. E infine, con DEPC, acqua, asciugare il sistema di tubi pompando aria nel sistema.

Successivamente, preparare le soluzioni di saccarosio al 15% e al 55% generano il gradiente lineare di saccarosio dal 15 al 55% utilizzando un modello ISCO con un formatore di gradiente da 60. Seguendo le istruzioni del produttore, è importante controllare attentamente la velocità della pompa peristaltica tris per evitare la creazione di bolle o turbolenze nei gradienti durante il periodo in cui il programma gradient maker è in esecuzione, raffreddare l'ultra centrifuga a quattro gradi Celsius. Mantenere i gradienti a quattro gradi Celsius fino a quando l'uso di questo esperimento utilizza cellule tumorali cervicali elicoidali a basso passaggio precedentemente piastrate per raggiungere l'80% di confluenza.

Il giorno dell'esperimento. È importante effettuare estrazioni da cellule fresche ed evitare la contaminazione dell'RNA durante questa procedura, 90 minuti prima dell'aggiunta del farmaco antitumorale, sostituire il terreno delle cellule con un terreno fresco e completo. Per stimolare la traduzione, riportare le cellule nell'incubatrice.

Aggiungere il farmaco antitumorale direttamente alla coltura cellulare come aggiunta di controllo. Incubare il DMSO per quattro ore a 37 gradi Celsius, il 5% di anidride carbonica dopo quattro ore, posizionare le piastre sul ghiaccio e lavare le cellule tre volte con le cellule di raccolta PBS fredde in un millilitro di tampone di lisi per ottenere i migliori risultati. Utilizzare circa 12 milioni di cellule per ogni condizione sperimentale.

Trasferire le cellule dalle piastre raschiate a una provetta einor e mescolare bene passandole 15 volte attraverso una siringa. Lasciare riposare i lisati cellulari sul ghiaccio per 15 minuti. Successivamente, mettere alcune gocce di lisato cellulare su un vetrino e valutare la lisi cellulare mediante microscopia a contrasto di fase utilizzando un obiettivo 10x.

Una volta verificata la lisi cellulare, chiarificare il lisato cellulare mediante centrifugazione a 11.000 Gs per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il lisato solubile contenente i poliribosomi in una nuova provetta e tenerlo in ghiaccio prima di caricare gli estratti citoplasmatici su gradienti di saccarosio. Misurare attentamente la concentrazione di RNA presente utilizzando uno spettrofotometro e caricare lentamente circa 20 OD due 60 unità di estratto sul gradiente di saccarosio dal 15 al 55%.

Assicurarsi che ci siano due o tre millimetri di spazio disponibile sulla superficie della provetta per evitare che la provetta trabocchi durante la centrifugazione. Caricare i tubi sul rotore. Posizionare il rotore sull'ultra centrifuga e centrifugare i gradienti a 230.000 Gs a quattro gradi Celsius per due ore e 30 minuti.

Al termine della centrifugazione, rimuovere le provette e posizionarle con cura sul ghiaccio senza alterare le pendenze. Per iniziare il frazionamento degli estratti citoplasmatici, posizionare i gradienti di saccarosio su un sistema automatizzato di frazionamento della densità e procedere con il frazionamento automatizzato e la raccolta delle frazioni come descritto dal produttore. Raccogliere ogni frazione di 0,5 millilitri in singoli tubi einor con monitoraggio continuo dell'assorbanza a 250 nanometri in parallelo all'operazione di frazionamento del gradiente, il profilo poli ribosomiale verrà modificato sulla carta del grafico alla fine di ogni corsa.

Trasferire i tubi con le frazioni raccolte sul ghiaccio. Per iniziare questa procedura, aggiungere due volumi di etanolo freddo al 100% a ciascuna frazione raccolta e lasciare che i complessi proteici dell'RNA precipitino a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Per l'estrazione delle proteine, centrifugare ciascun precipitato di proteina di RNA a 11.000 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius dopo il lavaggio con etanolo al 70% e asciugare all'aria e risospendere il precipitato.

Un tampone campione della pagina SDS Prima di procedere con l'analisi del western blot per l'estrazione dell'RNA Resus, sospendere ciascun precipitato proteico di RNA in un tampone di lisi contenente lo 0,1% di SDS digerire un componente proteico del precipitato con due milligrammi per millilitro di proteinasi K per 30 minuti. In un bagno d'acqua al 55% Celsius, aggiungere un volume di cloroformio fenolico, due volumi di cloroformio e 0,1 volumi di due molari di acetato di sodio pH quattro. Lasciate riposare sul ghiaccio per 15 minuti.

Centrifugare a 10.000 GS a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Raccogliere la fase acquosa risultante di ciascun campione di RNA precipitato aggiungendo un volume di isopropanolo e 0,2 microgrammi per microlitro di glicogeno e lasciandolo a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, centrifugare il precipitato a 10.000 Gs a quattro gradi Celsius per un'ora.

Rimuovere il surnatante e lavare il pellet di RNA con etanolo freddo al 70%, risospendere il pellet di RNA in un piccolo volume di RNA. Acqua libera. Valutare la quantità e la qualità dell'RNA utilizzando lo spettrofotometro.

Qui sono mostrati i profili polisomici rappresentativi degli estratti citoplasmatici. Preparato da cellule elicoidali coltivate in condizioni normali o dopo il trattamento con l'inibitore del proteasoma per quattro ore e centrifugato con un gradiente lineare di saccarosio dal 15 al 55% in volume/peso. In ogni profilo sono indicate le posizioni dei ribosomi 40 s, 60 s, dei ribosomi 80 s, dei monos e dei polisomi.

Le frazioni dall'alto verso il basso del gradiente sono mostrate da sinistra a destra, le frazioni sono state raccolte e analizzate mediante Western blot con anticorpi contro la grande proteina ribosomiale L 28, così come la proteina FMRP associata ai polisomi che fungono da controlli per l'integrità dei polisomi in condizioni di crescita normali. I complessi di inizio della traduzione sono convertiti in poliribosomi la cui rilevazione mediante il profilo dei polisomi è più importante per un inizio di traduzione attiva come osservato qui. Il trattamento con l'inibitore del proteasoma riduce i picchi dei polisomi con un concomitante aumento di un DS Monos, indicando un'inibizione dell'inizio della traduzione Durante questa procedura, è importante lavorare in un ambiente privo di r nasi per gestire attentamente i gradienti e controllare la lisi cellulare Seguendo questa procedura.

Altri metodi come il sangue occidentale e il sangue del nord possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come l'associazione di una proteina specifica o l'MNA M con il polisoma è influenzato dal trattamento antitumorale dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della traduzione aria per esplorare l'impatto della regolazione dei fattori di inizio della traduzione nelle malattie umane come il cancro e le malattie neurodegenerative.