In Misure Vivo elettrofisiologici sui nervi mouse sciatico

L'obiettivo generale di questo metodo è determinare le principali proprietà di conduzione nervosa nei nervi SCIC di topi vivi. Il topo da sottoporre al test viene posizionato in posizione prona. Si tenga presente che è necessario conoscere l'anatomia del nervo SCIC, qui indicato in blu; gli elettrodi di rilevamento, indicati in nero, vengono posizionati in corrispondenza del diametro massimo del muscolo gastrocnemio.

L'elettrodo di riferimento indicato in rosso viene semplicemente posizionato al di sotto degli elettrodi sensori. Ora è necessario segnare il punto di stimolazione distale. Abbiamo scelto arbitrariamente una distanza definita e costante di quattro millimetri.

Il punto di stimolazione prossimale si trova a una distanza di 16 millimetri dall'elettrodo di rilevamento. Ciò significa che tra i punti di stimolazione prossimale e distale del nervo STIC è presente un intervallo esattamente di 12 millimetri. La stimolazione mediante elettrodi a ago viene eseguita successivamente prima nel sito di stimolazione prossimale e poi nella posizione di stimolazione distale.

Ciao, mi chiamo Alexander Schultz. Lavoro presso l'Ance Institute for H Research di Gina, Germania, sotto la supervisione della dottoressa Helen Morrison. In collaborazione con il professor Reinhard Power dell'Istituto di Biologia Molecolare delle Cellule dell'Ospedale Universitario di Gina, abbiamo sviluppato un metodo che ci permette di effettuare misurazioni elettrofisiologiche sui nervi sky di topi vivi.

Queste registrazioni sono uno strumento potente utilizzato per caratterizzare modelli murini di malattie neuromuscolari. Cominciamo dunque. Questa è l'attrezzatura necessaria per effettuare le misurazioni.

Tre elettrodi aghiformi per le registrazioni ECG. Un elettrodo aghiforme per la stimolazione, elettrodi ad anello per il rilevamento e un capello di riferimento, rimuovere la crema, un rasoio elettrico, una piastra riscaldante con controllo a retroazione, una sonda termica Recal, un supporto per mouse per l'anestesia e gel di contatto. I topi vengono anestetizzati mediante inalazione continua di isoflurano per l'induzione dell'anestesia.

Abbiamo somministrato il 3% di isoflurano in ossigeno al cento percento. Successivamente, durante le misurazioni, è sufficiente utilizzare il 2% di isoflurano in ossigeno al cento percento. Per ridurre la resistenza cutanea durante le misurazioni, rimuoviamo completamente il pelo dagli arti posteriori dei topi sottoposti a test.

Questo viene ottenuto con un rasoio elettrico. Inoltre, utilizziamo una crema depilatoria disponibile in commercio. Alla fine, la crema viene completamente rimossa e la pelle viene pulita utilizzando etanolo al 70%.

Nel passaggio successivo, posizioniamo tre elettrodi per la registrazione dell'ECG: un elettrodo sotto la cute di ciascuna zampa posteriore e un elettrodo sotto la cute nella regione del collo. Registrare l'ECG durante le misurazioni consente il monitoraggio di almeno un parametro vitale. Entrambe le zampe posteriori vengono fissate al supporto mediante nastro adesivo, dopo un posizionamento approssimativo degli elettrodi ad anello.

Per una conduttività del segnale ottimale, utilizziamo un gel conduttivo che riduce la resistenza di trasferimento tra la pelle e gli elettrodi ad anello. Gli elettrodi sensori indicati in nero vengono posizionati nel punto in cui il muscolo gastrocnemio presenta il diametro massimo. Gli elettrodi di riferimento indicati in rosso vengono posizionati appena al di sotto degli elettrodi sensori.

Quindi vengono definite e segnate le posizioni esatte per la stimolazione del nervo sciatico, a una distanza di quattro millimetri dagli elettrodi di rilevamento. La stimolazione distale avverrà a una distanza di 16 millimetri dagli elettrodi di rilevamento. La stimolazione prossimale verrà effettuata qui.

Qui si vede l'interfaccia utente di un programma per l'acquisizione e l'analisi dei dati. Nella prima riga, viene visualizzato il tracciato dell'ECG. Nella seconda riga.

È possibile osservare gli impulsi ripetitivi provenienti dallo stimolatore. Nella terza riga, i segnali di risposta rilevati dall'elettrodo di rilevamento appariranno con una frequenza di campionamento di 50 chilohertz. Ora possiamo iniziare le registrazioni effettive.

L'ago di stimolazione viene innanzitutto inserito nella posizione di stimolazione prossimale. La corretta posizione dell'ago, o più specificamente, la corretta stimolazione del nervo STIC, può essere monitorata attraverso un'adeguata risposta muscolare a valle del nervo STIC. Nell'area degli elettrodi di rilevamento, i segnali rilevati dagli elettrodi di rilevamento vengono visualizzati nell'interfaccia utente.

Contemporaneamente, si prega di ottenere curve di risposta biphasiche chiare con un'ampiezza massima costante. Successivamente, la stimolazione distale viene eseguita nello stesso modo. Nell'angolo superiore sinistro, è possibile osservare le registrazioni simultanee provenienti dagli elettrodi fissi nell'interfaccia utente.

Nella riga superiore, si vede un'immagine rappresentativa di un singolo impulso a onda quadra della durata di 0,1 millisecondi, che viene applicato dagli elettrodi aghi di stimolazione ogni 200 millisecondi; nella riga inferiore, è mostrata la corrispondente curva di risposta neuromuscolare. L'analisi dei dati comprende la determinazione della latenza e dell'ampiezza dei segnali registrati. A tale scopo, si raccomanda di mediare più curve di risposta provenienti da un unico sito di stimolazione.

La latenza del segnale è il tempo compreso tra l'inizio della stimolazione e l'inizio della curva di risposta. O più precisamente, il punto di flesso della curva. La differenza temporale tra le latenze successive alla stimolazione prossimale e distale può ora essere utilizzata per calcolare la velocità di conduzione nervosa. A tale scopo, è necessario conoscere anche la distanza spaziale tra la stimolazione prossimale e distale; nel nostro caso, 12 millimetri.

Inoltre, l'ampiezza della curva di risposta può essere quantificata al fine di determinare il cosiddetto potenziale d'azione motorio composto. Esso rappresenta l'entità compresa tra i punti massimi di inversione positiva e negativa del segnale. Per alcune applicazioni, può risultare utile misurare anche la durata dell'ampiezza del segnale, che si estende dal primo punto di flesso all'ultimo della curva di risposta.

La velocità di conduzione nervosa dipende fortemente dalla rapida propagazione del segnale resa possibile dalla mielinizzazione. Pertanto, le malattie demielinizzanti in genere presentano velocità di conduzione ridotte. Il potenziale d'azione motorio composto, correlato al numero di assoni funzionali e di giunzioni neuromuscolari, rappresenta un indicatore di danno assonale quando è significativamente ridotto.

Abbiamo appena mostrato un metodo semplice e affidabile per determinare le principali proprietà di conduzione nervosa nei topi. Quando si esegue questa procedura, è di fondamentale importanza ridurre la resistenza cutanea mediante la completa rimozione dei peli e la pulizia della pelle. In questo modo si otterranno segnali con un rapporto segnale-rumore ottimale.

Inoltre, è importante identificare la risposta massima allo stimolo per un'acquisizione dati appropriata. Questo può essere ottenuto mediante un movimento delicato dell'ago di stimolazione in modo da poter rilevare curve di risposta bifasiche. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.