Ridotta concentrazione Itraconazolo e Durata hanno successo nel trattamento Batrachochytrium dendrobatidis Infezione in Anfibi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di trattare gli anfibi infettati dal fungo anfibio Kitt, Bera key tridium, dendro, he o BD utilizzando la chemioterapia antifungina al triazolo. Ciò si ottiene coltivando prima le colture di BD e inoculando gli animali con il patogeno fungino. Il secondo passo consiste nel testare gli animali utilizzando l'estrazione del DNA e la QPCR su tamponi cutanei per garantire l'infezione da BD.

Successivamente, gli animali infetti vengono trattati facendo il bagno agli animali con una soluzione di econazolo allo 0,0025% per cinque minuti al giorno per sei giorni. Il passaggio finale consiste nel monitorare lo stato di infezione degli animali trattati eseguendo l'analisi QPCR sugli scambi cutanei per un minimo di quattro settimane dopo il completamento del trattamento per garantire il successo del trattamento dell'animale, questa procedura dimostra che una concentrazione ridotta e un tempo di trattamento più breve dell'antimicotico itraconazolo sono efficaci per il trattamento di animali infetti da bd. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questo regime di trattamento rispetto alla dose di trattamento raccomandata, che è una soluzione di itraconazolo allo 0,01% per 11 giorni, è che una concentrazione ridotta di un quarto della dose raccomandata e un tempo di trattamento ridotto a sei giorni sono ancora efficaci nella cura dell'infezione da BD, ma riducono anche al minimo gli effetti collaterali negativi dell'uso della dose di trattamento raccomandata.

Dopo aver incubato il BD in brodo di tritono come descritto nel protocollo di testo e aver verificato il movimento delle spore Zo, inondare ogni piastra con cinque millilitri di acqua di rubinetto invecchiata e attendere 10 minuti per consentire alle spore ZO di entrare nel terreno. Quindi, versare la sospensione Zo Spor in un contenitore portatile. Stimare la concentrazione di spore ZO con un emocitometro e diluire la miscela a una concentrazione da una volta 10 a sei per tre millilitri con acqua di rubinetto per inoculare un animale come la Latoria vei Alpina mostrata qui.

Tienilo sopra un contenitore da 50 millilitri e versa tre millilitri di miscela di inoculo sul suo sfiato. Quindi posizionare l'animale nel contenitore con il deflusso dall'inoculo. Metti un coperchio sul contenitore e lascia l'animale nel contenitore di inoculazione per 24 ore per garantire l'infezione.

Per prevenire la contaminazione con l'agente patogeno BD. Rimuovere i vecchi guanti e metterli in autoclave prima dello smaltimento. Dopo aver indossato, un nuovo paio di guanti procede all'inoculazione dell'animale successivo.

Dopo 24 ore dall'inoculazione, riportare gli animali nei loro terrari disinfettati individuali per due settimane. Ricordarsi di disinfettare tutti i rifiuti liquidi prima dello smaltimento portando la soluzione al 10% di candeggina dopo due settimane. Testare l'infezione da BD riuscita, tamponando gli animali con un batuffolo di cotone sterile.

Ruotando delicatamente il tampone durante e tra una corsa e l'altra. Tamponare cinque volte sul ventre su ciascun lato, su ciascuna coscia e su ciascuno dei quattro arti per un totale di 45 colpi. Conservare i tamponi in microprovette da 1,5 millilitri a meno 20 gradi Celsius.

Estrarre il DNA genomico dai tamponi utilizzando un kit di isolamento del DNA disponibile in commercio ed eseguire la QPCR come indicato nel protocollo di testo. Preparare tre bagni di trattamento, uno per ciascuno dei tre dosaggi di itraconazolo come descritto nel protocollo di testo. Al prossimo posto, i singoli anfibi sono disinfettati.

Contenitori per lattine da 50 millilitri con 35 millilitri di soluzione di trattamento. Ricordando di cambiare i guanti tra un animale e l'altro, agitare delicatamente il contenitore di tanto in tanto per assicurarsi che gli animali siano completamente coperti per cinque minuti. Dopo cinque minuti, riporta gli animali nella loro area disinfettata.

Ripetere il trattamento di cinque minuti ogni giorno per altri cinque giorni. Testare nuovamente gli animali per l'infezione da BD una settimana dopo la fine del trattamento e una volta alla settimana per quattro settimane per assicurarsi che l'infezione sia scomparsa. Si noti che anche dopo il completamento del trattamento, gli animali devono essere trattati come se fossero ancora a rischio di contaminazione.

Gli animali devono essere tenuti in un'area separata per almeno un mese dopo l'infezione. Se il trattamento non ha successo, deve essere ripetuto. Specie diverse e fasi di vita diverse rispondono in modo diverso all'infezione e ai regimi di trattamento, e quindi il trattamento deve essere sperimentato prima di essere ampiamente implementato.

Poiché BD è un rischio biologico, disinfettare settimanalmente la terria individuale bagnando la terria e i contenitori di trattamento in una soluzione di candeggina al 10%. Fare il bagno per almeno 30 secondi, lavare via la candeggina con due risciacqui e acqua e lasciare asciugare i contenitori per 24 ore prima di riutilizzare la sopravvivenza delle rane. Qui sono mostrati 11 giorni di trattamento BD o sei giorni di trattamento BD.

Le frecce nere indicano l'ultimo giorno di trattamento. Le linee continue indicano la sopravvivenza dei gruppi di controllo. Le linee nere continue sono per gli animali che erano BD positivi ma non hanno ricevuto il trattamento BD.

E le linee grigie continue sono per gli animali che erano BD negativi e non hanno ricevuto un trattamento BD. Le linee tratteggiate mostrano la sopravvivenza dei gruppi di trattamento che ricevono la concentrazione indicata di econazolo. Tutti gli animali trattati con nebulizzatore di cous allo 0,0025% per sei giorni sono risultati BD negativi quattro settimane dopo la fine del trattamento e quindi questo trattamento è stato considerato efficace.

Inoltre, questo dosaggio del trattamento con econazolo non differiva significativamente in termini di mortalità rispetto ai controlli BD positivi. Si noti che i trattamenti con econazolo allo 0,01% e 0,005% per 11 giorni hanno determinato un aumento significativo della mortalità rispetto ai controlli BD positivi. Non dimenticare che l'agente patogeno fungino BD è un rischio biologico precauzioni come indossare e cambiare i guanti, l'autoclave, tutti i rifiuti solidi e la disinfezione.

Tutti i rifiuti liquidi devono essere eseguiti quando si segue questa procedura.